CN105385739A - －种从金边蚂蟥中制取蛋白肽的方法 - Google Patents
－种从金边蚂蟥中制取蛋白肽的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105385739A CN105385739A CN201510908591.7A CN201510908591A CN105385739A CN 105385739 A CN105385739 A CN 105385739A CN 201510908591 A CN201510908591 A CN 201510908591A CN 105385739 A CN105385739 A CN 105385739A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- leech
- solution
- ultrafiltration
- filtration
- microwave
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法。一种从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，包括以下步骤：消毒、磨浆、粗滤、微滤、超滤、碱溶、微波处理、离心、沉析、脱色、酶解、沉析、微滤、超滤、纳滤、浓缩和喷雾干燥。本发明提供用物理方法替代化学法分离酸性多肽，获得酸性多肽粗品，可作复配含酸性多肽的中成药或作纯化酸性多肽的前提物，分离率高，能很好保护其活性，无污染产生，达到清洁生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种从金边蚂蟥中制取蛋白肽的方法。
背景技术
水蛭又名蚂蟥，属环节动物蛭纲，体表无刚毛，前后端均有吸盘，体肌发达，体腔较小，属高度特化的环节动物。据报道，世界上的蚂蟥超过500种，按食性分为吸血和非吸血两大类，蚂蟥绝大部分生活在淡水中，咸水和咸淡水交汇处也有发现，也有少数生活在陆上，如吸血的山蚂蟥就生活在山区的潮湿灌木林和草丛中，在国内，个体较大的是宽体金线蛭，体长达30cm，重达40g，但最近在云南的瑞丽山区发现一种外表似金边蚂蟥，体重达150g，个体最小是寡蛭只有0.1g。
水蛭依据其食性不同，可分为非吸血水蛭和吸血水蛭两大类：
非吸血水蛭，它主要以田螺、福寿螺、河蚌等软体动物的汁液为食，不吸血，主产于长江沿岸省份(如湖北、江苏等)的河流、湖泊。常见的是宽体金线蛭(WhitmanpigraWhitman)，它是我国药材市场上的主流品种，其体内含有目前尚未清楚的某些活血化瘀成分，但不含水蛭素。
吸血水蛭，主要分布在我国华南的广东、广西等省区，生活在稻田、水沟、江河、池塘和湖泊中，以吸食人和脊椎动物血液为生，其中较为常见的是菲牛蛭(PoecilobdellaManillensisLesson，俗称金边蚂蟥，它已被广西壮族自治区食品药品监督管理局收录入《广西壮族自治区壮药质量标准》第二卷(2011年版)。科学研究表明，由吸血水蛭的唾液腺及其所分泌的唾液中含有丰富的水蛭素hirudin、透明质酸酶Orgelase以及血管扩张剂Vasolilator和麻醉剂Anaesthetic等多种生物活性物质，其中水蛭素是这些活性物质中数量最多、活性最显著并且研究得最多、最深入、最有药用价值和最具发展潜力的一种活性物质。
天然水蛭素自分离出纯品后，于20世纪70-80年代，便对其理化性质和化学结构进行了深入研究，研究结果表明，水蛭素是由65-66个氨基酸残基组成的多肽物，分子量为7000Da·N端有3个二硫桥，由6个半胱氨组成，使N端肽链绕迭成环肽结构，C端富含酸性氨基酸残基，具亲水性，游离于分子表面，肽链中部还有一个由Pro-Lys47-Pro(脯氨酸-赖氨酸)组成的特殊序列，在C端最后9个氨基酸残基中有5个是酸性氨基酸，故又称酸性多肽，此外居于63位的酪氨酸被硫酸化了。天然水蛭素的成份和结构序列弄清楚后，便开始对人工重组水蛭素进行近10年的研究，得到产品与天然水蛭素极其相似，仅居于序列中63位的酪氨酸未能硫酸化，产品应用时其抑制凝血酶的活性较低和引起出血的及单靶点等缺陷，使用范围窄、副作用大、成本高等，因而应用受到极大限制。
有研究表明，水蛭素主要存在于吸血蚂蟥的唾液腺和唾液中，不吸血的蚂蟥唾液腺和唾液中均检不出水蛭素成份。在吸血的蚂蟥中不同的品种，不同地区，个体大小，野生和养殖蚂蟥的采收期等因素均对水蛭素含量产生影响。目前，发现产于广东、广西、海南、云南等省的北纬线21-23°一个狭长地带的野生金边蚂蟥(俗称牛蚂蟥)的水蛭素含量较高，越冬后捕捉的最高含量达到1200ATU/g(整条干燥品的干基计)，2015年5月底在广西北部湾捕捉的水蛭素含量亦达到1020ATU/g。
常规提取水蛭素的方法是将活吸血水蛭或冰鲜蛭解冻后，剪下头部或全体磨浆，用乙醇分级沉析或用丙酮做萃取剂，获得水蛭素粗制品溶液，然后采用层析法、等电聚焦等工序纯化，得到水蛭素。这些工艺方法均未涉及提取水蛭素后，大量蛋白质的利用，且常规方法，使用大量溶剂，其污染性和安全性的控制存在一定风险。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种从金边蚂蟥中制取蛋白肽的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，包括如下步骤：
(1)先用清水冲洗鲜蚂蟥或解冻蚂蟥体表的污染物，然后移入浓度为3‰高锰酸钾溶液中，搅拌浸泡10-15min；捞起后用清水洗掉高锰酸钾溶液，再将其移入浓度为5％氯化钠溶液中搅拌浸泡10min，捞起后用清水洗去其体表的盐份，再用去离子水冲洗1次，沥去水分，置于容器内；
(2)将蚂蟥体表消毒灭菌后，按蚂蟥重量计算，加入3‰亚硫酸氢钠，1‰抗坏血酸和3倍去离子水拌匀，投入胶体磨中研磨，研磨温度控制在小于50℃，得到蚂蟥浆液；
(3)将步骤(2)所得的蚂蟥浆液进行2次粗滤，合并2次粗滤的滤渣和滤液；
(4)将步骤(3)所得滤液用可拦截分子量30000Da的30000膜进行微滤，收集微滤透过液；
(5)将微滤透过液进行2次超滤，第1次超滤选用10000膜；浓缩液加入上述粗滤渣中，透过液进行第2次超滤，选用5000膜；透过溶液并入前述之滤渣中，所得浓液即为富集含水蛭素溶液；
(6)把粗滤渣和微滤浓缩液及超滤1浓液、超滤2之透液，调pH值为9，投入有搅拌装置，功率2-10KW的微波罐中，用2KW功率微波升温，控控温小于60℃，微波20min，在55-60℃保温20min，排出冷却；
(7)将步骤(6)排出的溶液冷至45℃，用200目滤布三足离心机过滤，积累于滤布的滤渣用无离子水适量喷淋，所得滤液即为蚂蟥蛋白溶液；
(8)将步骤(7)所得蚂蟥蛋白溶液，先用稀盐酸调pH值至6，然后再用10％冰醋酸溶解2％的壳聚糖溶液调pH值至5，将蛋白沉析出来，静置1-2h，待溶液分层后弃去上层液再用400目滤布离心过滤，得湿蛋白，加入2-3倍于湿蛋白量0.75％高锰酸钾溶液在35-45℃温度下浸泡1.5-2h，然后用400目尼龙滤布脱去高锰酸钾并用清水冲洗1次，用2-3倍于湿渣的0.75％草酸溶液浸泡2-3h，观察蛋白颜色为白色时，即开始收集脱色蛋白；
(9)将脱色的湿蛋白用无离子水稀释，待蛋白质浓度达到7％时，调pH值为9，加入底物质量3％的碱性酶搅拌均匀，置于带搅拌装置功率2-10KW微波罐中，启动2KW功率，当酶解液升温到45℃时检测酶解液pH值，当pH值下降至7.5以上8以下时，补碱调至8.5，酶解液升温至55℃再检1次pH值，当pH下降不到7.8以下不再补碱，下降至7.8以下时补碱调至8，酶解液温度达到55℃时停止微波保留搅拌，待温度下降低于50℃后再启动2KW功率微波待酶解液升温至55℃，关掉微波保留搅拌，待酶解液温度下降至45℃以下时检测酶解液pH值，当pH低于8时补碱调至8，添加底物质量2.5％的胰酶，启动2KW微波，酶解液升温至50℃时，检查酶解液pH值，当pH下降低于或接近7时，补碱调至7.8，继续微波升温至55℃关掉微波，再检测pH，当pH下降至7.3以下补碱调至7.5，启动搅拌，待酶解液温度下降至45℃再启动微功率2KW，酶解液升温至55℃，保温5分钟后，启动功率10KW升温至85-90℃，保温10分钟灭酶活；
(10)将灭酶活后的酶解液排出，冷却至40℃，在搅拌状态下，缓慢添加用含20％冰醋酸溶解1.5％的壳聚糖溶液，使pH值调至5，沉析未酶解的蛋白及其他大分子杂质等，沉析液静置2小时，用400目滤布离心除去的沉析物即为蚂蟥蛋白，离心时先过滤上层液后过滤浓液；
(11)将400目过滤所得的滤液，再用30000膜进行微滤；浓液合并入上述400目粗滤渣中；
(12)步骤(11)所得微滤透过液进行2次超滤，第1次超滤用10000膜，第2次超滤用5000膜，两次超滤的浓缩液合并进粗滤渣中；
(13)将步骤(12)中超滤2所得透过液进行钠滤；
(14)将步骤(13)中纳滤所得浓缩液，选用喷雾干燥法干燥，获得多肽；将步骤(10)的滤渣，步骤(11)微滤之浓液、步骤(12)超滤之浓液合并选用喷雾干燥法干燥，获得蚂蟥蛋白粉。
本发明的技术方案中，步骤(2)中所得蚂蟥浆液的细度为18-20目。
本发明的技术方案中，步骤(3)中所述的2次粗滤的具体操作为：第1次粗滤用60-80目滤布在三足离心机过滤，积累于滤布的滤渣用适量无离子水喷淋1-2次；第2次粗滤用200目在三足离机过滤，积累于滤布的滤渣用适量无离子水喷淋1-2次。
本发明的技术方案中，步骤(4)中微滤的操作参数为：压泵0.05-0.3MPa、pH值6-7、温度40-50℃、膜面流量1-4M/S、浓缩比3-4倍。
本发明的技术方案中，步骤(5)中所述的第1次超滤的操作参数为：压泵0.1-0.43MPa、pH值5-6、温度40-50℃、膜面流速1-3M/S、浓缩比4-5倍；第2次超滤的操作参数为：压泵0.3-0.6MPa、pH值为5-6、温度40-50℃、膜面流量1-3M/S、浓缩比6-7倍。
本发明的技术方案中，步骤(9)中所述的碱性酶的酶活为10万u/g；胰酶的酶活>4000u/g。
本发明的技术方案中，步骤(11)中微滤的操作参数为：压泵0.05-0.3MPa、pH值6-7、温度40-50℃、膜面流速1-4M/S、浓缩比3-4倍。
本发明的技术方案中，步骤(12)中第1次超滤和第2次超滤的操作参数为：压泵0.2-0.4MPa、pH值5-6、温度40-50℃、膜面流速1-3M/S、浓缩比5-6倍。
本发明的技术方案中，步骤(13)中所述钠滤的操作参数为：压力0.7-0.9MPa，循环流量1.5-2.5m3/h，浓缩倍数7-9。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明提供用物理方法替代化学法分离酸性多肽，获得酸性多肽粗品，可作复配含酸性多肽的中成药或作纯化酸性多肽的前提物，分离率高，能很好保护其活性，无污染产生，达到清洁生产。
2.本发明的方法使用的金边蚂蟥含蛋白质极高，分离出酸性多肽后仍存在很高的蛋白质，将其进行酶解，获得以短肽为主体，只含少量游离氨基酸和小分蛋白的混合物，比未酶解的蛋白质吸收更多更快，生理功能更强。
3.本发明的方法除获得酸性多肽粗品，蚂蟥蛋白多肽混合物还得到蚂蟥蛋白粉，用于制取甲壳素的蚂蟥皮，使蚂蟥的开发利用达到初步综合利用。
附图说明
图1为本发明从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
一种从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，包括如下步骤：
(1)先用清水冲洗鲜蚂蟥或解冻蚂蟥体表的污染物，然后移入浓度为3‰高锰酸钾溶液中，搅拌浸泡10min；捞起后用清水洗掉高锰酸钾溶液，再将其移入浓度为5％氯化钠溶液中搅拌浸泡10min，捞起后用清水洗去其体表的盐份，再用去离子水冲洗1次，沥去水分，置于容器内；
(2)将蚂蟥体表消毒灭菌后，按蚂蟥重量计算，加入3‰亚硫酸氢钠，1‰抗坏血酸和3倍去离子水拌匀，投入胶体磨中研磨，研磨温度控制在小于50℃，得到蚂蟥浆液；所述的蚂蟥浆液的细度为18目；
(3)将步骤(2)所得的蚂蟥浆液进行2次粗滤，合并2次粗滤的滤渣和滤液；所述的2次粗滤的具体操作为：第1次粗滤用60目滤布在三足离心机过滤，积累于滤布的滤渣用适量无离子水喷淋1次；第2次粗滤用200目在三足离机过滤，积累于滤布的滤渣用适量无离子水喷淋1次；
(4)将步骤(3)所得滤液用可拦截分子量30000Da的30000膜进行微滤，收集微滤透过液；微滤的操作参数为：压泵0.05Mpa、pH值6、温度40℃、膜面流量1M/S、浓缩比3倍；
(5)将微滤透过液进行2次超滤，第1次超滤选用10000膜；浓缩液加入上述粗滤渣中，透过液进行第2次超滤，选用5000膜；透过溶液并入前述之滤渣中，所得浓液即为富集含水蛭素溶液；所述的第1次超滤的操作参数为：压泵0.1Mpa、pH值5、温度40℃、膜面流速1M/S、浓缩比4倍；第2次超滤的操作参数为：压泵0.3Mpa、pH值为5、温度40℃、膜面流量1M/S、浓缩比6倍；
(6)把粗滤渣和微滤透过液及超滤1浓液、超滤2之透液，调pH值为9，投入有搅拌装置，功率2KW的微波罐中，用2KW功率微波升温，控控温小于60℃，微波20min，在55℃保温20min，排出冷却；
(7)将步骤(6)排出的溶液冷至45℃，用200目滤布三足离心机过滤，积累于滤布的滤渣用无离子水适量喷淋，所得滤液即为蚂蟥蛋白溶液；
(8)将步骤(7)所得蚂蟥蛋白溶液，先用稀盐酸调pH值至6，然后再用10％冰醋酸溶解2％的壳聚糖溶液调pH值至5，将蛋白沉析出来，静置1h，待溶液分层后弃去上层液再用400目滤布离心过滤，得湿蛋白，加入2倍于湿蛋白量0.75％高锰酸钾溶液在35℃温度下浸泡1.5h，然后用400目尼龙滤布脱去高锰酸钾并用清水冲洗1次，用2倍于湿渣的0.75％草酸溶液浸泡2h，观察蛋白为白色时，即开始收集脱色蛋白；
(9)将脱色的湿蛋白用无离子水稀释，待蛋白质浓度达到7％时，调pH值为9，加入底物质量3％的碱性酶搅拌均匀，置于带搅拌装置功率2KW微波罐中，启动2KW功率，当酶解液升温到45℃时检测酶解液pH值，当pH值下降至7.5以下时，补碱液调至9，当pH值下降至7.5以上8以下时，补碱调至8.5，酶解液升温至55℃再检1次pH值，当pH下降不到7.8以下不再补碱，下降至7.8以下时补碱调至8，酶解液温度达到55℃时停止微波保留搅拌，待温度下降低于50℃后再启动2KW功率微波待酶解液升温至55℃，关掉微波保留搅拌，待酶解液温度下降至45℃以下时检测酶解液pH值，当pH低于8时补碱调至8，添加底物质量2.5％的胰酶，启动2KW微波，酶解液升温至50℃时，检查酶解液pH值，当pH下降低于或接近7时，补碱调至7.8，继续微波升温至55℃关掉微波，再检测pH，当pH下降至7.3以下补碱调至7.5，启动搅拌，待酶解液温度下降至45℃再启动微功率2KW，酶解液升温至55℃，保温5分钟后，启动功率10KW升温至85℃，保温10分钟灭酶活；所述的碱性酶的酶活为10万u/g；胰酶的酶活>4000u/g；
(10)将灭酶活后的酶解液排出，冷却至40℃，在搅拌状态下，缓慢添加用含20％冰醋酸溶解1.5％的壳聚糖溶液，使pH值调至5，沉析未酶解的蛋白及其他大分子杂质等，沉析液静置2小时，用400目滤布离心除去的沉析物即为蚂蟥蛋白，离心时先过滤上层液后过滤浓液；
(11)将400目过滤所得的滤液，再用30000膜进行微滤；浓液合并入上述400目粗滤渣中；微滤的操作参数为：压泵0.05Mpa、pH值6、温度40℃、膜面流速1M/S、浓缩比3倍；
(12)步骤(11)所得微滤透过液进行2次超滤，第1次超滤用10000膜，第2次超滤用5000膜，两次超滤的浓缩液合并进粗滤渣中；第1次超滤和第2次超滤的操作参数为：压泵0.2Mpa、pH值5、温度40℃、膜面流速1M/S、浓缩比5倍；
(13)将步骤(12)中超滤2所得透过液进行钠滤；所述钠滤的操作参数为：压力0.7Mpa，循环流量1.5m3/h，浓缩倍数7。
(14)将步骤(13)中纳滤所得浓缩液，选用喷雾干燥法干燥，获得多肽；将步骤(10)的滤渣，步骤(11)微滤之浓液、步骤(12)超滤之浓液合并选用喷雾干燥法干燥，获得蚂蟥蛋白粉。
实施例2：
一种从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，包括如下步骤：
(1)先用清水冲洗鲜蚂蟥或解冻蚂蟥体表的污染物，然后移入浓度为3‰高锰酸钾溶液中，搅拌浸泡15min；捞起后用清水洗掉高锰酸钾溶液，再将其移入浓度为5％氯化钠溶液中搅拌浸泡10min，捞起后用清水洗去其体表的盐份，再用去离子水冲洗1次，沥去水分，置于容器内；
(2)将蚂蟥体表消毒灭菌后，按蚂蟥重量计算，加入3‰亚硫酸氢钠，1‰抗坏血酸和3倍去离子水拌匀，投入胶体磨中研磨，研磨温度控制在小于50℃，得到蚂蟥浆液；所述的蚂蟥浆液的细度为20目；
(3)将步骤(2)所得的蚂蟥浆液进行2次粗滤，合并2次粗滤的滤渣和滤液；所述的2次粗滤的具体操作为：第1次粗滤用80目滤布在三足离心机过滤，积累于滤布的滤渣用适量无离子水喷淋2次；第2次粗滤用200目在三足离机过滤，积累于滤布的滤渣用适量无离子水喷淋2次；
(4)将步骤(3)所得滤液用可拦截分子量30000Da的30000膜进行微滤，收集微滤透过液；微滤的操作参数为：压泵0.3Mpa、pH值7、温度50℃、膜面流量4M/S、浓缩比4倍；
(5)将微滤透过液进行2次超滤，第1次超滤选用10000膜；浓缩液加入上述粗滤渣中，透过液进行第2次超滤，选用5000膜；透过溶液并入前述之滤渣中，所得浓液即为富集含水蛭素溶液；所述的第1次超滤的操作参数为：压泵0.43Mpa、pH值6、温度50℃、膜面流速3M/S、浓缩比5倍；第2次超滤的操作参数为：压泵0.6Mpa、pH值为6、温度50℃、膜面流量3M/S、浓缩比7倍；
(6)把粗滤渣和微滤透过液及超滤1浓液、超滤2之透液，调pH值为9，投入有搅拌装置，功率10KW的微波罐中，用2KW功率微波升温，控控温小于60℃，微波20min，在60℃保温20min，排出冷却；
(7)将步骤(6)排出的溶液冷至45℃，用200目滤布三足离心机过滤，积累于滤布的滤渣用无离子水适量喷淋，所得滤液即为蚂蟥蛋白溶液；
(8)将步骤(7)所得蚂蟥蛋白溶液，先用稀盐酸调pH值至6，然后再用10％冰醋酸溶解2％的壳聚糖溶液调pH值至5，将蛋白沉析出来，静置2h，待溶液分层后弃去上层液再用400目滤布离心过滤，得湿蛋白，加入3倍于湿蛋白量0.75％高锰酸钾溶液在45℃温度下浸泡2h，然后用400目尼龙滤布脱去高锰酸钾并用清水冲洗1次，用3倍于湿渣的0.75％草酸溶液浸泡3h，观察蛋白为白色时，即开始收集脱色蛋白；
(9)将脱色的湿蛋白用无离子水稀释，待蛋白质浓度达到7％时，调pH值为9，加入底物质量3％的碱性酶搅拌均匀，置于带搅拌装置功率10KW微波罐中，启动2KW功率，当酶解液升温到45℃时检测酶解液pH值，当pH值下降至7.5以下时，补碱液调至9，当pH值下降至7.5以上8以下时，补碱调至8.5，酶解液升温至55℃再检1次pH值，当pH下降不到7.8以下不再补碱，下降至7.8以下时补碱调至8，酶解液温度达到55℃时停止微波保留搅拌，待温度下降低于50℃后再启动2KW功率微波待酶解液升温至55℃，关掉微波保留搅拌，待酶解液温度下降至45℃以下时检测酶解液pH值，当pH低于8时补碱调至8，添加底物质量2.5％的胰酶，启动2KW微波，酶解液升温至50℃时，检查酶解液pH值，当pH下降低于或接近7时，补碱调至7.8，继续微波升温至55℃关掉微波，再检测pH，当pH下降至7.3以下补碱调至7.5，启动搅拌，待酶解液温度下降至45℃再启动微功率2KW，酶解液升温至55℃，保温5分钟后，启动功率10KW升温至85-90℃，保温10分钟灭酶活；所述的碱性酶的酶活为10万u/g；胰酶的酶活>4000u/g；
(10)将灭酶活后的酶解液排出，冷却至40℃，在搅拌状态下，缓慢添加用含20％冰醋酸溶解1.5％的壳聚糖溶液，使pH值调至5，沉析未酶解的蛋白及其他大分子杂质等，沉析液静置2小时，用400目滤布离心除去的沉析物即为蚂蟥蛋白，离心时先过滤上层液后过滤浓液；
(11)将400目过滤所得的滤液，再用30000膜进行微滤；浓液合并入上述400目粗滤渣中；微滤的操作参数为：压泵0.3Mpa、pH值7、温度50℃、膜面流速4M/S、浓缩比4倍；
(12)步骤(11)所得微滤透过液进行2次超滤，第1次超滤用10000膜，第2次超滤用5000膜，两次超滤的浓缩液合并进粗滤渣中；第1次超滤和第2次超滤的操作参数为：压泵0.4Mpa、pH值6、温度50℃、膜面流速3M/S、浓缩比6倍；
(13)将步骤(12)中超滤2所得透过液进行钠滤；所述钠滤的操作参数为：压力0.9Mpa，循环流量2.5m3/h，浓缩倍数9。
(14)将步骤(13)中纳滤所得浓缩液，选用喷雾干燥法干燥，获得多肽；将步骤(10)的滤渣，步骤(11)微滤之浓液、步骤(12)超滤之浓液合并选用喷雾干燥法干燥，获得蚂蟥蛋白粉。
实施例3：
一种从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，包括如下步骤：
(1)先用清水冲洗鲜蚂蟥或解冻蚂蟥体表的污染物，然后移入浓度为3‰高锰酸钾溶液中，搅拌浸泡12min；捞起后用清水洗掉高锰酸钾溶液，再将其移入浓度为5％氯化钠溶液中搅拌浸泡10min，捞起后用清水洗去其体表的盐份，再用去离子水冲洗1次，沥去水分，置于容器内；
(2)将蚂蟥体表消毒灭菌后，按蚂蟥重量计算，加入3‰亚硫酸氢钠，1‰抗坏血酸和3倍去离子水拌匀，投入胶体磨中研磨，研磨温度控制在小于50℃，得到蚂蟥浆液；所述的蚂蟥浆液的细度为19目；
(3)将步骤(2)所得的蚂蟥浆液进行2次粗滤，合并2次粗滤的滤渣和滤液；所述的2次粗滤的具体操作为：第1次粗滤用70目滤布在三足离心机过滤，积累于滤布的滤渣用适量无离子水喷淋2次；第2次粗滤用200目在三足离机过滤，积累于滤布的滤渣用适量无离子水喷淋1次；
(4)将步骤(3)所得滤液用可拦截分子量30000da的30000膜进行微滤，收集微滤透过液；微滤的操作参数为：压泵0.2Mpa、pH值6.5、温度45℃、膜面流量2M/S、浓缩比3.5倍；
(5)将微滤透过液进行2次超滤，第1次超滤选用10000膜；浓缩液加入上述粗滤渣中，透过液进行第2次超滤，选用5000膜；透过溶液并入前述之滤渣中，所得浓液即为富集含水蛭素溶液；所述的第1次超滤的操作参数为：压泵0.3Mpa、pH值5.5、温度45℃、膜面流速2M/S、浓缩比4.5倍；第2次超滤的操作参数为：压泵0.4Mpa、pH值为5.5、温度45℃、膜面流量2M/S、浓缩比6.5倍；
(6)把粗滤渣和微滤透过液及超滤1浓液、超滤2之透液，调pH值为9，投入有搅拌装置，功率5KW的微波罐中，用2KW功率微波升温，控控温小于60℃，微波20min，在58℃保温20min，排出冷却；
(7)将步骤(6)排出的溶液冷至45℃，用200目滤布三足离心机过滤，积累于滤布的滤渣用无离子水适量喷淋，所得滤液即为蚂蟥蛋白溶液；
(8)将步骤(7)所得蚂蟥蛋白溶液，先用稀盐酸调pH值至6，然后再用10％冰醋酸溶解2％的壳聚糖溶液调pH值至5，将蛋白沉析出来，静置1.5h，待溶液分层后弃去上层液再用400目滤布离心过滤，得湿蛋白，加入2.5倍于湿蛋白量0.75％高锰酸钾溶液在40℃温度下浸泡1.8h，然后用400目尼龙滤布脱去高锰酸钾并用清水冲洗1次，用2.5倍于湿渣的草酸溶液浸泡2.5h，观察蛋白为白色时，即开始收集脱色蛋白；
(9)将脱色的湿蛋白用无离子水稀释，待蛋白质浓度达到7％时，调pH值为9，加入底物质量3％的碱性酶搅拌均匀，置于带搅拌装置功率5KW微波罐中，启动2KW功率，当酶解液升温到45℃时检测酶解液pH值，当pH值下降至7.5以下时，补碱液调至9，当pH值下降至7.5以上8以下时，补碱调至8.5，酶解液升温至55℃再检1次pH值，当pH下降不到7.8以下不再补碱，下降至7.8以下时补碱调至8，酶解液温度达到55℃时停止微波保留搅拌，待温度下降低于50℃后再启动2KW功率微波待酶解液升温至55℃，关掉微波保留搅拌，待酶解液温度下降至45℃以下时检测酶解液pH值，当pH低于8时补碱调至8，添加底物质量2.5％的胰酶，启动2KW微波，酶解液升温至50℃时，检查酶解液pH值，当pH下降低于或接近7时，补碱调至7.8，继续微波升温至55℃关掉微波，再检测pH，当pH下降至7.3以下补碱调至7.5，启动搅拌，待酶解液温度下降至45℃再启动微功率2KW，酶解液升温至55℃，保温5分钟后，启动功率10KW升温至88℃，保温10分钟灭酶活；所述的碱性酶的酶活为10万u/g；胰酶的酶活>4000u/g；
(10)将灭酶活后的酶解液排出，冷却至40℃，在搅拌状态下，缓慢添加用含20％冰醋酸溶解1.5％的壳聚糖溶液，使pH值调至5，沉析未酶解的蛋白及其他大分子杂质等，沉析液静置2小时，用400目滤布离心除去的沉析物即为蚂蟥蛋白，离心时先过滤上层液后过滤浓液；
(11)将400目过滤所得的滤液，再用30000膜进行微滤；浓液合并入上述400目粗滤渣中；微滤的操作参数为：压泵0.2Mpa、pH值6.5、温度45℃、膜面流速3M/S、浓缩比3.5倍；
(12)步骤(11)所得微滤透过液进行2次超滤，第1次超滤用10000膜，第2次超滤用5000膜，两次超滤的浓缩液合并进粗滤渣中；第1次超滤和第2次超滤的操作参数为：压泵0.3Mpa、pH值5.5、温度45℃、膜面流速2M/S、浓缩比5.5倍；
(13)将步骤(12)中超滤2所得透过液进行钠滤；所述钠滤的操作参数为：压力0.8Mpa，循环流量2.0m3/h，浓缩倍数8。
(14)将步骤(13)中纳滤所得浓缩液，选用喷雾干燥法干燥，获得多肽；将步骤(10)的滤渣，步骤(11)微滤之浓液、步骤(12)超滤之浓液合并选用喷雾干燥法干燥，获得蚂蟥蛋白粉。
表1本发明从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法的效果
| 组别 | 蚂蟥多肽纯度(％) | 蚂蟥蛋白的酶解率(％) |
| 实施例1 | 66 | 39 |
| 实施例2 | 65 | 40 |
| 实施例3 | 68 | 43 |
从表1可以看出，本发明从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法得到蚂蟥多肽纯度均在65％以上，蚂蟥蛋白的酶解率均在39％以上。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (9)
1.一种从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)先用清水冲洗鲜蚂蟥或解冻蚂蟥体表的污染物，然后移入浓度为3‰高锰酸钾溶液中，搅拌浸泡10-15min；捞起后用清水洗掉高锰酸钾溶液，再将其移入浓度为5％氯化钠溶液中搅拌浸泡10min，捞起后用清水洗去其体表的盐份，再用去离子水冲洗1次，沥去水分，置于容器内；
(2)将蚂蟥体表消毒灭菌后，按蚂蟥重量计算，加入3‰亚硫酸氢钠，1‰抗坏血酸和3倍去离子水拌匀，投入胶体磨中研磨，研磨温度控制在小于50℃，得到蚂蟥浆液；
(3)将步骤(2)所得的蚂蟥浆液进行2次粗滤，合并2次粗滤的滤渣和滤液；
(4)将步骤(3)所得滤液用可拦截分子量30000Da的30000膜进行微滤，收集微滤透过液；
(5)将微滤透过液进行2次超滤，第1次超滤选用10000膜；浓缩液加入上述粗滤渣中，透过液进行第2次超滤，选用5000膜；透过溶液并入前述之滤渣中，所得浓液即为富集含水蛭素溶液；
(6)把粗滤渣和微滤浓缩液及超滤1浓液、超滤2之透液，调pH值为9，投入有搅拌装置，功率2-10KW的微波罐中，用2KW功率微波升温，控控温小于60℃，微波20min，在55-60℃保温20min，排出冷却；
(7)将步骤(6)排出的溶液冷至45℃，用200目滤布三足离心机过滤，积累于滤布的滤渣用无离子水适量喷淋，所得滤液即为蚂蟥蛋白溶液；
(8)将步骤(7)所得蚂蟥蛋白溶液，先用稀盐酸调pH值至6，然后再用10％冰醋酸溶解2％的壳聚糖溶液调pH值至5，将蛋白沉析出来，静置1-2h，待溶液分层后弃去上层液再用400目滤布离心过滤，得湿蛋白，加入2-3倍于湿蛋白量0.75％高锰酸钾溶液在35-45℃温度下浸泡1.5-2h，然后用400目尼龙滤布脱去高锰酸钾并用清水冲洗1次，用2-3倍于湿渣的0.75％草酸溶液浸泡2-3h，观察蛋白为白色时，即开始收集脱色蛋白；
(9)将脱色的湿蛋白用无离子水稀释，待蛋白质浓度达到7％时，调pH值为9，加入底物质量3％的碱性酶搅拌均匀，置于带搅拌装置功率2-10KW微波罐中，启动2KW功率，当酶解液升温到45℃时检测酶解液pH值，当pH值下降至7.5以上8以下时，补碱调至8.5，酶解液升温至55℃再检1次pH值，当pH下降不到7.8以下不再补碱，下降至7.8以下时补碱调至8，酶解液温度达到55℃时停止微波保留搅拌，待温度下降低于50℃后再启动2KW功率微波待酶解液升温至55℃，关掉微波保留搅拌，待酶解液温度下降至45℃以下时检测酶解液pH值，当pH低于8时补碱调至8，添加底物质量2.5％的胰酶，启动2KW微波，酶解液升温至50℃时，检查酶解液pH值，当pH下降低于或接近7时，补碱调至7.8，继续微波升温至55℃关掉微波，再检测pH，当pH下降至7.3以下补碱调至7.5，启动搅拌，待酶解液温度下降至45℃再启动微功率2KW，酶解液升温至55℃，保温5分钟后，启动功率10KW升温至85-90℃，保温10分钟灭酶活；
(10)将灭酶活后的酶解液排出，冷却至40℃，在搅拌状态下，缓慢添加用含20％冰醋酸溶解1.5％的壳聚糖溶液，使pH值调至5，沉析未酶解的蛋白及其他大分子杂质等，沉析液静置2小时，用400目滤布离心除去的沉析物即为蚂蟥蛋白，离心时先过滤上层液后过滤浓液；
(11)将400目过滤所得的滤液，再用30000膜进行微滤；浓液合并入上述400目粗滤渣中；
(12)步骤(11)所得微滤透过液进行2次超滤，第1次超滤用10000膜，第2次超滤用5000膜，两次超滤的浓缩液合并进粗滤渣中；
(13)将步骤(12)中超滤2所得透过液进行钠滤；
(14)将步骤(13)中纳滤所得浓缩液，选用喷雾干燥法干燥，获得多肽；将步骤(10)的滤渣，步骤(11)微滤之浓液、步骤(12)超滤之浓液合并选用喷雾干燥法干燥，获得蚂蟥蛋白粉。
2.根据权利要求1所述的从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤(2)中所得蚂蟥浆液的细度为18-20目。
3.根据权利要求1所述的从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的2次粗滤的具体操作为：第1次粗滤用60-80目滤布在三足离心机过滤，积累于滤布的滤渣用适量无离子水喷淋1-2次；第2次粗滤用200目在三足离机过滤，积累于滤布的滤渣用适量无离子水喷淋1-2次。
4.根据权利要求1所述的从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤(4)中微滤的操作参数为：压泵0.05-0.3Mpa、pH值6-7、温度40-50℃、膜面流量1-4M/S、浓缩比3-4倍。
5.根据权利要求1所述的从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤(5)中所述的第1次超滤的操作参数为：压泵0.1-0.43Mpa、pH值5-6、温度40-50℃、膜面流速1-3M/S、浓缩比4-5倍；第2次超滤的操作参数为：压泵0.3-0.6Mpa、pH值为5-6、温度40-50℃、膜面流量1-3M/S、浓缩比6-7倍。
6.根据权利要求1所述的从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤(9)中所述的碱性酶的酶活为10万u/g；胰酶的酶活>4000u/g。
7.根据权利要求1所述的从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤(11)中微滤的操作参数为：压泵0.05-0.3Mpa、pH值6-7、温度40-50℃、膜面流速1-4M/S、浓缩比3-4倍。
8.根据权利要求1所述的从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤(12)中第1次超滤和第2次超滤的操作参数为：压泵0.2-0.4Mpa、pH值5-6、温度40-50℃、膜面流速1-3M/S、浓缩比5-6倍。
9.根据权利要求1所述的从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤(13)中所述钠滤的操作参数为：压力0.7-0.9Mpa，循环流量1.5-2.5m3/h，浓缩倍数7-9。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510908591.7A CN105385739B (zh) | 2015-12-09 | 2015-12-09 | －种从金边蚂蟥中制取蛋白肽的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510908591.7A CN105385739B (zh) | 2015-12-09 | 2015-12-09 | －种从金边蚂蟥中制取蛋白肽的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105385739A true CN105385739A (zh) | 2016-03-09 |
| CN105385739B CN105385739B (zh) | 2017-09-29 |
Family
ID=55418516
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510908591.7A Active CN105385739B (zh) | 2015-12-09 | 2015-12-09 | －种从金边蚂蟥中制取蛋白肽的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105385739B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106892961A (zh) * | 2017-02-14 | 2017-06-27 | 广西肽王生物科技有限公司 | 一种蝇蛆蛋白多肽和蝇蛆油的分离提取方法 |
| CN107177654A (zh) * | 2017-06-05 | 2017-09-19 | 深圳知本康业有限公司 | 一种水蛭蛋白多肽粉及应用 |
| CN107805273A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-03-16 | 罗乌支 | 一种从蝇蛆中提取天然肽的方法 |
| CN113813291A (zh) * | 2021-11-10 | 2021-12-21 | 山东新时代药业有限公司 | 一种动物药材冻干粉的制备方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1699415A (zh) * | 2005-06-02 | 2005-11-23 | 上海交通大学 | 具有降血脂功能的昆虫蛋白的制备方法 |
| CN1965672A (zh) * | 2006-10-13 | 2007-05-23 | 马庆发 | 蛆蛋白与蛆蛋白粉 |
| CN102438600A (zh) * | 2009-04-24 | 2012-05-02 | 伊休蒂卡有限公司 | 用于改善生物活性物质溶出度特征的方法 |
| CN102920736A (zh) * | 2012-11-30 | 2013-02-13 | 哈药集团中药二厂 | 一种中药水蛭提取物的制备方法 |
| CN104402748A (zh) * | 2014-12-05 | 2015-03-11 | 南宁知本康业生物技术有限公司 | 一种微波辅助从猫豆中提取左旋多巴的方法 |
| CN104480171A (zh) * | 2014-11-21 | 2015-04-01 | 南宁知本康业生物技术有限公司 | 一种从猫豆渣中提取多肽的方法 |
-
2015
- 2015-12-09 CN CN201510908591.7A patent/CN105385739B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1699415A (zh) * | 2005-06-02 | 2005-11-23 | 上海交通大学 | 具有降血脂功能的昆虫蛋白的制备方法 |
| CN1965672A (zh) * | 2006-10-13 | 2007-05-23 | 马庆发 | 蛆蛋白与蛆蛋白粉 |
| CN102438600A (zh) * | 2009-04-24 | 2012-05-02 | 伊休蒂卡有限公司 | 用于改善生物活性物质溶出度特征的方法 |
| CN102920736A (zh) * | 2012-11-30 | 2013-02-13 | 哈药集团中药二厂 | 一种中药水蛭提取物的制备方法 |
| CN104480171A (zh) * | 2014-11-21 | 2015-04-01 | 南宁知本康业生物技术有限公司 | 一种从猫豆渣中提取多肽的方法 |
| CN104402748A (zh) * | 2014-12-05 | 2015-03-11 | 南宁知本康业生物技术有限公司 | 一种微波辅助从猫豆中提取左旋多巴的方法 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106892961A (zh) * | 2017-02-14 | 2017-06-27 | 广西肽王生物科技有限公司 | 一种蝇蛆蛋白多肽和蝇蛆油的分离提取方法 |
| CN107177654A (zh) * | 2017-06-05 | 2017-09-19 | 深圳知本康业有限公司 | 一种水蛭蛋白多肽粉及应用 |
| CN107805273A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-03-16 | 罗乌支 | 一种从蝇蛆中提取天然肽的方法 |
| CN113813291A (zh) * | 2021-11-10 | 2021-12-21 | 山东新时代药业有限公司 | 一种动物药材冻干粉的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105385739B (zh) | 2017-09-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104342040B (zh) | 一种高胶融温度鱼鳞明胶的制备方法 | |
| CN105385739A (zh) | －种从金边蚂蟥中制取蛋白肽的方法 | |
| WO2021142880A1 (zh) | 一种蛤蜊活性肽的生产方法 | |
| CN101979532B (zh) | 一种综合利用猪血的方法 | |
| CN103342669B (zh) | 一种提取天然牛磺酸的简易方法 | |
| CN105132498A (zh) | 一种小分子海参肽及其制备方法 | |
| CN100369929C (zh) | 海蜇胶原蛋白及其制备方法 | |
| CN102154424A (zh) | 小分子鱼鳞胶原蛋白肽的制备工艺 | |
| CN103555798B (zh) | 一种采用陶瓷膜提取蝇蛆蛋白的方法 | |
| CN104774896A (zh) | 带鱼鱼骨铁螯合胶原肽制备方法 | |
| CN102676620B (zh) | 一种高分子量鱿鱼皮胶原蛋白的制备方法 | |
| CN107385001A (zh) | 从海参深加工副产物中提取海参低聚肽和海参多糖的工艺 | |
| CN101869169B (zh) | 以鱼下脚料发酵耦合膜技术制备鱼低聚肽的方法 | |
| CN106319014A (zh) | 一种小分子深海鱼多肽的提取方法 | |
| CN102550824A (zh) | 蛋白酸水解生产小肽氨基酸微量元素螯合物的方法 | |
| CN106906199A (zh) | 一种快速纯化鱿鱼内脏蛋白酶方法及应用 | |
| CN109943612A (zh) | 一种酶解鲢鱼鱼鳞生产高活性鱼糜及制品抗冻剂的方法 | |
| CN106632665A (zh) | 一种利用乳酸提取淡水鱼皮胶原蛋白的方法 | |
| CN113563459A (zh) | 一种胶原蛋白肽生产过程中蛋白提取工艺 | |
| CN107629122A (zh) | 鲶鱼鱼内脏蛋白酶提取的鱼皮胶原蛋白 | |
| CN104774827A (zh) | 一种以鲍鱼内脏为原料制备褐藻胶裂解酶的方法 | |
| CN102816224B (zh) | 一种纺丝用毛发角蛋白质溶液及其制备方法和应用 | |
| CN106834399A (zh) | 一种来源于厚壳贻贝闭壳肌的降压肽 | |
| CN104256047A (zh) | 一种豆渣蛋白质的提取方法及其用于制备dpp-iv抑制肽的方法 | |
| CN103923963B (zh) | 一种制备鱼皮胶原蛋白及ace抑制肽的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20191226 Address after: 201, room 518000, building A, No. 1, front Bay Road, Qianhai Shenzhen Guangdong Shenzhen Hong Kong cooperation zone (Qianhai business secretary) Patentee after: Shenzhen Jhihben Kang Industry Co. Ltd. Address before: 530004 the Guangxi Zhuang Autonomous Region University of Nanning City Road No. 100 west east campus district 15 building Co-patentee before: Liang Manshui Patentee before: Liang Shangwen |