CN105377250A - 用于对抗抗菌剂抗性细菌的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于使细菌对抗菌剂敏感的组合物和方法,所述方法包括以下步骤,在进入促进剂存在的情况下将细菌暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中。本发明还提供了用于杀灭抗菌剂抗性细菌的方法,所述方法包括以下步骤:在进入促进剂存在的情况下将细菌暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中并将细菌暴露于抗菌剂。所述方法还包括鉴定细菌和细菌的抗菌剂抗性谱,并相应地定制所述方法的步骤。本发明提供的示例性的进入促进剂是聚六亚甲基双胍(PHMB)和聚六亚甲基胍(PHMG)。示例性的抑制抗菌剂抗性的试剂是结合并抑制抗菌剂抗性决定因子如β-内酰胺酶、PBP2a、NDM-1和Vim2的试剂。本发明还提供了组合物、药物组合物/制剂及其医学用途。
Description
本发明涉及用于对抗抗菌剂抗性细菌的组合物和方法。特别地,其涉及用于使细菌对抗菌剂敏感并将该细菌暴露于已经使其敏感的抗菌剂中从而将其杀灭。
细菌引起一些最严重的人和动物感染性疾病并且仍然是全世界死亡的主要原因。抗菌剂抗性的发展是医院和社区中治疗细菌感染中的主要问题。对抗微生物剂存在不同的抗性机制,如固有抗药性,其是不必与给定类型的抗微生物剂关联的一般适应性过程的结果。这样的抗药性的实例可见于绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa),其低膜渗透性很可能是其对许多抗菌剂先天抗药的主要原因。后天抗药性是主动抗菌剂抗性的主要机制并且是特定进化压力的结果,以允许细菌预先对抗菌剂敏感从而变得有抗性。这样的抗药性包括渗透屏障的改变,包括外排泵的过表达;抗微生物药物靶标的改变;以及抗菌剂的失活,例如通过酶修饰。在Bockstael&VanAerschot(2009)Eur.J.Med.4(2),141-155中综述了细菌的抗微生物剂抗性。
仍旧需要对抗细菌感染的另外的方法,并且本发明涉及使抗菌剂抗性细菌对抗菌剂的作用敏感,从而有助于克服抗菌剂抗性的方法。抑制抗菌剂抗性决定因子的试剂是已知的,但并不都证实用于使细菌对抗菌剂敏感,原因是其不能进入抗菌剂抗性细菌并到达靶位点。本发明的目的旨在克服这些困难中的一些。
本发明的第一方面提供了一种组合物,该组合物包含细菌进入促进剂和抑制抗菌剂抗性的试剂。
所述组合物还可以包含抗菌剂。
本发明的再一方面提供了用于使细菌对抗菌剂敏感的方法,所述方法包括以下步骤:在进入促进剂存在的情况下,使细菌暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中。
本发明的另一方面提供了用于杀灭抗菌剂抗性细菌的方法,所述方法包括以下步骤:在进入促进剂存在的情况下,使细菌暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中并使细菌暴露于抗菌剂中。
本发明实施方案的任何方面中的进入促进剂优选地如在2012年10月11日提交的PCT/GB2012/052526中所述的进入促进剂,通过引用将其并入本文中。
术语“进入促进剂”意指能够进入细菌的荚膜和/或细胞壁的化合物或组合物。优选地,所述试剂还能够使抑制抗菌剂抗性的试剂也通过细菌的细胞质膜。
进入促进剂
本发明的任意方面或实施方案的进入促进剂典型地为聚合物,其中所述聚合物包括直链和/或支链聚单胍/聚胍、聚双胍或其类似物或衍生物,例如根据下式1a或式1b的,并在下表1和2中给出实例:
式1a
式1b
其中:
“n”是指聚合物中重复单元的数量,并且n可以从2到1000变化,例如从2或5到10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或900变化;
G1和G2独立地表示包含双胍或胍的阳离子基团,其中L1和L2直接连接到胍的氮原子上。因此,双胍或胍基与聚合物骨架是成一体的。双胍或胍基在式1a中不是侧链部分。
阳离子基团的实例:
双胍(如在PHMB中)
或
胍(如在PHMG中)
在本发明中,L1和L2是聚合物中G1和G2阳离子基团之间的连接基团。L1和L2可以独立地表示含有C1-C140碳原子的脂肪族基团,例如烷基基团如亚甲基、亚乙基、亚丙基、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10;C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140,烷基;或L1和L2可以(独立地)为C1-C140(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10;C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140)、脂环族基团、杂环基团、芳香族基团、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧基亚烷基,或L1和L2可以(独立地)为任选地被一个或多个,优选地一个氧、氮或硫原子、官能团以及饱和或不饱和的环部分中断的聚亚烷基。适合的L1和L2的实例是表1中列出的基团。
L1、L2、G1和G2可能已使用脂肪族基团、脂环族基团、杂环基、芳基、烷芳基、和氧基亚烷基修饰。
N和G3优选地为端基。典型地,用于本发明的聚合物具有末端的氨基(N)和氰基胍(G3)或胍(G3)端基。这样的端基可以通过与脂肪族基团、脂环族基团、杂环基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧基亚烷基连接(例如使用1,6-二氨基己烷、1,6-双(氰基胍基)己烷、1,6-二胍基己烷、4-胍基丁酸)来修饰。此外,可以通过与受体配体、右旋糖酐、环糊精、脂肪酸或脂肪酸衍生物、胆固醇或胆固醇衍生物或聚乙二醇(PEG)连接来修饰端基。任选地,聚合物可以在N和G3位置处以胍或双胍或氰基胺或胺或氰基胍结束,或在N处以氰基胺结束而在G3位置处以氰基胍结束,或在N处以胍结束而在G3位置处以氰基胍结束,或在G3处以L1胺结束和在N处以氰基胍结束。G3可以是L1-胺、L2-氰基胍或L2-胍。根据聚合(n)或聚合物链断裂的数量和在合成过程中的副作用,端基的不均匀混合物可以作为实例如上所述出现。因此,如上所记载的,N和G3基团可以互换/作为不均匀混合物存在。可选地N和G3可以不存在并且聚合物可以是环状的,在这种情况下各个末端的L1和G2基团彼此直接连接。
在式1b中,X可以存在或不存在。L3、L4和X如以上针对“L1或L2”所述的。L3和L4以及X是聚合物中G4和G5阳离子基团之间的连接基团。L3和L4以及X可以独立地表示含有C1-C140碳原子的脂肪族基团,例如烷基基团如亚甲基、亚乙基、亚丙基、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10;C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140,烷基;或L3和L4以及X可以独立地为C1-C140(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10;C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140)、脂环族基团、杂环基团、芳香族基团、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧基亚烷基,或L3和L4以及X可以独立地为任选地被一个或多个,优选一个氧、氮或硫原子、官能团以及饱和或不饱和的环部分中断的聚亚烷基。适合的L3和L4以及X的实例是表2中列出的基团。
“G4”和“G5”是阳离子部分并且可以相同或不同。它们中的至少一个是双胍部分或氨基甲酰基胍,其他部分可以如上所述(双胍或氨基甲酰基胍)或胺。为了避免疑问,在式1b中,阳离子部分G4和G5仅不含单胍基团。例如,G4和G5典型地不含单胍基团。这样的化合物的实例是如表2中列出的聚烯丙基双胍、聚(烯丙基二胍基-共(co)-烯丙胺)、聚(烯丙基氨基甲酰基胍基-共-烯丙胺)、聚乙烯基双胍。
聚烯丙基双胍的实例如下所示
在聚烯丙基双胍的情况下,L3和L4相同,G4和G5类似,因此聚烯丙基双胍可以简化如下。
聚(烯丙基氨基甲酰基胍基-共-烯丙胺)的实例如下所示
用于本发明的聚合物一般会有与其相关的抗衡离子。适合的抗衡离子包括但不限于以下:卤化物(例如氯化物)、磷酸盐、乳酸盐、膦酸盐、磺酸盐、氨基羧酸盐、羧酸盐、羟基羧酸盐、有机磷酸盐、有机膦酸盐、有机磺酸盐和有机硫酸盐。
用于本发明的聚合物可以是不同“n”数目的聚合物的不均匀混合物或通过标准纯化方法纯化的包含指定“n”数目的均匀部分。如上面所表明,聚合物也可以是环状的,另外可以是分支的。
“n”的优选数目包括2-250、2-100、2-80和2-50。
表1.由式1a产生的聚合物类似物的实例
式1a产生的示例化合物的CAS号
表2.由式1b产生的聚合物类似物的实例。
用于本发明的方法、组合物、制剂、用途和试剂盒的进入促进剂可以包含线性、分支或树状分子。进入促进剂可以包含线性、分支或树状分子的组合。进入促进剂可以包含式1a或式1b的分子的一个或任意组合,例如如上所述。
例如,进入促进剂可以包含聚六亚甲基双胍(PHMB)、聚六亚甲基单胍(PHMG)、聚亚乙基双胍(PEB)、聚四亚甲基双胍(PTMB)或聚亚乙基六亚甲基双胍(PEHMB)中的一种或多种。一些实例列于表1和2。本发明的任意方面的进入促进剂优选为PHMB或PHMG或两者中任一个的类似物或衍生物。
进入促进剂可以包含聚六亚甲基双胍(PHMB)、聚六亚甲基单胍(PHMG)、聚亚乙基双胍(PEB)、聚四亚甲基双胍(PTMB)、聚亚乙基六亚甲基双胍(PEHMB)、聚亚甲基双胍(PMB)、聚(烯丙基二胍基-共-烯丙胺)、聚(N-乙烯基双胍)、聚烯丙基双胍中的一种或多种的均匀或不均匀混合物。
如本领域普通技术人员众所周知的,化合物可以通过标准程序在实验室合成或可以得自商业供应商。
例如,PHMB还具有同义词聚(六亚甲基)双胍盐酸盐;聚合双胍盐酸盐;聚盐酸己双胍;双胍;CAS号27083-27-8;32289-58-0;IUPAC名称聚(亚氨基酰亚胺羰基)亚氨基六亚甲基盐酸盐。PHMB可以通过标准程序在实验室合成或可以得自供应商,例如Arch(http://www.archchemicals.com/Fed/BIO/Products/phmb.htm)。典型地n=2至40,平均值n为11,平均分子量为3025。PHMB作为杀虫剂出售,例如用于卫生产品、游泳池水处理和伤口敷料。
聚六亚甲基单胍(PHMG)可以通过标准程序在实验室合成或可以得自供应商,例如得自ShanghaiScunderIndustryCo.,Ltd,http://scunder.en.busytrade.com/products/info/683633/PHMG.html。
如本领域普通技术人员所理解的,进入促进聚合物可以是共聚物或杂聚物,即单体可以不是相同的。然而,通常单体单元相同。
抑制抗菌剂抗性的试剂和进入促进剂可以共价连接。可选地,抑制抗菌剂抗性的试剂和进入促进剂可以提供为制剂,例如非共价络合络合物。可以通过将进入促进剂和抑制抗菌剂抗性的试剂以适当的比率并在适当的条件下,例如pH和盐浓度适当的条件下混合来制备制剂。可以例如通过使用等摩尔浓度的载体和货物(cargo)分子,从抑制抗菌剂抗性的试剂比进入促进剂摩尔过量高达100倍开始,到进入促进剂比抑制抗菌剂抗性的试剂摩尔过量高达1000倍来进行该方法。例如,抑制抗菌剂抗性的试剂和进入促进剂的适当的摩尔比可以为1:0.1至1:50或1:0.5至1:1000,例如1:1至1:10或1:5,例如1:1.5左右。抑制抗菌剂抗性的试剂和进入促进剂的适当的重量:重量比可以为1:0.1至1:50或1:0.5至1:1000,例如1:1至1:10或1:5,例如1:1.5左右。以下进一步讨论络合物的形成。
混合/孵育进入促进剂和抑制抗菌剂抗性的试剂的pH可以是高pH,例如10-13.5,如以下进一步讨论的。特别优选的是,当抑制抗菌剂抗性的试剂是核酸时,在高pH下混合/孵育所述试剂。
可选地,混合/孵育进入促进剂和抑制抗菌剂抗性的试剂的pH可以是中性pH,例如6.5至8.6。特别优选的是,当抑制抗菌剂抗性的试剂是肽时,在中性pH下混合所述试剂。适当的孵育条件将由本领域技术人员来确定并且可以根据使用的试剂的确切性质来优化。将选择向细菌细胞提供最有效的递送的条件。在适当的情况下,pH可以是低pH,即小于6。
在一个实施方案中,可以在具有高pH的缓冲液中一起提供进入促进剂和抑制抗菌剂抗性的试剂。因此,用于促进抑制抗菌剂抗性的试剂进入细菌细胞的方法可以包括以下步骤:在进入促进剂的存在下将细菌细胞暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中(均如上所述),其中所述抑制抗菌剂抗性的试剂和进入促进剂已经在高pH下混合或孵育,例如在具有高pH的缓冲液中混合或孵育。术语“高pH”对于本领域技术人员而言是众所周知的并且典型地指9以上的pH,例如9.5以上或10以上,例如10至13.5的pH。典型地,在高pH下混合抑制抗菌剂抗性的试剂和进入促进剂以形成纳米粒子,然后在进入促进剂的存在下将细菌细胞暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中。
在再一个实施方案中,可以在具有中性pH的缓冲液中一起提供进入促进剂和抑制抗菌剂抗性的试剂。因此,用于促进抑制抗菌剂抗性的试剂进入细菌细胞的方法可以包括以下步骤:在进入促进剂的存在下将细菌细胞暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中(均如上所述),其中所述抑制抗菌剂抗性的试剂和进入促进剂已经在中性pH下混合或孵育,例如在具有中性pH的缓冲液中混合或孵育。术语“中性pH”对于本领域技术人员而言是众所周知的并且典型地指7左右的pH,例如6以上或9以下,例如6.5至8.6的pH。可以在中性pH下混合抑制抗菌剂抗性的试剂和进入促进剂以形成纳米粒子,然后在进入促进剂的存在下将细菌细胞暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中。
具体地,如本领域技术人员将理解,认为pH6–13.5的缓冲液(有或没有添加的盐,如在分子生物学缓冲液,例如例如PBS、NaCl或许多其他中常用的)提供具有改进的递送效率的制剂,根据待递送的试剂的性质改变pH。可以用适合的生长培养基以1:1至1:1000稀释所生产的络合物,甚至可以在几个时间点将络合物加入到细胞(重复的多次转染)中以实现更高效率。该程序涉及进入促进剂和抑制抗菌剂抗性的试剂两者用具有中性到高pH的缓冲液单独稀释,并将其混合以形成纳米粒子。关于制剂和非共价混合物的制备和关于成套试剂盒,进入促进剂和抑制抗菌剂抗性的试剂的比率和浓度可以如上所讨论。
本领域技术人员将领会,可以使用例如NaOH或KOH容易地制备高pH缓冲液。当使用典型的络合时间例如30分钟时,这些缓冲条件提供改进的转染效率。因此,可以容易地将高pH缓冲液(和本文所述的进入促进剂)并入研究者当前使用的方案中。
本领域技术人员同样将领会,可以通过使用HCl和/或NaOH或KOH调整任何适当的缓冲液而容易地制备中性pH缓冲液。当使用典型的络合时间例如30分钟时,这些缓冲条件提供了改进的转染效率。因此,可以容易地将中性pH缓冲液(和本文所述的进入促进剂)并入研究者当前使用的方案中。
本发明的又一方面提供了用于制备包含进入促进剂(例如PHMB或PHMG)和抑制抗菌剂抗性的试剂的络合物的方法,所述方法包括在络合缓冲液中孵育进入促进剂和抑制抗菌剂抗性的试剂。根据试剂,络合缓冲液可以为例如中性pH或高pH。例如,在抑制抗菌剂抗性的试剂为肽的情况下,缓冲液可以为中性pH,或当所述试剂为核苷酸时缓冲液可以为高pH。以上讨论了适当的pH缓冲液并且将由技术人员确定每种试剂的最佳缓冲液。据认为,形成了包含进入促进剂(例如PHMB或PHMG)和抑制抗菌剂抗性的试剂例如肽、核酸或其他聚合物或小分子的纳米粒子。抑制抗菌剂抗性的试剂可以为酶抑制剂。具体地,可以通过在与细胞一起使用之前,将如上所述的PHMB和类似分子与肽、核酸或其他聚合物或小分子在适当缓冲液中孵育来实现纳米粒子的形成。适当的孵育缓冲液可以包括水、PBS和实验室中常用的其他缓冲液。高pH缓冲液如上所述。如对于本领域技术人员而言明显的是,最佳缓冲液可能取决于进入促进剂和抑制抗菌剂抗性的试剂两者。典型地,通过在混合两种配偶体分子之前用络合缓冲液稀释这两种配偶体分子来实现纳米粒子形成和细菌细胞递送。另外,典型地在与其他赋形剂或活性成分组合并施用到包括在体内使用的细菌细胞之前来进行两种组分的混合。认为有效的纳米粒子形成发生在数秒或数分钟内,但过程可以进行许多小时。有效的纳米粒子形成的适当比率随不同配偶体组合变化。例如,1-20:1(wt:wt)的PHMB:质粒DNA提供了有效的纳米粒子形成。进一步地,0.1:1(wt:wt)至高达100:1的PHMB:MecA肽提供了有效的纳米粒子形成(等量或过量的载体是优选的并且效果很好)。本领域技术人员将能够评估当使用不同配偶体分子比率时的纳米粒子形成和递送效率。可以以多种方式评估纳米粒子形成。例如,使用动态光散射(DLS)和显微镜方法本领域技术人员将能够评估纳米粒子形成。
本发明的又一方面提供了包含如本文定义的进入促进剂(例如PHMB或PHMG)和抑制抗菌剂抗性的试剂的络合物,其中所述络合物通过以下方法可获得(或获得):在例如高或中性pH,例如在10-13.5的pH下或在6.5至8.6的pH下,在络合缓冲液中孵育进入促进剂和引入的试剂。
优选的是在纳米粒子中包含进入促进剂。纳米粒子的尺寸在亚微米范围内,如在纳米范围内。
抑制抗菌剂抗性的试剂
抑制抗菌剂抗性的试剂可以是使抗菌剂抗性细菌对抗菌剂效果敏感的任何试剂。例如,抑制剂可以结合到细菌内或由细菌产生的、导致对一种抗菌剂或一类抗菌剂有抗性的分子上并使该分子失活。细菌中靶分子可以例如存在于细菌细胞内部、周质空间或细菌细胞壁内部。优选地,抑制抗菌剂抗性的试剂是肽、核酸、另一种聚合物或小分子。所述试剂可以是酶抑制剂。为了避免疑问,酶抑制剂可以是肽或核酸。典型地,酶抑制剂是分子如分子量小于40,000道尔顿的分子。
抑制抗菌剂抗性的试剂可以是肽适体或RNA适体。肽适体可以具有增强其结构稳定性、对pH变化有抗性、对蛋白酶裂解和温度变化有抗性的支架结构,如基于锚蛋白重复蛋白的DARPin支架(CurrOpinDrugDiscovDevel.2007Mar;10(2):153-9.,JMolBiol.2003Sep12;332(2):489-503.),基于人StefinA三突变体的Affimer(Woodman,R.,Yeh,J.T-H.,Laurenson,S.andKoFerrigno,P.Designandvalidationofaneutralscaffoldforthepresentationofpeptideaptamers.JMolBiol352:1118-1133(2005).),或基于化学限制性肽的二环肽(bicyclepeptide)(NatureChemicalBiology5,502-507(2009))。
抑制抗菌剂抗性的肽试剂可以是抗体、抗体片段或两者中任一个的衍生物。因此,抗体、抗体片段或其衍生物可以具体地结合到并抑制或隔离导致或参与抗菌剂抗性细菌机制从而使细菌细胞对抗菌剂敏感的、存在于细菌细胞或细胞壁中或与细菌细胞或细胞壁相关的靶分子(如蛋白质)。所谓“抗体”包括基本上完整的抗体分子,以及嵌合抗体、人源化抗体、人抗体(其中相对于天然存在的人抗体突变至少一个氨基酸)、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同源二聚体和异源二聚体,及其抗原结合片段和衍生物。我们还包括在术语“抗体”和“其抗原结合片段”含义内的抗体及其抗原结合片段的变体、融合体和衍生物。术语“抗体”还包括所有种类的抗体,包括IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。因此,抗体可以是IgG分子,如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子。优选地,本发明的抗体是IgG分子或抗原结合片段,或其变体、融合体或衍生物。更优选地,所述抗体是IgG2分子。抗体或其片段可以包含或由选自以下的抗原结合片段组成:Fv片段、Fab片段和Fab样片段。在再一个实施方案中,Fv片段可以是单链Fv片段或二硫键结合的Fv片段。Fab样片段可以是Fab’片段或F(ab)2片段。设想抗体或其片段是单克隆抗体或衍生自单克隆抗体。用于生成单克隆抗体的方法是本领域众所周知的,并且包括杂交瘤产生或使用重组技术。
小分子试剂可以是抑制细菌细胞中导致或参与抗菌剂抗性细菌机制的靶分子的任何适当的有机分子。因此,该试剂击倒了讨论中的机制并使细菌细胞对讨论中的抗菌剂敏感。
各种不同细菌利用许多不同机制来抵抗被抗菌剂杀灭。根据讨论中的细菌和抗菌剂,不同的机制涉及细菌细胞中不同的蛋白或其他靶标。在下表3至5中提供了对不同种类抗菌药物抗性机制的实例,其还给出了对这些不同种类药物有抗性的细菌的实例。抑制抗菌剂抗性的试剂可以通过参考这些表中的抗菌剂抗性决定因子来选择。Bockstael&VanAerschot(2009)Eur.J.Med.4(2),141-155在第146和147页表2中还描述了抗菌剂抗性决定因子,通过引用将整篇论文和特别是表2并入本文中。
例如,抑制剂可以是结合到mecA基因产物、青霉素结合蛋白2A(PBP2A)、赋予β内酰胺以抗性的改变的青霉素结合蛋白,并抑制其抗菌剂抗性效果的肽。结合到并抑制抗菌剂抗性决定因子如青霉素结合蛋白的肽可以通过凭借肽结合到靶标的能力选择肽的方法来鉴定。这样的方法包括使用噬菌体展示***(参见Willats(2002)PlantMol.Biol.(2002)50,837-854和Moleketal(2011)Molecules16,857-887,通过引用将二者并入本文中)(还参见实施例1)。商业的噬菌体展示文库和***可得自例如NewEnglandBiolabs。实施例1提供了用于制备PBP2a蛋白并且随后鉴定结合到并抑制PBP2a的结合部分的方案。通过这些示例性方法产生的这种结合蛋白可以用于本发明的方法。
可以用于鉴定适合的肽的另外的***是描述于Odegripetal(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2004)101,2806-2810中的CIS展示***,通过引用将其并入本文中。
设想抑制抗菌剂抗性的肽试剂可以是线性的。典型地,肽具有50至400个氨基酸。肽典型地分子量为5.5kDa至40kDa。特别优选的是肽的大小为小于35kDa。
通过进一步举例的方式,抑制剂可以是结合到金属β-内酰胺酶并抑制β-内酰胺酶对肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)NDM-1(也称为blaNDM-1)免疫的核酸,如单链DNA或RNA(参见Schlesingeretal(2011)Pharmaceuticals4,419-428,通过引用将其并入本文)。设想适用于用肽和肽适体靶向的相同靶标也将适用于用RNA或修饰的RNA适体靶向。如结合到抗菌剂抗性决定因子并抑制抗菌剂抗性决定因子的单链DNA和RNA的核酸可以通过使用SELEX(指数富集的配基***进化)技术来鉴定,如Schlesingeretal(2011)Pharmaceuticals4,419-428中描述的,通过引用将其并入本文中;SELEX方法更加详细地描述于Tuerk&Gold(1990)Science249,505-510中,通过引用将其并入本文中。还参见Ellington&Szostak(1990)Nature346,818-822,其描述了体外选择结合特异性配体的RNA分子,通过引用将其并入本文中。典型地,核酸是单链的并且具有100至5000个碱基。
优选的是肽包含序列ID编号1至4中的一个或组合或与其具有相似同源性的任何肽序列。优选的是肽与这些序列ID具有至少80%同源性,更优选地至少90%同源性和最优选地至少95%同源性。
表4.抗微生物剂种类,以及赋予病原体抗性的基因和酶的实例
设想本发明可以涉及以上列出的任意酶或基因产物。
通过再进一步举例的方式,抑制剂可以是如表5所述的酶抑制剂,
如β内酰胺抑制剂或外排泵抑制剂或氨基糖苷激酶抑制剂。克拉维酸或其盐是不可逆地结合到某些β-内酰胺酶的活性位点的适合的酶抑制剂。
表5抗微生物剂抗性机制和可以抑制抗药性的化合物
设想表5中列出的任何抑制剂可以用于本发明的方法、组合物、试剂盒和用途中。
特别优选的是肽或核酸结合到并抑制选自PBP2a、blaNDM-1或Vim2的抗菌剂抗性决定因子。
优选的是本发明的进入促进剂是聚六亚甲基双胍(PHMB)或聚六亚甲基胍(PHMG)或两者中任一个的类似物或衍生物。
要使其对抗菌剂敏感并且其随后可以被抗菌剂杀灭的本发明任意方面中的细菌可以是革兰氏阴性、革兰氏阳性的或可以是分支杆菌。所述细菌可以来自肠杆菌科,或其可以是葡萄球菌(Staphylococcus)或链球菌(Steptococcus)或可以来自肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、诺卡氏菌属(Nocardia)、分支杆菌属(Mycobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、埃希式杆菌属(Escherichia)、弯曲菌属(Campylobacter)。细菌典型地为以下中的一个:肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、豚鼠耳炎诺卡菌(Nocardiaotitidiscaviarum)、结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、如肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilusunfluenzae)、脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)。
本发明的任意方面的细菌可以对选自以下的一种或多种抗菌剂有抗性:阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、醋竹桃霉素、罗红霉素、螺旋霉素、氨曲南、亚胺培南/西司他丁、美罗培南、厄他培南、多利培南、帕尼培南/倍他米隆、比阿培南、PZ-601、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布坦、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、地美环素、多西环素、米诺环素、氧四环素、四环素、杆菌肽、粘菌素、多粘菌素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星和曲伐沙星。
在本发明的任意方面的实施方案中,细菌是选自以下的多药耐药(MDR)菌株:绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)、斯氏普罗威登斯菌(Providenciastuartii)或鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii),所述菌株对选自以下的一种或多种抗菌剂有抗性:环丙沙星、美罗培南、头孢他啶、氨曲南、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、螺旋霉素、氧四环素和亚胺培南/西司他丁。在再一个实施方案中,所述细菌是对苯唑西林有抗性的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。
设想所述细菌可以是临床菌株或临床分离物。
本发明的方法适于其中细菌存在于人或动物中的情形并且该方法用于对抗人或动物的细菌感染。因此,本发明包括治疗感染抗菌剂抗性细菌的人或动物的方法,其中将有效量的与进入促进剂和抗菌剂组合的抑制抗菌剂抗性的试剂给予人或动物。
因此,本发明还包括,有效量的与进入促进剂和抗菌剂组合的抑制抗菌剂抗性的试剂用于治疗感染抗菌剂抗性细菌的人或动物。
本发明还包括有效量的与进入促进剂和抗菌剂组合的抑制抗菌剂抗性的试剂在制备用于治疗感染抗菌剂抗性细菌的人或动物的药物中的用途。
所述药物可以进一步包含如以下进一步阐述的药学上可接受的赋形剂、佐剂、稀释剂或载体。
设想抑制抗菌剂抗性的试剂可以用于与进入促进剂同时或顺序给药或给予,以及视情况并以由医师确定的方式与抗菌剂同时或顺序给药或给予(administrationoradministered)。视情况,可以将抑制抗菌剂抗性的试剂、进入促进剂和抗菌剂配制在一起或分别配制。
典型地,细菌感染是选自以下的内部或外部身体表面的细菌感染:口腔、生殖道、泌尿道、呼吸道、胃肠道、腹膜、中耳、***、血管内膜、眼(包括结膜或角膜组织)、肺组织、心脏瓣膜、皮肤、头皮、指甲、伤口内部的表面,或肾上腺、肝脏、肾脏、胰腺、垂体、甲状腺、免疫***、卵巢、睾丸、***、子宫内膜、眼睛、乳腺、脂肪、上皮、内皮、神经、肌肉、肺、真皮、表皮或骨组织的表面;或选自以下的体液中的细菌感染:血液、血浆、血清、脑脊液、GI道内容物、唾液、肺分泌物和***;或选自以下的身体组织中或身体组织上的细菌感染:肾上腺、肝脏、肾脏、胰腺、脑、心脏、垂体、甲状腺、免疫***、卵巢、睾丸、***、子宫内膜、眼睛、乳腺、脂肪、上皮、内皮、神经、肌肉、肺、真皮、表皮和骨组织。
设想待使用本发明的方法、组合物/制剂和用途治疗的患者是感染、疑似感染或有感染单药或多药抗性细菌的风险的患者。
设想待使用本发明的方法、组合物/制剂和用途治疗的人或动物患者可以具有预先建立的感染,其可以是免疫***受损患者、经历重症监护或急救护理的患者、遭受外伤的患者、具有烧伤的患者、具有急性和/或慢性伤口的患者、新生儿患者、老年患者、癌症患者、患自身免疫病症的患者、具有上皮或内皮分泌物减少或废除和/或分泌物清除的患者,或装有医疗装置的患者。当然,所述方法和组合物/制剂可以用于治疗感染抗菌剂抗性细菌的任何患者。
应理解,可以期望鉴定引起感染的细菌的类型并且可以期望鉴定细菌的抗菌剂抗性的性质。因此,本发明包括对抗如以上讨论的人或动物的抗菌剂抗性细菌感染的方法,所述方法进一步包括:(a)鉴定细菌的类型和细菌的至少一个抗菌剂抗性决定因子的性质,(b)选择抑制所确定的抗菌剂抗性的试剂,(b)借助所鉴定的抗菌剂抗性决定因子选择细菌对其有抗性的抗菌剂和(c)在进入促进剂存在的情况下将所述抑制所鉴定的抗菌剂抗性的试剂和抗菌剂给药至人或动物。
细菌病原体的性质的鉴定可以通过任何适合的方法来确定,如通过细菌培养技术和***发生(phylogeny)来确定。优选的是利用分子技术来描述细菌病原体的特征,如通过使用DNA微阵列。通过DNA微阵列鉴定和表征引起血流感染的细菌病原体的实例描述于(2006)J.Clin.Microbiol.44(7),2389-2397中,通过引用将其并入本文中。该论文还描述了抗菌剂抗性的确定。可以通过敏感性测试在表型上确定抗菌剂抗性细菌的抗菌剂抗性决定因子的性质,但优选的是使用分子技术如基于微阵列的检测。在Perretenetal(2005)J.Clin.Microbiol.43,2291-2302中描述了革兰氏阳性菌的90个抗菌剂抗性基因的基于微阵列的检测,通过引用将其并入本文中。
应理解,可以鉴定超过一种类型的细菌并且可以鉴定超过一种类型的细菌抗性。还应理解,可以期望使超过一种类型的细菌敏感并随后杀灭超过一种类型的细菌。因此,本发明的方法包括鉴定、使对抗菌剂敏感和使用适当的抗菌剂杀灭超过一种类型的细菌的可能性。
在本发明的第一和第二方面,优选的是在进入促进剂存在的情况下,将细菌暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中并使细菌暴露于抗菌剂中同时进行。便利地,例如,进入促进剂、抑制抗菌剂抗性的试剂和抗菌剂存在于相同的组合物中。还便利地,进入促进剂、抑制抗菌剂抗性的试剂和抗菌剂存在于使细菌暴露于其中的纳米粒子中。便利地,给予细菌感染的人或动物纳米粒子以对抗感染。纳米粒子可以包含在稀释液或载体中或使用其他药物赋形剂呈现。
本发明的方法不限于存在于人或动物体身体内或身体上的细菌。因此,在一个实施方案中,细菌存在于人或动物体外,如存在于无生命物质内或无生命物质上或存在于无生命表面上,并且所述方法可以用于使细菌敏感并杀灭细菌作为消毒方案的部分,如在医院病房中。因此,本发明的试剂可以以适合的液体(即含水或其他溶剂)、气体或固体形式提供用作消毒剂。可以以任何适当的方式如以液体、薄雾、喷雾、蒸汽、粉末或晶体形式或如本领域技术人员所理解的任何其他适合的形式给予这制剂。因此,本发明包括这样的制剂。
在又一个方面,本发明提供了包含进入促进剂和抑制抗菌剂抗性的试剂的组合物/制剂。适合的试剂是以上关于早些方面提供的那些。
在再一个方面,本发明提供了包含进入促进剂和抑制抗菌剂抗性的试剂的组合物/制剂用于对抗人或动物的抗菌剂抗性细菌感染。此外,适合的试剂是以上关于早些方面提供的那些。
在前述方面的实施方案中,可以对人或动物给予抗菌剂。事实上,组合物/制剂可以进一步包含抗菌剂。所述抗菌剂可以是以上列出的任何抗菌剂。
本发明前述方面的组合物可以再进一步包含药学上可接受的赋形剂、佐剂、稀释剂或载体。
“药学上可接受的”包括制剂是无菌的且不含病原体。适合的药物载体是药学领域中众所周知的。载体(或多种载体)必须是在与本发明的试剂相容的意义上可接受的并且对其受体无害。典型地,载体会是无菌且不含病原体的水或盐水;然而,可以使用其他可接受的载体。
可以将本发明的药物组合物/制剂配制为用于经静脉内、肌内、皮下、口腔、直肠、***、鼻腔、眼部或局部递送到人或动物患者。如本领域技术人员所理解的,根据要对抗的细菌感染的位置和严重程度来选择给药途径和制剂。
优选地,本发明的药物组合物/制剂是含有活性成分(或多种活性成分)的每日剂量或单位,每日亚剂量或其适当分数的单位剂量。
本发明的药物组合物/制剂正常地将以以下形式口服给药或通过任何胃肠外途径给药,所述形式为包含活性成分(或多种活性成分)的药物制剂形式,任选地为无毒的有机或无机酸或碱、加成盐形式,药学上可接受的剂量形式。根据感染和待治疗的患者以及给药途径,可以以不同剂量给予组合物。
在人的治疗中,本发明的药物组合物/制剂可以单独给药,但一般以与关于想要的给药途径和标准药物实践选择的适合的药物赋形剂、稀释剂或载体的混合物给药。
例如,本发明的药物组合物/制剂可以以可能包含调味剂或着色剂的用于即释、缓释或控释应用的片剂、胶囊剂、胚珠(ovule)、丹药(elixir)、溶液或悬浮液的形式,经口服、颊部或舌下给药。本发明的药物组合物/制剂还可以经***海绵体内注射给药。
这类片剂可以包含:赋形剂,如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸;崩解剂,如淀粉(优选地玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复杂的硅酸盐;以及造粒粘合剂,如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟基丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和***树胶。此外,可以包含润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。
相似类型的固体组合物还可以用作明胶胶囊中的填料。在这点上,优选的赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milksugar)、或高分子量聚乙二醇。对于含水悬浮液和/或丹药,可以将本发明的化合物与甜味剂或调味剂、着色物质或染料组合,与乳化剂和/或悬浮剂组合以及与稀释剂如水、乙醇、丙二醇和甘油组合,以及它们的组合。
本发明的药物组合物/制剂还可以经胃肠外给药,例如经静脉内、动脉内、腹腔内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌内或皮下给药,或其可以通过输注技术给药。它们可以以包含其他物质例如足够的盐或葡萄糖,以使溶液与血液等渗的无菌含水溶液形式最好地使用。如果必要,应适当地缓冲含水溶液(优选地缓冲至3至9的pH)。通过本领域技术人员众所周知的标准药物技术容易地实现在无菌条件下制备适合的胃肠外制剂。
适用于胃肠外给药的制剂包括含水和无水的无菌注射溶液,其可能含有赋予所述制剂与想要的受体的血液等渗的抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质;和含水和无水的无菌悬浮液,其可能包含悬浮剂和增稠剂。制剂可以提供在单位剂量或多剂量容器中,例如密封的安瓿和小瓶中,并且可以储存在仅需要在使用前即刻添加无菌液体载体例如注射用水的冷冻干燥(冻干)条件下。可以由之前所述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时的注射溶液和悬浮液。
本发明的药物组合物/制剂也可以经鼻内或通过吸入给药并且便利地以如下的形式递送,即干粉吸入剂(drypowderinhaler)形式,或由加压的容器、泵、喷雾装置(spray)或喷雾器(nebuliser)提供并使用适合的推进剂,如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA134A3或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA227EA3)、二氧化碳或其他适合的气体的气雾喷雾剂(aerosolspray)形式。在加压的气雾剂的情况下,可以通过提供用于递送计数的量的管来确定剂量单位。加压的容器、泵、喷雾装置或喷雾器可以包含活性化合物的溶液或悬浮液,如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂,其可以另外包含润滑剂,如三油酸山梨坦。可以将用于吸入器或吹药器的胶囊和笔芯(cartridge)(例如由明胶制备)配制成包含本发明的药物组合物/制剂和适合的粉末基底(powderbase)如乳糖或淀粉的粉末混合物。
优选地这样配置气雾剂或干粉制剂,使得每个计量的剂量或“泡芙(puff)”包含至少1mg的本发明的药物组合物/制剂,用于递送至患者。要理解的是具有气雾剂的全天剂量随患者而不同,并且可以以单次剂量或,通常用全天分开剂量的多次剂量给药。
可选地,本发明的药物组合物/制剂可以以栓剂或子宫帽形式给药,或其可以以洗剂、溶液、霜剂、软膏或撒布剂(dustingpowder)形式局部施用。本发明的化合物还可以经透皮给药,例如通过使用皮肤贴给药。其还可以通过眼部途径给药,特别地用于治疗眼部疾病。
对于眼科使用,可以将本发明的药物组合物/制剂配制为微粒化悬浮液的等渗、调节pH的无菌盐水溶液,或优选地配制为溶液的等渗、调节pH的无菌盐水溶液,优选地与防腐剂如苯扎氯铵组合。可选地,可以将其配制在软膏如凡士林(petrolatum)中。
对于局部施用到皮肤,可以将本发明的药物组合物/制剂配制为包含悬浮或溶解在例如与以下中的一种或多种的混合物中的活性化合物的适合的软膏:矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可选地,可以将其配制为悬浮或溶解在例如与以下中的一种或多种的混合物中的适合的洗剂或霜剂:矿物油、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、十六醇酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
适用于在口部局部给药的制剂包括锭片(lozenge),其包含在调味基底中,通常是蔗糖和***树胶或黄芪胶中的活性成分;锭剂(pastille),其包含在惰性基础如明胶和甘油或蔗糖和***树胶中的活性成分;和漱口剂,其包含在适合的液体载体中的活性成分。
一般地,对于人,本发明的药物组合物/制剂的口服或局部给药是最便利的优选途径。在其中口服给药之后受体遭受吞咽障碍或药物吸收损害的情况下,可以经胃肠外给药,例如经舌下或颊部给药。
对于兽用,根据正常的兽医规范将本发明的药物组合物/制剂作为适合的可接受的制剂给药,并且兽医将确定对于特定动物最适当的给药方案和给药途径。
优选的是患者是人,但患者可以是可从治疗受益的任何其他哺乳动物。例如,患者可以是小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、山羊、绵阳、猴子或猿。
本文所使用的“治疗有效量”、或“有效量”,或“治疗有效的”是指针对给定条件和给药方案提供治疗效果的量。这是计算用于产生期望的治疗效果的活性化合物与所需的添加剂和稀释剂即载体或给药溶媒联合而预先确定的量。此外,旨在指足以降低或预防宿主的活性、功能和应答的临床显著缺陷(deficit)的量。可选地,治疗有效量是足以引起宿主例如哺乳动物的临床显著病症的改进。
本发明还提供了包括多种抑制抗菌剂抗性的药剂的成套试剂盒。所述成套试剂盒还包括用于鉴定细菌的装置和/或用于鉴定细菌中抗菌剂抗性决定因子的装置。这样的装置可以是以上关于早些方面阐述的那些。
所述成套试剂盒还可以包括一种或多种抗菌剂。适合的抗菌剂可以是以上关于早些方面列出的那些。
本发明的成套试剂盒还可以包括进入促进剂,优选地进入促进剂与抑制抗菌剂抗性的试剂组合。适合的试剂是以上关于早些方面列出的。
现将通过参考以下附图和非限制性实例更详细地描述本发明。
图1:在不同浓度的苯唑西林下的PHMB和MecA肽的FIC指数。
图2:实施本发明的长期战略眼光。
实施例1:重组PBP2a的产生和适用于抑制PBP2a的结合试剂的选择。
PBP2a的产生
截短的mecA基因的克隆。使用MRSA(ATCC3300)的染色体DNA作为PCR的模板。基于从美国生物技术信息中心公布的mecA序列设计引物并且引物为正向引物5_-PBP2a-EcoRI,BamHI(5_-GGATCCGAATTCCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCATGGCTTCAAAAGATAAA-3_)(序列ID编号7)和反向引物3_-PBP2a-XhoI,HindIII(5_-AAGCTTCTCGAGTTATTCATCTATATCGTA-3_)(序列ID编号8)。设计引物使得N端的前23个氨基酸缺失。凝胶纯化所产生的DNA片段(_2kb),然后根据制造商的方案通过使用凝胶纯化试剂盒(Invitrogen)进行纯化。使用T4连接酶将基因连接到pGEM-T载体(Promega,Madison,WI)上,并转化到感受态XL1-Blue细胞中。通过使用T7和SP6启动子引物对pGEM-T载体上的mecA基因进行测序。使用相同的限制性酶(EcoRI和XhoI)酶切经验证的***DNA和pGEX-4T1载体(GEHealthcare,Piscataway,NJ),然后连接在一起以生成表达载体pGEX-PBP2a。
PBP2a表达。将重组载体pGEX-PBP2a转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Invitrogen)中用于蛋白质表达。使细胞在37℃下,在包含100_g/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani肉汤中生长,直到培养物达到600nm下0.6的最佳密度。在冰浴中冷却培养物10min,然后将其置于18℃下的振荡器中,并通过添加0.5mMIPTG(异丙基-_-D-硫代半乳糖苷)来诱导蛋白质表达。然后,使细胞在18℃下,在震荡下生长过夜(16h),之后通过在4℃下离心收获细胞。对于大规模生产,使用各自包含350ml培养物的三个1-升烧瓶。
GST-PBP2a纯化。所有的纯化步骤均在4℃下进行。将细菌细胞沉淀物(pellet)重悬浮在60ml冰冷裂解缓冲液(40mMNa2HPO4、10mMKH2PO4、300mMNaCl[pH7.4])中。使用微流化器(型号M100L;Microfluidics,Newton,MA)裂解细菌细胞。以30,000_g离心细菌提取物30min,收集上清液并再旋转20min,再次收集上清液并在-80℃下冷冻储存。按照制造商的说明将GST-PBP2a融合蛋白在GST树脂(GenScript目录号L00206)上进行纯化。
GST标记的裂解。使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)重构凝血酶(GEHealthcare,目录号27-0846-01)以得到1U/_l的终溶液。将小份储存在-80℃下。为了从纯化的GST-PBP2a裂解谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标记,使用70U的凝血酶,在4℃下处理5mgGST-PBP2a过夜。使用SDS-PAGE证实裂解。通过使游离GST标记和未裂解的GST-PBP2a通过如上所述的GST树脂而将其从裂解产物PBP2a中去除。经纯化的无标记PBP2a通过溢流道(flowthrough)中的柱,而保留GST和GST-PBP2a。收集小部分,通过SDS-PAGE分析纯度并通过Bradford测定分析蛋白浓度,然后浓缩。
可选地,PBP2a蛋白可以购自Sunny实验室,目录号P555。
抑制PBP2a的表征。对于抑制剂筛选,使用亲和标记将重组表达和纯化的PBP2a固定到微滴定板孔的表面。然后使孔与肽适体或事实上任何可能的PBP2a抑制剂的系列稀释溶液,加PBP2a底物如BIO-AMP(Bobbaetal.2011),在PBS中的固定浓度下孵育。在大约15min之后,停止结合反应,并如上所述(Bobbaetal.2011)使板显色。从对照反应减去荧光的背景水平,然后计算抑制剂结合数据并绘图以确定结合的Kiapp。
参考文献-SudheerBobba,V.K.ChaithanyaPonnaluri,MridulMukherjiandWilliamG.Gutheil*MicrotiterPlate-BasedAssayforInhibitorsofPenicillin-BindingProtein2afromMethicillin-ResistantStaphylococcusaureus.Antimicrob.AgentsChemother.June2011vol.55no.62783-2787
用于筛选靶分子(如PBP2a)结合配偶体的适合的噬菌体展示方案。
材料
·(ThermoScientificPierce,目录号21441)
·DMSO(二甲亚砜)(Sigma-Aldrich,目录号D8418)
·PBS(磷酸盐缓冲盐水)(137mMNaCl;10mM磷酸盐;2.7mMKCl;pH7.4)
·PBST(PBS+0.1%Tween-20)
·自旋脱盐柱,7KMWCO(ThermoScientificPierce,目录号89882/89883)
·Nunc-ImmunoTMMaxiSorpTM条(ThermoScientific,目录号469949)
·10x封闭缓冲液(Sigma,目录号B6429)
·高灵敏度链霉亲和素-HRP(ThermoScientificPierce,目录号21130)
·TMB(Seramun,目录号S-001-TMB)
·ER2738大肠杆菌细胞
·2TY培养基(每升:10g酵母提取物;16g胰蛋白胨;5gNaCl)
·盐酸四环素(12mg/ml,在70%乙醇溶液中)
·涂覆的链霉亲和素(HBC)8-孔条(ThermoScientificPierce,目录号15501)
·0.2M甘氨酸,pH2.2
·1MTris-HCl,pH9.1
·三乙胺(Sigma-Aldrich,目录号T0886)
·1MTris-HCl,pH7
·含有100μg/ml羧苄青霉素的LB琼脂平板
·羧苄青霉素(500x储备液:50mg/ml,在ddH2O溶液中)
·M13K07辅助噬菌体
·卡那霉素(500x储备液:25mg/ml,在ddH2O溶液中)
·PEG-NaCl沉淀溶液(20%(w/v)PEG8000,2.5MNaCl)
·TE(10mMTris;1mMEDTA;pH8.0)
·甘油(Sigma-Aldrich,目录号G6279)
·Eppendorf管(Eppendorf,目录号0030108.116)
·链霉亲和素珠(MyOneTM链霉亲和素T1,10mg/ml)(Invitrogen目录号656.01/656.02)
·深孔96平板(ThermoScientific,目录号95040450)
·KingFisher(200ul)96平板(ThermoScientific,目录号97002540)
·中和亲和素涂覆的(HBC)8-孔条(ThermoScientificPierce,目录号15508)
·DTT(二硫苏糖醇)
方法
第一轮淘选
步骤1:使靶蛋白与生物素交联
1.在打开之前将NHS-SS-生物素(ThermoScientificPierce,目录号21441)的小瓶平衡至室温。使用前即刻制备5mg/mlNHS-SS-生物素的DMSO溶液(如100μl的DMSO中0.5mg的NHS-SS-生物素)。
2.将适当体积的NHS-SS-生物素溶液加入到蛋白质中-如对于12KDa蛋白质,将5μl的1mg/ml溶液加入到总体积为50μl的PBS(或对于疏水性蛋白质为PBST)中的0.4μl的NHS-SS-生物素中。调节蛋白质的体积以根据其分子量(MW)加入-即具有较低MW的蛋白质加入较少,而具有较高MW的蛋白质加入较多。
3.在室温下孵育1小时。
4.使用Zeba自旋脱盐柱,7KMWCO(ThermoScientificPierce,目录号89882/89883),按照制造商的说明脱盐以去除任何剩余的生物素。
5.等分并储存在4℃下。
步骤2:ELISA以检查生物素化
1.将50μl每孔的PBS等份分到Nunc-ImmunoTMMaxiSorpTM条(ThermoScientific,目录号469949)。
2.加入1、0.1和0.01μl的生物素化蛋白质-即对于0.1μl加入1μl的1:10稀释液,对于0.01μl加入1μl的1:100稀释液。
3.在4℃下孵育过夜。
4.在平板洗涤器上用300μl每孔的PBST清洗3次
5.等分250μl每孔的10x封闭缓冲液(Sigma,目录号B6429)并在37℃下孵育3小时。
6.在平板洗涤器上用300μl每孔的PBST清洗3次。
7.将高灵敏度链霉亲和素-HRP(ThermoScientificPierce,目录号21130)用2x封闭缓冲液(Sigma10x封闭缓冲液dilutedinPBST)以1:1000稀释并等分至50μl每孔。
8.在振动台振荡器(HeidolphVIBRAMAX100;速度设定3)上室温下孵育1小时。
9.在平板洗涤器上用300μl每孔的PBST清洗6次。
10.等分50μl每孔的TMB(快速TMB/底物溶液,Seramun,目录号S-001-TMB)并允许显色。(注意,允许平板显色的时间量。)
11.测量620nm下的吸光度。
步骤3:设置链霉亲和素平板和ER2738大肠杆菌细胞,并进行噬菌体展示
1.将ER2738大肠杆菌细胞菌落挑选到5ml的具有12μg/ml四环素的2TY培养基中并在37℃,225rpm的转式培养箱中孵育过夜。
2.将300μl每孔的2x封闭缓冲液等分到链霉亲和素涂覆的(HBC)8-孔条(ThermoScientificPierce,目录号15501)中并在37℃下(在不搅拌的情况下)孵育过夜-每种靶蛋白总共设置4个孔(3个孔用于预淘选噬菌体,1个孔用于结合靶蛋白和淘选噬菌体)。
3.在平板洗涤器上用300μl每孔的PBST清洗3次。
4.等分100μl每孔的2x封闭缓冲液并将2.5μl的生物素化蛋白质加入到待用于淘选的孔中。
5.在振动台振荡器(HeidolphVIBRAMAX100;速度设定3)上室温下孵育2小时-同时开始预淘选噬菌体。
6.从第一预淘选孔中去除缓冲液并加入100μl的2x封闭缓冲液。向该孔中加入5μl的表达选择的支架肽的优选肽展示噬菌体文库,即DARPIn、Affimer、线性(linear)。混合并在振动台振荡器(HeidolphVIBRAMAX100;速度设定3)上孵育40min。
7.从第二预淘选孔中去除缓冲液并将含有噬菌体的缓冲液从第一预淘选孔转移到第二预淘选孔中。孵育40min,然后针对第三预淘选孔重复此过程。
8.使用多通道移液器,用200μl每孔的PBST清洗6次,孔含有靶蛋白。
9.将噬菌体从预淘选孔转移到含有靶蛋白的孔中并在振动台振荡器(HeidolphVIBRAMAX100;速度设定3)上室温下孵育2小时。
10.同时,通过将培养物以大约1:15稀释并在37℃、225rpm下孵育大约1小时以得到0.6的A600来设置ER2738细胞的新鲜培养物。
11.在平板洗涤器上,用300μl每孔的PBST清洗淘选孔6次
12.通过加入100μl的0.2M甘氨酸,pH2.2和室温下孵育10min来洗脱噬菌体。
13.通过加入15μl的1MTris-HCl,pH9.1中和。混合并立即加入到50mlfalcon管中的ER2738细胞的8ml等分小份中。
14.使用986μlPBS稀释14μl的三乙胺(Sigma-Aldrich,目录号T0886)。
15.通过加入100μl经稀释的三乙胺并在室温下孵育6min洗脱任何剩余的噬菌体。
16.通过加入50μl的1MTris-HCl,pH7下中和。混合并立即加入到ER2738细胞中。
17.在37℃下孵育细胞(无振动或以低速振动,最大90rpm)。
18.将1μl噬菌体感染的大肠杆菌K12ER2738细胞平铺在含有100μg/ml羧苄青霉素的LB琼脂平板上-在37℃下孵育过夜。
19.以3,000xg离心剩余的细胞5min从而以更小的体积重悬浮并平铺在含有100μg/ml羧苄青霉素的LB琼脂平板上–在室温下孵育过夜。
20.第二天,计数包含1μl细胞的平板上的菌落-乘以8,000以确定每8ml细胞的总数(应为0.5–2x106)。
21.从剩余的平板上刮掉细胞。为此,将5ml的2TY培养基+100μg/ml羧苄青霉素加入平板,使用一次性塑料分离器(spreader)刮掉,转移到50mlfalcon管中并混合。加入另外2ml的2TY培养基+100μg/ml羧苄青霉素以刮掉任何剩余细胞。
22.测量1:10稀释的600nm下的吸光度以确定25ml培养物需要的稀释度在A600为0.2。
23.在125ml玻璃烧瓶中用2TY培养基+100μg/ml羧苄青霉素稀释细胞。
24.在37℃以230rpm孵育1小时。
25.加入1μl的M13K07辅助噬菌体(滴度计算1014/ml)并在37℃,90rpm下孵育30min。
26.加入50μl的卡那霉素(25mg/ml)并在25℃,170rpm下在转式培养箱中孵育过夜。
27.将噬菌体感染的培养物转移到50mlfalcon管中并以3,500xg离心10min。
28.去除500μl含有噬菌体的上清液用于第二轮淘选。
29.将剩余的上清液转移到新鲜管中并加入6ml的PEG-NaCl沉淀溶液(20%(w/v)PEG8000,2.5MNaCl)。在4℃下孵育2小时。
30.以5,000xg离心20min以沉淀噬菌体。
31.倒出上清液(将管在薄纸上吸干以去除所有上清液)并用1ml的TE重悬浮沉淀物。
32.转移到微量离心管中并以16,000xg离心10min。上清液包含噬菌体。在4℃下储存或对于长期储存,用40-50%甘油稀释并在-80℃下储存。
第二轮淘选
1.将ER2738大肠杆菌细胞菌落挑选到5ml具有12μg/ml四环素的2TY培养基中并在37℃,225rpm下孵育过夜。
2.使用磁体,用500μl的2x封闭缓冲液清洗20μl的链霉亲和素珠(MyOneTM链霉亲和素T1,10mg/ml,Invitrogen目录号656.01/656.02),每靶蛋白3次。
3.每20μl的链霉亲和素珠(或200μl最小体积)重悬浮到100μl的2x封闭缓冲液并在StuartSB2定速型旋转器(20rpm)上室温下孵育过夜。
4.以1,000xg离心1min,将链霉亲和素珠固定在磁体上并去除封闭缓冲液。
5.替换为新鲜的2x封闭缓冲液,以每20μl的链霉亲和素珠100μl封闭缓冲液重悬浮。
6.预淘选噬菌体:将125μl来自第一轮淘选的含有噬菌体的上清液与125μl的2x封闭缓冲液混合并加入50μl预封闭的链霉亲和素珠–使用EppendorfProteinLoBindTubes(Eppendorf,目录号0030108.116)。在旋转器上室温下孵育4小时。
7.同时,将靶标结合到链霉亲和素珠:将2.5μl的生物素化靶蛋白加入到200μl的2x封闭缓冲液和50μl预封闭的链霉亲和素珠中。在StuartSB2旋转器上室温下孵育4小时。
8.同时,预封闭用于KingFisherFlex(ThermoScientific)的平板:
a.用1ml每孔的2x封闭缓冲液预封闭深孔96平板(ThermoScientific,目录号95040450)中足够的孔–这将用于淘选。
b.用300μl每孔的2x封闭缓冲液预封闭两个KingFisher(200ul)96平板(ThermoScientific,目录号97002540)中足够的孔-一个将用于使用甘氨酸洗脱,另一个用于使用三乙胺洗脱。
在37℃下封闭4小时。
9.使用950μl每孔的2x封闭缓冲液制备在4x深孔96平板中足够的孔-这些将用于KingFisher方案中的清洗步骤。从预封闭的洗脱平板中去除缓冲液。pH2.2下等分100μl每孔的0.2M甘氨酸到一个平板上。用986μl的PBS稀释14μl的三乙胺并等分100μl每孔到其他平板上。从预封闭的深孔96平板中去除缓冲液。
10.以1,000xg离心包含预淘选的噬菌体和生物素化靶标的管1min并置于磁体上。
11.用500μl的2x封闭缓冲液清洗含有生物素化靶蛋白的珠3次。
12.将含有噬菌体的上清液转移到含有生物素化靶蛋白的珠中并重悬浮。转移到预封闭的深孔96平板上。
13.同时,通过以大约1:15稀释过夜的培养物并在37℃,225rpm下孵育大约1小时来设置ER2738细胞的新鲜培养物。
14.方案将用甘氨酸洗脱10min。一完成,其就通过加入15μl的1MTris-HCl中和,pH9.1。混合并加入到ER2738细胞的8ml等分小份中。
15.方案将用三乙胺洗脱6min。一完成,其就通过加入50μl的1MTris-HCl中和,pH7。混合并加入到ER2738细胞中。
16.在37℃下孵育细胞1小时(无振动或以低速振动,最大90rpm)。如上对于第一轮淘选,步骤17-31铺板并制备噬菌体。
第三轮淘选
1.将ER2738大肠杆菌细胞菌落挑选到5ml的具有12μg/ml四环素的2TY培养基中并在37℃,225rpm下孵育过夜。
2.将300μl每孔的2x封闭缓冲液等分到中和亲和素涂覆的(HBC)8-孔条(ThermoScientificPierce,目录号15508)中并在37℃下孵育过夜-对于每种靶蛋白设置6个孔(4个孔用于预淘选噬菌体,一个用于针对靶蛋白淘选,和一个阴性对照用于针对空白孔淘选)。
3.在平板洗涤器上用300μl每孔的PBST清洗3次
4.将100μl每孔的2x封闭缓冲液等分到待用于淘选的孔中(例如用于针对靶蛋白淘选,和一个阴性对照用于针对空白孔淘选)。将2.5μl的生物素化蛋白质加入到待用于针对靶蛋白淘选的孔中。在振动台振荡器(HeidolphVIBRAMAX100;速度设定3)上室温下孵育4小时。
5.同时,开始预淘选噬菌体:将20μl的10x封闭缓冲液等分到第一预淘选孔中并加入200μl来自第二轮淘选的含有噬菌体的上清液。在振动台振荡器(HeidolphVIBRAMAX100;速度设定3)上室温下孵育1小时。用200μl每孔的2x封闭缓冲液装满剩余的预淘选孔。
6.从第二预淘选孔中去除缓冲液并将第一淘选孔的内容物预转移到第二预淘选孔中。孵育另外一小时并针对第三和第四预淘选孔重复此过程。
7.同时,通过以大约1:15稀释过夜的培养物并在37℃,225rpm下孵育大约1小时来设置ER2738细胞的新鲜培养物。
8.用PBST清洗(手动)含有靶蛋白的孔和阴性对照空白孔3次。
9.将来自预淘选孔的100μl每孔的噬菌体转移到含有靶蛋白的孔和阴性对照空白孔中。在振动台振荡器(HeidolphVIBRAMAX100;max.速度设定3)上室温下孵育30-45min。
10.在平板洗涤器上用300μl每孔的PBST清洗6次。
11.通过加入100μl的100mMDTT并在室温下孵育20min洗脱噬菌体。
12.加入到8mlER2738细胞的等分小份中。
13.在37℃下孵育1小时(无振动或以低速振动,最大90rpm)。如上对于第一淘选轮,步骤17-31铺板并制备噬菌体。
实施例2:使用MecA抑制肽和PHMB使MRSA对苯唑西林敏感
mecA编码蛋白质青霉素结合蛋白2A(PBP2A)并导致对β-内酰胺抗菌剂如甲氧西林、青霉素、苯唑西林、红霉素和四环素的细菌抗性。青霉素结合蛋白(PBP)对于细菌细胞壁合成是必要的。PBP已经显示催化多个反应,所述反应涉及从脂质中间体合成交联的肽聚糖并介导从肽聚糖前体去除D-丙氨酸的过程。PBP由于其在化学结构上与形成肽聚糖的模块化部件类似因此结合β-内酰胺抗菌剂。当其结合到青霉素时,β-内酰胺的酰胺键断裂,在PBP活性位点与起催化作用的丝氨酸残基形成共价键。这是不可逆反应并使酶失活。如上所阐述的,通过对β-内酰胺抗菌剂具有低亲和力的PBP的过量生产和PBP的形成,已经产生对β-内酰胺抗菌剂的抗性。PBP2A对β-内酰胺抗菌剂具有低亲和力。因此,mecA的表达降低了β-内酰胺抗菌剂的效力并使细菌制备细胞壁成分不受阻碍。
最常见的已知mecA载体是甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(MRSA)。其也在许多其他细菌菌种中发现,如如肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)菌株。在葡萄球菌属菌种(Staphylococcusspecies)中,mecA散布在SCCmec遗传元件上。
以下实验例证了本发明的方法。使用示例性的本发明的进入促进剂与抑制抗菌剂抗性的试剂和抗菌剂(苯唑西林)的组合使MRSA菌株对苯唑西林敏感。示例性的进入促进剂是PHMB。示例性的抑制抗菌剂抗性的试剂是MecA(即PBP2A结合肽)结合肽MecA3136、MecA3140、HIW和E1。这些肽是基于StefinA支架(参见Woodman,etal(2005)Designandvalidationofaneutralscaffoldforthepresentationofpeptideaptamers.JMolBiol352:1118-1133)的Affimers并且其具有以下氨基酸序列:
MecA3136(序列ID编号1)具有肽适体序列:
MHHHHHHSSGLVPCGWLKETAAAKFERQHMDSPDLSTWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTDDDDKAMADIGSEMIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLAKILTLGSTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLALELSETPTPKAADRVLTGYQVDKNKDDELTGF
(加粗的序列表示标记序列)
MecA3140(序列ID编号2)具有肽适体序列:
MHHHHHHSSGLVPCGWLKETAAAKFERQHMDSPDLSTWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTDDDDKAMADIGSEMIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLASTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLFVVIQPERSNTWADRVLTGYQVDKNKDDELTGF
(加粗的序列表示标记序列)
HIW(序列ID编号3)具有肽适体序列:
MHHHHHHSSGLVPCGWLKETAAAKFERQHMDSPDLSTWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTDDDDKAMADIGSEMIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLASTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLHIWPITEIRRLVADRVLTGYQVDKNKDDELTGF
(加粗的序列表示标记序列)
E1(序列ID编号4)具有肽适体序列:
ASAATGVRAVPGNENSLEIEELARFAVDEHNKKENALLEFVRVVKAKEQHWKAKLGHDTMYYLTLEAKDGGKKKLYEAKVWVKLIPTKDFHLNFKELQEFKPVGDAAAAHHHHHH
还公开了针对进一步实验研究选择的肽序列Red1和Red2,其具有以下氨基酸序列:
Red1(序列ID编号5)具有肽适体序列:
MHHHHHHSSGLVPCGWLKETAAAKFERQHMDSPDLSTWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTDDDDKAMADIGSEMIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLANLVGRISTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGPRQIKQVEWELIWADRVLTGYQVDKNKDDELTGF*
(加粗的序列表示标记序列)
Red2(序列ID编号6)具有肽适体序列:
MHHHHHHSSGLVPCGWLKETAAAKFERQHMDSPDLSTWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTGSGGGSGGGSWSHPQFEKGTDDDDKAMADIGSEMIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLANLVGRISTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLTPLEL*
(加粗的序列表示标记序列)
MecA结合肽MecA3136、MecA3140、HIW和E1结合到MecA并在体外阻止苯唑西林(oxycillin)结合到MecA。
本实施例中描述的实验的目的是(1)确定PHMB和MecA肽在MRSA菌株中的最小抑制浓度(MIC),和(2)通过使用PHMB和肽测试苯唑西林的增强作用。
HO50960412(EMRSA-15)是英国医院特有的MRSA菌株。EMRSA-15基因组由2,832,299bp的单链环状染色体和2473bp的质粒组成。完全注释的染色体可得自具有登记号HE681097的EMBL/GenBank数据库。可以下载Artemis格式的质粒的初步基因预测。
MRSA252是英国医院特有的流行性EMRSA-16血统的代表。已经通过MLST将该菌株分型为序列类型(ST)36。MRSA252基因组由2,902,619bp的单链环状染色体组成。完整注释的基因组可得自具有登记号BX571856的EMBL/GenBank数据库。
方法
药物和肽的最小抑制浓度(MIC)
按照NCCLS指南用于改进的肉汤微量肉汤稀释进行EMRSA-15的抗菌剂敏感性测试。使EMRSA-15从-70℃甘油储备液中划线到补充5%马血液(Oxoid)和6μg/ml苯唑西林(Sigma)的哥伦比亚基础琼脂(Oxoid),并在33℃下孵育18-20小时。将二至四个细菌菌落接种到补充6μg/ml苯唑西林(Sigma)的3mlMuellerHinton肉汤(MHB,Oxoid)中并在180rpm振动下在33℃下孵育18-20小时。使用MHB将培养物调节到OD6250.08-0.1(相当于0.5Mcfarland或1-2×108cfu/ml)并进一步稀释1/50以实现终浓度为5×105cfu每孔。通过将苯唑西林(0–1024μg/ml,在MHB溶液中)、PHMB(0–512μg/ml,在1×PBS溶液中)或肽(0–512μg/ml,在1×PBS溶液中)以150μl每孔的终体积加入到75μl的培养物中。在33℃下孵育平板24h并通过肉眼观察对生长评分。
PHMB和MecA肽的协同作用
通过二倍稀释的标准棋盘法测试PHMB和肽(MecA3136,MecA3140)的协同作用。以适当浓度混合PHMB和肽至96孔板的每个孔至30μl的终体积,并在20-22℃下孵育混合物30min,然后将培养物和苯唑西林加入到150μl的终体积。如上所述孵育平板并评分。在没有生长和不含PHMB和肽的最低组合的情况下如下计算孔的FIC指数:(A/MICA)+(B/MICB)=FICA+FICB=FIC指数,其中A是组合的PHMB的浓度,MICA是单独的PHMB的MIC,B是组合的肽的浓度,MICB是单独的肽的浓度。包括不含苯唑西林的对照平板和具有增加的苯唑西林(oxcaillin)但没有PHMB和肽的培养物的对照孔。
结果
表6.PHMB或MecA肽(链霉素标记的)对EMRSA-15的MIC
§使用的苯唑西林是64μg/ml
*显示了测试的最大浓度
指示:
·在苯唑西林的存在下PHMB和MecA肽的MIC不改变
·针对MecA肽(苯唑西林致敏性测定)的递送,将测试1/2MIC(如0.25μg/ml)下的PHMB
·MecA肽不抑制MRSA的生长。可能生长抑制可以发生在比测试浓度高的浓度下,但这未得到证实。
·由于MecA肽不具有MIC,因此将使用PHMB测试任意浓度(苯唑西林致敏性测定)。
表7.在PHMB或MecA肽的不存在或存在下苯唑西林对EMRSA-15的MIC
指示:
·单独的PHMB不提高苯唑西林(MIC没有降低)
·单独的肽不提高苯唑西林(MIC没有降低)
·PHMB使苯唑西林对MRSA-15的MIC增加2倍,认为其不显著并且是意想不到的结果。
·然而,这可以表明在一定浓度下,PHMB捕获纳米粒子的苯唑西林并使其不可用于细菌,或者其是上调mecA的表达并提供对苯唑西林增加的抗性。
·如果PHMB是形成具有苯唑西林的纳米粒子并潜在地将其递送到细菌细胞,那么涉及肽、PHMB和苯唑西林的三维测定可能不产生清晰的结果。
表8.在不同浓度的苯唑西林下的PHMB和MecA肽的FIC指数(参见图1,用于原始数据的一个实例)
‐本套实验中苯唑西林的MIC是256μg/ml
‐由于MecA肽不抑制生长,为了计算FIC指数,将肽的MIC设定为22μM(或512μg/ml),之前测试不具有生长抑制作用的最大浓度。
指示:
·在一定浓度下的PHMB和MecA3136将苯唑西林从256μg/ml的MIC增加到≤16μg/ml的MIC(MIC降低16倍,也参见图1)。
·FIC<0.5表明协同作用。尽管PHMB和MecA肽没有显示协同作用,但随着苯唑西林浓度的增加而降低的FIC表明当使用PHMB和MecA3136时的致敏作用,和肽对MecA的特异性。
·这些结果提示MecA3136可能是二者中比较有希望的。
表90.25μg/mlPHMB下的MecA3136和苯唑西林的剂量响应
苯唑西林浓度(μg/ml)
表:通过MecA3136+0.25μg/mlNanocin增强的苯唑西林对EMRSA-15的生长抑制
该实验集中于与在较高浓度PHMB自身下一样的信息量最大的0.25μg/mlPHMB数据集,可能对敏感性具有影响并且在0.5μg/ml下就其本身而言可能杀菌,尽管这在1ug/ml下不清楚。
在表9中,1是生长,0是没有生长(nd=未进行)。观察到苯唑西林活性通过MecA3136明显增强。该表显示了明显的剂量响应。在8μMMecA3136和32μg/m苯唑西林下的生长可能是异常的,但在此外我们则可以观察到MecA3136如何恢复对苯唑西林的敏感性。在PHMB的该浓度下,可以观察到MecA3136对苯唑西林的敏感性的明显协同作用。
当针对这些另外的适体,进行与MecA3136和MecA3140类似的测定时可以观察到苯唑西林活性通过HIW和E1明显增强。
表10:苯唑西林、HIW和1ug/mlPHMB中EMRSA-15的生长。1表明生长,0表明无生长。
在Nanocin1μg/ml下的生长
表10中的顺序HIW在测定过程中显示良好的效果。
表11:EMRSA-15在苯唑西林、E1和1ug/mlPHMB中的生长。1表明生长,0表明无生长。
顺序E1是不同于MecA3136和MecA3140的支架,但在表11中在测定过程中显示中度效果。
Claims (32)
1.一种组合物,其包含细菌进入促进剂和抑制抗菌剂抗性的试剂。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述组合物还包含抗菌剂。
3.根据权利要求1或2所述的组合物,其中所述进入促进剂包含或由根据下式1a或式1b的直链和/或支链或环状的聚单胍/聚胍、聚双胍、其类似物或衍生物组成:
式1a
式1b
其中:
“n”是指聚合物中重复单元的数量,并且n可以从2到1000变化,例如从2或5到10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或900变化;
G1和G2独立地表示包含双胍或胍的阳离子基团,其中L1和L2直接连接到胍的氮原子上;
L1和L2是聚合物中G1和G2阳离子基团之间的连接基团并且独立地表示含有C1-C140碳原子的脂肪族基团,例如烷基基团如亚甲基、亚乙基、亚丙基、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10;C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140,烷基;或C1-C140(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10;C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140)、脂环族基团、杂环基团、芳香族基团、芳基、烷基芳基、芳基烷基或氧基亚烷基;或任选地被一个或多个,优选一个氧、氮或硫原子,官能团或饱和或不饱和的环部分中断的聚亚烷基;
N和G3为任选的端基;
X可以存在或不存在;
L3、L4和X是聚合物中G4和G5阳离子基团之间的连接基团并且独立地表示含有C1-C140碳原子的脂肪族基团,例如烷基基团如亚甲基、亚乙基、亚丙基、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10;C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140,烷基;或L3和L4以及X可以独立地为C1-C140(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10;C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140)、脂环族基团、杂环基团、芳香族基团、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧基亚烷基;或任选地被一个或多个,优选一个氧、氮或硫原子,官能团以及饱和或不饱和的环部分中断的聚亚烷基;
“G4”和“G5”是阳离子部分并且可以相同或不同,以及它们中的至少一个是双胍部分或氨基甲酰基胍,其他部分可以为双胍或氨基甲酰基胍或胺;
并且阳离子部分G4和G5不含单胍基团。
4.根据权利要求3所述的组合物,其中根据式1a所述的进入促进剂包含或由以下中的一种或多种组成:
或根据式1b所述的进入促进剂包含或由聚(烯丙基二胍基-共-烯丙胺)、聚(N-乙烯基双胍)、聚(烯丙基氨基甲酰基胍基-共-烯丙胺)或聚烯丙基双胍组成。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物,其中所述进入促进剂包含在纳米粒子中。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述抑制抗菌剂抗性的试剂是肽、核酸或小分子。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述抑制抗菌剂抗性的试剂是酶抑制剂。
8.根据权利要求6所述的组合物,其中所述肽或核酸结合到并且能够抑制选自PBP2a、NDM-1或Vim2的抗菌剂抗性决定因子。
9.根据权利要求6所述的组合物,其中所述肽结合到并抑制PBP2a(mecA基因产物)。
10.根据权利要求9所述的组合物,其中所述肽包含序列ID编号1至4中的一个或组合或与其具有至少90%同源性的任何肽序列。
11.根据权利要求6所述的组合物,其中所述核酸结合到NDM-1。
12.根据权利要求7所述的组合物,其中所述酶抑制剂是克拉维酸或其盐。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述进入促进剂是聚六亚甲基双胍(PHMB)或其类似物或衍生物。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物,其中所述进入促进剂是聚六亚甲基胍(PHMG)或其类似物或衍生物。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述细菌是革兰氏阴性、革兰氏阳性的或为分支杆菌。
16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述细菌对选自以下的一种或多种抗菌剂有抗性:阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、醋竹桃霉素、罗红霉素、螺旋霉素、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、厄他培南、多利培南、帕尼培南/倍他米隆、比阿培南、PZ-601、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布坦、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、地美环素、多西环素、米诺环素、氧四环素、四环素、杆菌肽、粘菌素、多粘菌素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星和曲伐沙星。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物,所述细菌是选自以下的多药耐药(MDR)菌株:绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、斯氏普罗威登斯菌(Providenciastuartii)或鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii),所述菌株对选自以下的一种或多种抗菌剂有抗性:环丙沙星、美罗培南、头孢他啶、氨曲南、阿奇霉素、甲氧西林、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、螺旋霉素、氧四环素和亚胺培南/西司他丁。
18.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其用于治疗或预防人或动物的细菌感染。
19.根据权利要求18所述的组合物,其中所述细菌感染是选自以下的内部或外部身体表面的细菌感染:口腔、生殖道、泌尿道、呼吸道、胃肠道、腹膜、中耳、***、血管内膜、眼,包括结膜或角膜组织,肺组织、心脏瓣膜、皮肤、头皮、指甲、伤口内部的表面,或肾上腺、肝脏、肾脏、胰腺、垂体、甲状腺、免疫***、卵巢、睾丸、***、子宫内膜、眼睛、乳腺、脂肪、上皮、内皮、神经、肌肉、肺、真皮、表皮或骨组织的表面;或选自以下的体液中的细菌感染:血液、血浆、血清、脑脊液、GI道内容物、唾液、肺分泌物和***;或选自以下的身体组织中或身体组织上的细菌感染:肾上腺、肝脏、肾脏、胰腺、脑、心脏、垂体、甲状腺、免疫***、卵巢、睾丸、***、子宫内膜、眼睛、乳腺、脂肪、上皮、内皮、神经、肌肉、肺、真皮、表皮和骨组织。
20.一种对抗人或动物的抗菌剂抗性细菌感染的方法,所述方法包括:
(a)鉴定细菌的类型和所述细菌的至少一个抗菌剂抗性决定因子的性质;
(b)选择抑制所确定的抗菌剂抗性的试剂;
(c)借助所鉴定的抗菌剂抗性决定因子选择细菌对其有抗性的抗菌剂;以及
(d)在进入促进剂存在的情况下将抑制所鉴定的抗菌剂抗性的所述试剂和所述抗菌剂给予人或动物。
21.根据权利要求20所述的方法,其中将所述进入促进剂和抑制所鉴定的抗菌剂抗性的试剂与所述抗菌剂同时或顺序给药。
22.根据权利要求20或21所述的方法,其中鉴定了多种不同类型的细菌。
23.一种使细菌对抗菌剂敏感的方法,所述方法包括以下步骤:在进入促进剂存在的情况下将所述细菌暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中。
24.一种杀灭抗菌剂抗性细菌的方法,所述方法包括以下步骤:在进入促进剂存在的情况下将细菌暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中并将所述细菌暴露于抗菌剂中。
25.根据权利要求24所述的方法,其中在进入促进剂存在的情况下将所述细菌暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中和将所述细菌暴露于所述抗菌剂中同时或顺序进行。
26.根据权利要求24所述的方法,其中多种不同类型的细菌被杀灭。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的方法,其中所述进入促进剂和抑制抗菌剂抗性的试剂由权利要求1至17中任一项所述的组合物形成。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的方法,其中所述细菌存在于人或动物体的外面,如存在于无生命物质内或无生命物质上或存在于无生命表面上。
29.成套试剂盒,其包括多种抑制抗菌剂抗性的试剂。
30.根据权利要求29所述的成套试剂盒,其还包括用于鉴定细菌的装置和/或用于鉴定细菌中抗菌剂抗性决定因子的装置。
31.根据权利要求29或30所述的成套试剂盒,其还包括一种或多种抗菌剂。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的成套试剂盒,其还包括进入促进剂,优选进入促进剂与抑制抗菌剂抗性的试剂的组合。
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