CN105385633A

CN105385633A - 一种具有抑制霉菌活性的植物乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN105385633A
Application number: CN201510868539.3A
Authority: CN
Inventors: 魏新元; 宋云博; 樊明涛; 杨靖鹏; 李院
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2015-11-30
Publication date: 2016-03-09

Abstract

一种具有抑制霉菌功能的植物乳杆菌及其应用，所述植物乳杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC？M？2015615，保藏日期为2015年10月19日。本发明之具有抑制霉菌功能的植物乳杆菌菌株能够对酱菜食品中常见的腐败霉菌起到良好的抑制作用，既能保持酱菜固有的品质，也能达到延长低盐、低防腐剂添加的酱菜产品的保藏期，对酱菜行业的发展起到一定的引导和促进作用；同时，本发明制备生物防腐剂操作简便，成本低廉。

Description

一种具有抑制霉菌活性的植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种植物乳杆菌及其应用，具体涉及一种具有抑制霉菌功能的植物乳杆菌及其应用。

背景技术

中国人喜欢吃酱菜，然而现有的酱菜为延长酱菜保质期通常采用盐渍和添加防腐剂，使得酱菜盐度大，钠含量高，且含有大量的防腐剂，容易对人体造成伤害，人们也渐渐对酱菜失去了兴趣。因此，亟需一种既能保持酱菜固有的品质，还能达到延长低盐、低防腐剂添加的酱菜产品保藏期的生物防腐剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种成本低廉、容易培养、实用性强的对霉菌具有良好抑制效果的植物乳杆菌菌株、低盐及低防腐剂添加的酱菜生物防腐剂及其应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种具有抑制霉菌功能的植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌JCM1149(LactobacillusplantarumJCM1149)，所述菌株JCM1149保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCCM2015615，保藏日期为2015年10月19日，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心，邮编430072。

本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种生物防腐剂，活性成分为所述植物乳杆菌。

本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种生物防腐剂的制备方法，将活化后的植物乳杆菌以1～3％接种量接种于新鲜MRS液体培养基，在35～37℃恒温培养箱静置培养24～26h，然后将菌悬液在冷冻离心机中以2000～4000r/min的转速离心10～15min，取其上清液，用0.22μm的微孔滤膜过滤除去菌体，置于-60～80℃冰箱中冷冻12～15h，经过浓缩干燥，然后用无菌蒸馏水溶解制备成十倍浓缩液，即成。

进一步，所述MRS液体培养基是由蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，乙酸钾5.0g，七水合硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温801.0mL，蒸馏水1000mL,121℃灭菌15min制成。

本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种具有抑制霉菌功能的植物乳杆菌在酱菜加工中的应用，每千克酱菜中含6～7×10⁸cfu所述植物乳杆菌。

本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种生物防腐剂在酱菜加工中的应用，每千克酱菜中添加6～10g所述生物防腐剂。

本发明之具有抑制霉菌功能的植物乳杆菌菌株能够对酱菜食品中常见的腐败霉菌起到良好的抑制作用，既能保持酱菜固有的品质，也能达到延长低盐、低防腐剂添加的酱菜产品的保藏期，对酱菜行业的发展起到一定的引导和促进作用；同时，本发明制备生物防腐剂操作简便，成本低廉。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步加以说明。

实施例1：植物乳杆菌菌株的分离、纯化与鉴定

1、植物乳杆菌菌株的分离:

将6种酱菜样品无菌操作各称取鲜质量10g，切成5mm小丁，加入90mL无菌生理盐水涡旋震荡3min，然后取悬浮液进行梯度稀释至10^-7，接着分别从10^-4-10^-7稀释度吸取1mL加入无菌培养皿中，倒入50℃的含有碳酸钙的MRS固体培养基15-20mL混匀后冷却至室温，放置于37℃恒温培养箱中培养24-48h至有溶钙圈菌落出现。

2、植物乳杆菌菌株的纯化:

挑取有溶钙圈的菌落继续在MRS固体培养基上进行分离纯化。将产生溶钙圈的菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验，染色阳性且过氧化氢酶阴性菌株初步定为乳酸菌。甘油冷冻保藏。

3、菌株形态特征及生理生化鉴定:

3.1菌株形态

该菌菌落为圆形，颜色呈乳白色，菌落表现光滑，边缘整齐，质地均匀。

3.2生理生化鉴定，结果见表1

表1菌株LY-4的生理生化鉴定结果

指标	结果	指标	结果	指标	结果
						***糖	－	葡萄糖酸盐	－	蜜二糖	+
纤维二糖	+	乳糖	+	棉籽糖	+
						七叶灵	+	麦芽糖	+	鼠李糖	－
果糖	+	甘露醇	+	山梨醇	－
						半乳糖	+	甘露糖	+	蔗糖	+
葡萄糖	+	松三糖	+	木糖	+

注：“+”表示阳性；“－”表示阴性。

由表1可知，菌株经革兰氏染色呈阳性，菌体为杆状。过氧化氢酶试验阴性，明胶水解阴性，不产H₂S，且能发酵大部分糖类，但对***糖、鼠李糖、山梨糖等呈发酵阴性。

4、活性菌株的分子生物学鉴定：

4.1DNA的提取

采用CTAB法提取乳酸菌的基因组DNA。具体步骤为：

(1)细菌收集：取2mL，37℃摇床培养16-18h后的MRS菌液于2mL无菌离心管中，12000rpm离心5min，尽可能的除去培养基，以免残留的培养基影响后续实验结果。

(2)悬浮菌体：用移液枪加560μL的TEbuffer溶液到离心管中，轻轻吹打，悬浮体，使菌体与溶液充分混匀。

(3)细胞壁的破裂：向菌悬液中加入2μL-4μL的溶菌酶溶液(20mg/mL)，用移液枪轻轻吹打2～3下以使溶菌酶与菌体充分接触，在37℃水浴下反应40min使菌体细胞壁完全破裂。后加入6μL的蛋白酶K溶液(10mg/mL)溶解蛋白质，再加入30μL的浓度为10％的SDS溶液沉淀蛋白质(若SDS溶液出现沉淀，应先在37℃水浴下使其溶解，否则会影响SDS溶液的浓度)。将以上溶液用移液枪吹打混匀，37℃水浴条件下反应45min-60min(至溶液透明即可)。

(4)去除多糖成分：向上述透明溶液中加入100μL的NaCI溶液(5mol/L)，轻轻震荡混匀，放入65℃恒温水箱内反应2min。加入80μL的CTAB/NaCI溶液(使用前65℃预热)，枪头吹打几下65℃水浴反应10min。

(5)抽提：向上一操作的离心管中，加入等体积(约800μL)的氯仿/异戊醇溶液(24:1)来变性和沉淀蛋白质，12000rpm离心5min后将上层透明液体转移至另一洁净的2mL离心管中。

(6)再次抽提：向上层透明液体中加入等体积(约800μL)的苯酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)以再次沉淀蛋白质，12000rpm离心5min将上层透明液体转移至另一洁净的2mL离心管中。

(7)三次抽提：向上清液2中加入等体积(约600μL)的氯仿/异戊醇混合液(24:1)，以将蛋白质等杂质除尽，12000rpm离心5min，将上清液(含DNA)转移至另一洁净的1.5mL离心管中。

(8)沉淀：向上清液3中加入0.7倍体积(约400μL)的异丙醇，轻轻颠倒离心管数次。室温放置20min以沉淀DNA。12000rpm离心15min，倒掉上清液，提取效果较好的可看见在管底有白色沉淀出现。

(9)洗涤：用70％乙醇(只溶解杂质，不溶解DNA)洗涤沉淀，加入量为500μL，用枪吹打使沉淀分散，充分洗涤后12000rpm离心15min，去除上层乙醇，倒扣离心管以除去管壁附着的水分。

(10)溶解：加入100μL双蒸水溶解DNA沉淀。

(11)用琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的效果，琼脂糖百分含量0.7％，DNA溶液点样量为5μL，用λ-EcoT14ⅠdigestDNAMarker作为分子大小的标记，点样量为3μL，电泳完成后凝胶成像可观测到所提DNA是否完整。完整DNA溶液放于-20℃冰箱何中保存备用。

4.2植物乳杆菌16SrDNA的PCR扩增与测序

以乳酸菌菌株基因组DNA为模板，利用扩增细菌16SrDNA的通用引物27f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1495r(5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA)，对乳酸菌的16SrDNA进行PCR扩增。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；然后94℃变性45s、56℃退火1min、72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物大小经过琼脂糖凝胶电泳检测验证后，将目标条带送至北京英俊生物工程有限公司进行测序。

4.3同源性分析与***发育树的构建

采用核酸BLAST技术，将测序获得的序列信息与NCBI网站里的GeneBank数据库进行对比，找到与所测序列同源性最高的已知分类地位的菌种。然后从GenBank/EMBL/DDBJ数据库中，获得已知菌株的16SrDNA基因序列，与所测菌株的16SrDNA序列一起，采用MEGA6.0进行比对，绘制***发育树，确定菌株分类地位,结果如表2所示。

表2菌株序列比对及鉴定结果

依据16SrDNA基因序列的同源性分析，确定该菌株为植物乳杆菌(Lb.plantarum)。

实施例2：植物乳杆菌菌株的抑制霉菌活性的分析

1、无菌浓缩植物乳杆菌发酵液的制备：将活化后的植物乳杆菌以1％接种量接种于新鲜MRS液体培养基(MRS液体培养基配方：蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，乙酸钾5.0g，七水合硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温801.0mL，蒸馏水1000mL,121℃灭菌15min)，在37℃恒温培养箱静置培养24h，然后将菌悬液在冷冻离心机中以3000r/min的转速离心12min，取其上清液，用0.22μm的微孔滤膜过滤除去菌体，置于-80℃冰箱中冷冻12h，经过真空冷冻干燥机浓缩干燥，然后用无菌蒸馏水溶解制备成十倍浓缩液。

2、霉菌孢子液的制备：选取枝孢霉作为植物乳杆菌抑制作用检测的测试菌，将待试菌株接种在PDA斜面，28℃恒温培养7d左右至大量孢子产生，加入5mL灭菌生理盐水于斜面试管，涡旋震荡5min，采用400目无菌纱布过滤除去营养菌丝体，收集的孢子悬液使用血球计数板计数，备用。

3、植物乳杆菌发酵浓缩液对霉菌抑制活性的测定：采用牛津杯法测定抑霉菌活性。用无菌涂布器将0.4mL孢子浓度为5×10⁴个/mL孢子悬浮液均匀涂布在配制好的新鲜PDA固体平板培养基上，涂布后以平板无可见水滴为准，此时的平板立即进行抑菌试验。用无菌镊子将无菌的牛津杯轻轻放入上述培养皿中，在水平放置的平皿中均匀地放置3只牛津杯。向每只牛津杯中加入60μm无菌植物乳杆菌发酵浓缩液，以十倍浓缩MRS液体培养基为对照。置于28℃培养箱静置培养72h，测量其对如青霉、赭曲霉等腐败霉菌的抑菌圈直径，检测浓缩液的抑霉菌活性。

4、植物乳杆菌抑制霉菌的有效成分分析

(1)蛋白酶处理对浓缩液抑制霉菌活性的影响：向植物乳杆菌发酵浓缩液中加入终浓度为1mg/mL的胃蛋白酶及蛋白酶K，于37℃水浴2h后取出，80℃水浴2min使酶失活。采用牛津杯法检测蛋白酶处理后浓缩液的霉菌抑制活性，分别以未使用蛋白酶处理的浓缩液及终浓度1mg/mL的胃蛋白酶及蛋白酶K缓冲溶液为作为对照，实验结果见表3。

表3蛋白酶处理对浓缩液抑霉菌活性的影响

注：“－”无抑菌圈，“+”抑菌圈直径为＞6mm且≤12mm，“++”抑菌圈直径为＞12mm且≤18mm，“+++”抑菌圈直径＞18mm。

由表3可知，在蛋白酶处理植物乳杆菌发酵浓缩液的试验中，植物乳杆菌发酵液经过胃蛋白酶处理后其抑菌活性几乎未有改变，而它对蛋白酶K有一定敏感度。

(2)有机酸对浓缩液抑制霉菌活性的影响：记录浓缩液原始pH值，用lmol/L的NaOH溶液分别调节浓缩液pH值至4.0、5.0、6.0采用牛津杯法测定处理后的浓缩液对霉菌的抑制作用，以未调整pH值的浓缩液及NaOH溶液作为对照,实验结果见表4。

表4有机酸对浓缩液抑霉菌活性影响

注：“+”抑菌圈直径为＞6mm且≤12mm，“++”抑菌圈直径为＞12mm且≤18mm，“+++”抑菌圈直径＞18mm且≤24mm，“++++”抑菌圈直径＞24mm。

由表4可知，植物乳杆菌浓缩发酵液抑霉菌活性受到pH值调节的影响。当发酵液pH值调整为4.0时，发酵液的抑霉菌活性有所下降，pH值为5.0或继续升高至中性时，发酵液的抑菌活性保持不变。

(3)热处理对浓缩液抑制霉菌活性的影响：将植物乳杆菌发酵浓缩液分别置于60、80、100℃水浴中处理5min，用牛津杯法测定处理后的浓缩液的抑霉菌活性，检测抑菌物质热稳定性，以未经热处理的浓缩液为对照，实验结果见表5。

表5热处理对抑制霉菌活性的影响

注：表中数据为4次重复试验的所得数据平均值；表中竖向数据后相同字母者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著，为p<5％水平检验。

由表5可知，植物乳杆菌发酵浓缩液经过60、80、100℃处理后，其抑菌活性与对照组均无显著性差异，说明植物乳杆菌发酵液中的抑霉菌活性物质的热稳定性较高。

实施例3：植物乳杆菌(生物防腐剂)在酱菜加工中的应用

1、应用

本发明植物乳杆菌对酱菜中的污染霉菌及常见致病菌具有良好的抑菌活性，按照每千克酱菜中添加含6.5×10⁸cfu植物乳杆菌，也可将其菌悬液及苯甲酸钠添加于酱菜样品，即每千克酱菜中添加10g生物防腐剂，二者在抑制腐败菌生长的过程中均有良好的抑菌作用，当采用生物防腐剂时，则有良好的协同作用，使抑菌效果更强。

2、评价对酱菜品质的影响

分别使用苯甲酸钠、植物乳杆菌及苯甲酸钠与植物乳杆菌组合处理酱菜样品，做空白对照，经过20℃，90d的贮藏，考察不同处理组在不同阶段对酱菜品质的影响，实验结果如表6。

表6不同处理方法对酱菜感官品质的影响比较

由表6可知，空白组在20℃的条件下保藏30d时出现胀袋现象，添加标准限量的苯甲酸钠处理组在90d时出现胖袋，而添加L544及植物乳杆菌与苯甲酸钠的复合防腐剂的处理组在保藏期内未出现胖袋现象。此外，与空白对照组相比，使用苯甲酸钠、植物乳杆菌及复合防腐剂对保持酱菜品质有明显作用，且使用复合防腐剂的酱菜样品品质变化较小。因此，由保存效果对比可知，使用苯甲酸钠与植物乳杆菌作为复合防腐剂可在更大程度上保持酱菜品质。

Claims

1.一种具有抑制霉菌功能的植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为植物乳杆菌，保藏编号为CCTCCM2015615，保藏日期为2015年10月19日。

2.一种生物防腐剂，其特征在于，活性成分为权利要求1所述植物乳杆菌。

3.一种如根据权利要求2所述的生物防腐剂的制备方法，其特征在于，将活化后的植物乳杆菌以1～3％接种量接种于新鲜MRS液体培养基，在35～37℃恒温培养箱静置培养24～26h，然后将菌悬液在冷冻离心机中以2000～4000r/min的转速离心10～15min，取其上清液，用0.22μm的微孔滤膜过滤除去菌体，置于-60～80℃冰箱中冷冻12～15h，经过浓缩干燥，然后用无菌蒸馏水溶解制备成十倍浓缩液，即成。

4.根据权利要求3所述的生物防腐剂的制备方法，其特征在于，所述MRS液体培养基是由蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，乙酸钾5.0g，七水合硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温801.0mL，蒸馏水1000mL,121℃灭菌15min制成。

5.根据权利要求1所述的具有抑制霉菌功能的植物乳杆菌在酱菜加工中的应用，其特征在于，每千克酱菜中含6～7×10⁸cfu所述植物乳杆菌。

6.根据权利要求2所述的生物防腐剂在酱菜加工中的应用，每千克酱菜中添加6～10g所述生物防腐剂。