CN105400761A

CN105400761A - 一种低分子量纤溶酶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105400761A
Application number: CN201510685728.7A
Authority: CN
Inventors: 彭继先; 邓学鹏; 郑泉鸿; 杨群峰
Original assignee: SHANDONG RUIYING PIONEER PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Shandong Ruiying Pharmaceutical Group Co ltd
Priority date: 2015-10-21
Filing date: 2015-10-21
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2035-10-21
Also published as: CN105400761B

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，特别公开了一种低分子量纤溶酶及其制备方法和应用。本发明中利用硫酸铵盐析、柱层析等技术对枯草芽孢杆菌发酵液中的蛋白酶进行分离；蛋白质电泳显示分离的蛋白质是一组分子量低于20kDa的组分；纤维蛋白平板法及体内外活性实验证明该低分子量纤溶酶可直接降解纤维蛋白，产生溶栓活性。加入胰蛋白酶不影响其活性；利用肽指纹图谱法与蛋白质N-末端分析技术对该低分子量组分进行鉴定，表明其为一组具有序列表SEQ？ID？NO：1-5所示的氨基酸序列组成的多肽。本发明提供的具有溶栓活性纤溶酶分子量小、活性强、不被胰蛋白酶降解，其在保健食品、溶栓药物开发等领域具有广阔开发前景。

Description

一种低分子量纤溶酶及其制备方法和应用

（一）技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种低分子量纤溶酶及其制备方法和应用。

（二）背景技术

血栓类疾病是当今致死率、致残率最高的疾病之一，其比率远高于癌症，且随着我国老龄化的趋势将日益严重。据统计，全世界25%的死亡是由心脑血管类血栓疾病造成的，占因病死亡人数的40.7%，存活的患者中75%致残，有约40%为重度残疾。随着我国老龄化问题的加剧及生活***的影响也日益突出。目前，新型溶栓药物的开发和血栓类疾病的预防与临床治疗已成为医药学界的研究热点。研究发现，来源于枯草芽孢杆菌的具有溶栓活性蛋白酶(纳豆激酶)及其同工酶在保健食品、溶栓及抗老年痴呆等药物开发领域有着广阔的应用前景。纳豆激酶有275个氨基酸残基组成，其等电点为8.7。与枯草杆菌蛋白酶E（subtilisinE）有99.5%的序列同源性，与枯草杆菌蛋白酶BPN（subtilisinBPN）有86%的序列同源性。研究发现，纳豆激酶可以作为口服溶栓生物制品的活性成分，被肠道吸收而水解体内的血栓块，进一步研究发现其还可以作用于其它参与血液溶解与凝固的关键因子，从而通过不同的途径来改善血液循环***。

本发明首次从海洋微生物发酵液中提取了一组低分子量具有纤溶活性的蛋白水解酶，并提供了一种可以规模化制备高活性纤溶酶的方法。低分子量高活性的纤溶酶在溶栓相关生物制品领域具有更加广阔的应用前景。本发明为低分子量枯草芽孢杆菌蛋白酶的应用开发奠定基础。

（三）发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种分子量小、活性强、不被胰蛋白酶降解的低分子量纤溶酶及其制备方法和应用。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种低分子量纤溶酶，其特征在于：是一组序列如下所示的氨基酸序列组成的蛋白质或多肽；组分Ⅰ的序列为AQSVPYGISQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLNVRGGASFVPSETNPYQDGSSHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGIEWAISNNMGVINMSLGGPSGSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAAGNEGSSGSSSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSNQR，组分Ⅱ的序列为GYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLNVRGGASFVPSETNPYQDGSSHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGIEWAISNNMGVINMSLGGPSGSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAAGNEGSSGSSSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSNQR，组分Ⅲ的序列为AAGNEGSSGSSSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSNQRASFSSAGSELDVMAPGVSIQSTLPGGTYGAYNGT，组分Ⅳ的序列为SMATPHVAGAAALILSKHPTWTNAQVRDRLESTATYLGNSFYYGKGLINVQAAAQ，组分Ⅴ的序列为ATPHVAGAAALILSKHPTWTNAQVRDRLESTATYLGNSFYYGKGLINVQAAAQ。

所述蛋白质或多肽的分子量小于20kDa。

本发明利用质谱分析技术确认了五个主要片段的氨基酸序列组成，活性研究表明它们具有的体内外溶栓活性，提示其降解后的片段依旧保持了溶栓必须的空间结构；该降解产物组分具有分子量低，活性高的特点，提示该活性组分在调节血液循环及溶栓生物制品的应用中具有广阔的开发价值。

本发明所述的低分子量纤溶酶的制备方法，以枯草芽孢杆菌为菌种，包括如下步骤：

（1）利用LB液体培养基将菌种过夜活化，按重量分数1%的接种量将过夜活化的菌种接种到液体发酵培养基中发酵，发酵液离心后收集上清液；

（2）在搅拌条件下，往上清液中缓慢加入硫酸铵至饱和度，4℃条件下静置过夜，离心收集蛋白沉淀，即获得粗酶；

（3）将粗酶用截留分子量是3500Da的透析袋透析到pH5.6的磷酸盐缓冲液中，将透析后的粗酶液经阳离子交换层析，收集活性峰，经冷冻干燥得到产品。

本发明的优选技术方案为：

步骤（1）中，所述液体发酵温度为37℃，发酵时间为2-3天，摇床转速为180rpm，液体培养基含有麦芽糖、蛋白胨和无机盐。

步骤（1）中，所述发酵液在4℃下，4,000×g离心30min后，除去菌体沉淀，收集上清液。

步骤（2）中，以4,000×g离心30min，收集蛋白沉淀。

步骤（3）中，使用CM-SepharoseFF或SP-SepharoseFF进行阳离子交换层析，用1mol/L氯化钠溶液洗脱，收集活性峰，得到产品。

本发明所述的低分子量纤溶酶的应用，其特征在于：用于制备溶栓药物、保健食品生物制剂。利用纤维蛋白平板法检测，发现该低分子活性组分具有很强的溶栓活性，优于同剂量的临床药物尿激酶；在体内的溶栓实验中，也表现出优于同剂量的临床药物尿激酶。

所述溶栓药物、保健食品生物制剂的有效剂型为注射剂或口服剂。

本发明产品分子量小，活性强，不被胰蛋白酶降解，制备简单，生产成本低，在其保健食品、溶栓药物开发等领域具有广阔开发前景。

（四）附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为本发明纯化后低分子量纤溶酶的Tricine-SDS-PAGE电泳图；

图2为本发明温度对纤溶酶活性的影响示意图；

图3为本发明pH值对纤溶酶活性的影响示意图。

（五）具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容。应当指出，这些实施例仅用来对本发明的内容进行具体描述，但本发明的技术方案并不局限于此。

实施例1：低分子量纤溶酶的制备

低分子量纤溶酶是海洋来源的枯草芽孢杆菌经发酵培养分泌到培养液中，经硫酸铵盐析进行初步提取，阳离子交换树脂进行纯化得到的。具体过程如下：

（1）发酵培养

菌种活化：利用LB液体培养基（1.0%胰蛋白胨（w/v），1.0%的氯化钠（w/v），0.5%酵母粉（w/v），用去离子水配置，121℃高温灭菌20min。）将菌种过夜活化。

发酵培养：将过夜活化菌种，按照1：100的比例接种到发酵培养基中（2%蛋白胨，1%麦芽糖，0.05%MgSO₄，0.02%CaCl₂，0.4%KH₂PO₄，1MHCl调pH=7.0,121℃高压湿热灭菌30min）。37℃、180rpm，培养2-3天，离心收集发酵液，离心条件为4,000×g，离心30min，制得发酵上清液。

（2）低分子量纤溶酶的纯化

发酵上清液在低速搅拌的条件下，缓慢加入硫酸铵至60%饱和度。4℃静置过夜，以4,000×g离心30min，收集蛋白沉淀。盐析后的蛋白沉淀透析到pH5.6、20mM的醋酸钠缓冲液中（离子交换层析的上样缓冲液），4℃，透析过夜。透析后的样品上样到已平衡好的离子交换层析介质上（CM-sepharose弱阳离子交换介质）。上样后用2倍柱体积的平衡缓冲液冲洗未结合的杂蛋白。之后进行盐离子浓度梯度洗脱。洗脱条件：A液为平衡缓冲液，B液为在A液中加500mMNaCl。线性梯度洗脱（B液从0到100%），洗脱体积为5倍柱体积，透析除盐后进行冷冻干燥。纯化得到的活性组分Tricine-SDS-PAGE电泳结果见图1，电泳图谱中1-4分别代表收集的目标峰的不同位置。结果显示：5个组分的分子量均在20kDa以下，按分子量从大到小依次命名为1、2、3、4、5。

实施例2：低分子量活性组分的确认

为深入研究该活性组分，首先利用肽指纹图谱对五个低分子量组分片段进行了肽指纹图谱鉴定。具体过程如下：

将低分子活性组分经过Tricine-SDSPAGE切胶回收。利用胶内酶解及Ziptip脱盐将条带切碎后转入EP管中，加入5μL2.5-10ng/μL测序级Trypsin(Promega)溶液，37℃反应过夜，吸出酶解液，转移至新EP管中，用Ziptip（millipore）进行脱盐。冻干后的酶解样品，取2μL、20%乙腈复溶。取1μL溶解样品，直接点于样品靶上，让溶剂自然干燥后，再取0.5μL过饱和CHCA基质溶液（溶剂为50%ACN0.1%TFA）点至对应靶位上并自然干燥。样品靶经氮气吹净后放入仪器进靶槽并用串联飞行时间质谱仪(5800MALDI-TOF/TOF,ABSCIEX)进行测试分析。如前所述，不同枯草芽孢杆菌来源的蛋白酶的序列保守性比较高。经鉴定，本实验室所保存的菌种也是一株枯草芽孢杆菌，所以本研究以溶栓活性高的纳豆激酶作为搜索模板进行覆盖度测定。

在此基础上，对该样品的四个主要蛋白组分进行了N-末端分析（Edman法）。低分子量纤溶酶样品经Tricine-SDSPAGE，转PVDF膜之后经过丽春红染色。切胶进行蛋白质N-末端检测分析。经过N-末端测试后，各个组分的鉴定结果下表所示。

实施例3：低分子量纤溶酶酶学性质研究

（1）温度对酶活性的影响

取纤溶酶冻干粉，用生理盐水稀释至一定浓度，分别于25、30、37、42、50、60、70、80℃下孵育1小时，之后以酪蛋白为底物进行反应测定酶活。

在试管中加入1.9mL、0.05mol/L硼酸盐缓冲液配制的0.5%酪蛋白溶液，在37±0.3℃中水浴5min；准确计时10min后，加入0.1mL发酵上清液，混合5s，37±0.3℃水浴，在反应开始后的20min、40min各混合5s，准确计时60min，加入2mL、0.2mol/L的TCA终止反应，混合，继续在37±0.3℃水浴20min；转移混合体系在离心管中15000rpm离心5min，测定275nm吸光度（AT）。空白对照测定在试管中加入1.9mL、0.05mol/L硼酸盐缓冲液配制的0.5%酪蛋白溶液，在37±0.3℃水浴5min，准确计时10min后，加入2ml0.2mol/LTCA混合5s加入0.1mL样品，混合5s，在37±0.3℃水浴20min，转移混合体系在离心管中15000rpm离心5min，测定275nm吸光度（AB）。酶活力单位定义：在规定的实验条件下，以每分钟增加0.01吸光度定义为一个酶活力单位，使用下列公式计算酶活力：

U=（AT-AB）/0.1/60/0.01*D（稀释倍数）。

结果显示：不同温度对酶活力的影响如图2所示，超过40℃，随着温度的升高，酶活力迅速下降，该纤溶酶可以耐受的温度为40℃。

（2）pH值对酶活性的影响

取纤溶酶冻干粉，分别用pH5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解至一定浓度，以酪蛋白为底物进行反应测定酶活。

结果显示：不同pH对酶活力的影响如图3所示，随着pH的升高，酶活力随之增大，但pH为8.0时，酶活力略有下降，纤溶酶的最适pH为7.0。

（3）胰蛋白酶对酶活性的影响

取胰蛋白酶干粉用pH7.0磷酸盐缓冲液稀释至0.25mg/ml，按低分子纤溶酶酶活测定方法测定275nm的吸光度。再取纤溶酶冻干粉，用pH7.0磷酸盐缓冲液稀释至一定浓度，测定275nm的吸光度。另外，上述纤溶酶溶液中加入0.25mg/ml的胰蛋白酶干粉，混合均匀后，测定275nm的吸光度。

结果显示：胰蛋白酶对纤溶酶活性的影响如下表所示，同时加入胰酶和纤溶酶降解酪蛋白，测定的吸光度差值基本等于分别加入胰蛋白酶和纤溶酶测定的吸光度差值之和，可认为胰蛋白酶的加入不影响纤溶酶的活性。下表为胰蛋白酶对低分子纤溶酶活性的影响。

实施例4：低分子量纤溶酶降解纤维蛋白

采用纤维蛋白平板法对低分子活性组分进行活性测定。具体的测定步骤如下：取0.2g琼脂糖加入1×PBS（pH7.4）20ml加热溶解后，冷却到50℃左右，加入1ml1.36%的纤维蛋白原，混合均匀后再加入10μ、l2U/μl凝血酶，再次混合均匀倒入已经灭菌玻璃平皿，静置数分钟，待平板中的溶液凝固，纤维蛋白原平板已经制成。在做好的平板上用牛津杯打孔，每个孔加入50μl样品，其中1、2、3号孔分别加入80，12，3.6μg/mL的本实验室制备的溶栓酶样品，37℃孵育过夜，观察平板的水解圈并记录数据。本实验以临床药物尿激酶作为阳性对照（南京南大药业有限责任公司）。

结果显示：纤溶酶水解纤维蛋白平板透明圈的大小与其浓度呈正相关，12μg/mL纤溶酶与80μg/mL的尿激酶的水解圈大小相近（见图3），显示该纤溶酶的活性约为同浓度尿激酶活性的7倍。

实施例5：低分子量纤溶酶体内溶栓研究

取SD大鼠30只，体重200-300g，随机分为5组，每组6只，分别设置为生理盐水空白对照组、尿激酶组（5mg·kg^-1）、低分子量纤溶酶组口服和注射给药组（1mg·kg^-1），实验前禁食不禁水12h将动物以10％水合氯醛（2.5mL·kg^-1）麻醉，手术分离左侧颈总动脉，隔离血管和周围组织，使用小动物血栓形成仪进行电刺激，致使栓塞率达到100%并稳定保持20秒，然后从股静脉注射相应的药物溶液，2min输完。另取低分子纤溶酶0.5mL，从直肠注射给药，模拟口服给药。自刺激结束之时起，40min后剪取血栓段血管，称量湿重，烘干后称干重。

结果显示：与空白组相比，低分子量纤溶酶组和阳性药尿激酶组使血栓重量显著下降(P<0.05)，且剂量与效应呈明显剂量依赖关系（见下表），1mg﹒kg^-1纤溶酶组与5mg﹒kg^-1尿激酶组血栓重量无显著差异，溶栓效果相当。1mg﹒kg^-1口服纤溶酶组血栓重量略高于注射组，但无显著差异，可能由于口服吸收时间较长所致。

低分子量纤溶酶对大鼠动静脉旁路血栓栓塞的影响（±SD）

其中，n=6,^*P<0.05vs.生理盐水组。

Claims

1.一种低分子量纤溶酶，其特征在于：是一组序列如下所示的氨基酸序列组成的蛋白质或多肽；组分Ⅰ的序列为AQSVPYGISQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLNVRGGASFVPSETNPYQDGSSHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGIEWAISNNMGVINMSLGGPSGSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAAGNEGSSGSSSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSNQR，组分Ⅱ的序列为GYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLNVRGGASFVPSETNPYQDGSSHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGIEWAISNNMGVINMSLGGPSGSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAAGNEGSSGSSSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSNQR，组分Ⅲ的序列为AAGNEGSSGSSSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSNQRASFSSAGSELDVMAPGVSIQSTLPGGTYGAYNGT，组分Ⅳ的序列为SMATPHVAGAAALILSKHPTWTNAQVRDRLESTATYLGNSFYYGKGLINVQAAAQ，组分Ⅴ的序列为ATPHVAGAAALILSKHPTWTNAQVRDRLESTATYLGNSFYYGKGLINVQAAAQ。

2.根据权利要求1所述的低分子量纤溶酶，其特征在于：所述蛋白质或多肽的分子量小于20kDa。

3.根据权利要求1所述的低分子量纤溶酶的制备方法，以枯草芽孢杆菌为菌种，其特征为，包括如下步骤：（1）利用LB液体培养基将菌种过夜活化，按重量分数1%的接种量将过夜活化的菌种接种到液体发酵培养基中发酵，发酵液离心后收集上清液；（2）在搅拌条件下，往上清液中缓慢加入硫酸铵至饱和度，4℃条件下静置过夜，离心收集蛋白沉淀，即获得粗酶；（3）将粗酶用截留分子量是3500Da的透析袋透析到pH5.6的磷酸盐缓冲液中，将透析后的粗酶液经阳离子交换层析，收集活性峰，经冷冻干燥得到产品。

4.根据权利要求3所述的低分子量纤溶酶的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述液体发酵温度为37℃，发酵时间为2-3天，摇床转速为180rpm，液体培养基含有麦芽糖、蛋白胨和无机盐。

5.根据权利要求3所述的低分子量纤溶酶的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述发酵液在4℃下，4,000×g离心30min后，除去菌体沉淀，收集上清液。

6.根据权利要求3所述的低分子量纤溶酶的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，以4,000×g离心30min，收集蛋白沉淀。

7.根据权利要求3所述的低分子量纤溶酶的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，使用CM-SepharoseFF或SP-SepharoseFF进行阳离子交换层析，用1mol/L氯化钠溶液洗脱，收集活性峰，得到产品。

8.根据权利要求1所述的低分子量纤溶酶的应用，其特征在于：用于制备溶栓药物、保健食品生物制剂。

9.根据权利要求8所述的低分子量纤溶酶的应用，其特征所述，所述溶栓药物、保健食品生物制剂的有效剂型为注射剂或口服剂。