CN105372307B

CN105372307B - 一种检测转基因CaMV35S启动子的电极的制备方法及用途

Info

Publication number: CN105372307B
Application number: CN201510848286.3A
Authority: CN
Inventors: 李雅琪; 王坤; 蔡建荣; 孙力
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2015-11-27
Filing date: 2015-11-27
Publication date: 2018-02-27
Anticipated expiration: 2035-11-27
Also published as: CN105372307A

Abstract

本发明提供了一种检测转基因CaMV35S启动子电极的制备方法级用途，包括：还原氧化石墨烯/金纳米复合材料RGO/Au的制备步骤；硅@碲化镉纳米复合材料Si@CdTe的制备步骤；在ITO电极上制备探针1(Probe1)的步骤；向探针1(Probe1)修饰目标DNA(t‑DNA)CaMV35S启动子的步骤；向目标DNA(t‑DNA)CaMV35S启动子修饰探针2(Probe2)的步骤。本发明通过rGO/Au NPs和Si@CdTe两端双重信号放大，实现了对转基因CaMV35S启动子的灵敏检测，在0.05～100pM的浓度区间内，CaMV35S浓度与光电流呈现良好的线性关系，检出限可达0.017pM。

Description

一种检测转基因CaMV35S启动子的电极的制备方法及用途

技术领域

本发明涉及电化学用电极的制备领域，具体指一种检测转基因CaMV35S启动子的电极的制备方法及用途。

背景技术

转基因作物(Genetically Modified Crops，简称GMC)是指利用生物技术，把从动物、植物或微生物等生物体中经鉴定、分离的目的基因***植物基因组中，改变其遗传组成，产生新的农艺性状的植物。自1994年转基因番茄在美国的首次商业化以来，生物技术已被广泛用于现代农业。目前全球批准商业化种植的转基因生物已有100多种，种植转基因作物的国家有29个，转基因作物的种植面积也由1996年的170万hm2增加至2011年的16000万hm2。很多国家根据将已批准的部分转基因作物作为食品或饲料的生产原料，与此同时转基因产品的安全性受到了广泛关注。

目前转基因检测方法主要是基于外源蛋白靶标的检测和基于核酸的检测。以外源蛋白为靶标的检测方法是基于抗体对抗原的特异性识别，主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫试纸条法和蛋白质芯片，但是这些方法背景信号高、蛋白质活性难以长久保持、开发特异性抗体的成本高、加工过的转基因产品其蛋白质发生变性而无法进行检测。基于核酸的检测方法最常用的是聚合酶链式反应(PCR)是最常用的转基因检测方法，但样品需要量大，操作繁琐，耗时，结果的准确性易受假阳性和假阴性的影响。

石墨烯具有更高的机械强度，更大的比表面积以及更低廉的制备成本，这些特点使得石墨烯成为了新的优良载体，而纳米金(Au NPs)和石墨烯形成的复合材料，不只拥有原本优异性能，如大的比表面积、出色的导电性、催化性，以及优良的化学稳定性等，而且两组分之间还存在着协同作用，因此极大地改善了复合材料的性能也使得石墨烯/金纳米粒子复合物在催化、生物传感器、光谱学、能量存储等领域展现出许多优异的性能和潜在的应用价值。

碲化镉量子点(CdTe QDs)是一种半导体纳米材料，通过调节粒径,可以得到从整个可见光波段到紫外光波段的禁带宽度，具有大的载流子移动率,高的光吸收特性和热稳定性等，在紫外光或电子激发下能产生高效的发光。在光电性质方面,不仅具有良好的发光性能，而且还是好的电子受体材料，因而在电致发光器件和光电电池器件方面都得到广泛的研究和应用。

二氧化硅纳米球具有小尺寸、水溶性良好、比表面积大、生物相容性好、无毒且能和多种生物分子偶联等优点，是量子点的理想载体。

光致电化学传感器是一种以光能作为激发能量，电信号作为检测信号的传感器。

本发明以碲化镉包覆的硅球(SiO₂@CdTe)为光电信号标志物。首先将ITO电极表面依次修饰上石墨烯/金(rGO/Au NPs)、DNA探针1(Probe1)、目标DNA(T-DNA)、DNA探针2(Probe2)-碲化镉包覆的硅球(SiO₂@CdTe)，构建的光电化学传感器大大提高了灵敏度。该检测体系以ITO为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，以光电流为检测信号，通过对不同浓度的目标DNA检测，建立标准曲线，以达到对作物及产品定量检测的目的。

发明内容

本发明旨在发明一种集免标记、高灵敏度、高选择性、简单易操作等优点为一体的光电化学传感器，提供一种制备工艺简单，灵敏度高，测量范围宽，成本低的定量检测含有CaMV35S启动子转基因作物及产品的方法，解决现有检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长、灵敏度较低的难题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

步骤1、还原氧化石墨烯/金纳米复合材料RGO/Au的制备步骤；

步骤2、二氧化硅纳米微球@碲化镉纳米复合材料SiO₂@CdTe的制备步骤；

步骤3、在ITO电极上制备探针1(Probe1)的步骤：将RGO/Au分散于蒸馏水中得到RGO/Au分散液后滴涂于ITO电极表面的修饰区，进行干燥；取溶有探针1的tris-HCl缓冲液滴涂于所述干燥后的RGO/Au表面，进行干燥；冲洗电极表面后，进行干燥，得到ITO-rGO/Au-Probe1；

步骤4、向探针1修饰目标DNA CaMV35S启动子的步骤：取溶有目标DNA CaMV35S启动子的tris-HCl缓冲液滴涂于所述ITO-rGO/Au-Probe1的表面，室温孵育，待干燥后冲洗电极，得到ITO-rGO/Au-Probe1-t-DNA；

步骤5、向目标DNA CaMV35S启动子修饰探针2的步骤：将SiO₂@CdTe的蒸馏水分散液和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液加入到乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液中进行反应，反应结束后，离心并洗涤得到固体A，将所得固体A加入到溶有探针2的tris-HCl缓冲液中，得到混合液A，振荡反应一段时间后，得到固体产物Probe2/SiO₂@CdTe；将Probe2/SiO₂@CdTe分散于蒸馏水中后，得到混合液B，将混合液B滴涂于所述ITO-rGO/Au-Probe1-t-DNA表面，孵育，待干燥后冲洗电极表面，得到ITO-rGO/Au-Probe1-t-DNA-Probe2/SiO₂@CdTe。

步骤3中，RGO/Au分散液的浓度为1～4mg/mL，滴涂于ITO表面的RGO/Au分散液的量为20μL；溶有Probe1的tris-HCl缓冲液用量为10μL，探针1的浓度为4μM。

步骤4中，溶有目标DNA CaMV35S启动子的tris-HCl缓冲液用量为20μL，目标DNA的浓度为0.05pM～100pM。

步骤5中，所用的SiO₂@CdTe的蒸馏水分散液、N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液、乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液的体积比25:1:1；所用的SiO₂@CdTe的蒸馏水分散液的浓度为1mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液的浓度为0.2M，乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液的浓度为0.4M；混合液A中，所用的溶有探针2的tris-HCl缓冲液中探针2的浓度为10μM，且混合液A中，每100μL tris-HCl缓冲液中含有1mg SiO₂@CdTe；混合液B中，Probe2/SiO₂@CdTe的浓度为4μM。

所有的电极冲洗方法均为用PH7.0的PBS缓冲液冲洗电极3次，所有的tris-HCl缓冲液pH均为7.4，浓度均为4.5mM。

在进行向目标DNA(t-DNA)修饰探针2(Probe2)前，先取新鲜配置的0.01mM 6-巯基己醇20μL，滴加在ITO-rGO/Au-Probe1-t-DNA表面，用以封闭rGO/Au上多余的活性位点，2小时后用，用PH7.0的PBS缓冲液冲洗电极3次，以除去过量的6-巯基己醇。

SiO₂@CdTe的制备方法为：选取硅球加入到邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(PDDA)中，搅拌反应，搅拌反应完毕进行离心、洗涤后，取沉淀加入到CdTe的蒸馏水分散液中，搅拌反应，反应结束后，离心、洗涤、干燥，得到产物，备用。

所用的探针1(Probe1)序列为5’HS-G GCC ATC GTT GAA 3’；CaMV35S(t-DNA)序列为5’GGC AGA GGC ATC TTC AAC GAT GGC C 3’；探针2(Probe2)序列为5’GAT GCC TCTGCC-NH23’。

以所制备的电极作为传感器，用于光电化学检测CaMV35S启动子，其检测步骤如下：

(1)将所制备的含有不同浓度目标DNA的ITO电极置于PH7.0PBS缓冲液中，使用三电极体系，进行电化学检测。

所述三电极体系：饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，ITO为工作电极；

(2)扫描电压范围从-0.5V～0V，电势跃阶为4mV,频率25Hz，振幅25mV；

(3)光电检测采用i-t测试手段，偏压设置为0V；每隔20s进行开关灯，记录开关灯前后电流的变化值，根据不同浓度的t-DNA产生的不同大小的光电流值，绘制工作标准曲线；

(4)将待测样品溶液代替t-DNA溶液，按照所述工作曲线绘制的方法进行检测。

CaMV35S检测的标准曲线是指该传感器在与不同浓度的CaMV35S进行反应，并扫得其光电流信号图谱，根据不同浓度下光电流制得的标准曲线。

本发明的有益效果为：

(1)本发明通过CaMV35S作为目标DNA和双探针特异性互补配对原则，特异性识别CaMV35S转基因，可对转基因作物及其产品进行检测，大大降低了假阴性和假阳性出现的概率。

(2)本发明通过二氧化硅纳米微球表面包覆CdTe，使单个Probe2上可连接N个CdTe，从而进行信号放大。

(3)本发明通过rGO/Au NPs和SiO₂@CdTe两端双重信号放大，实现了对转基因CaMV35S启动子的灵敏检测，在0.1～100pM的浓度区间内，CaMV35S浓度与光电流呈现良好的线性关系，检出限可达0.017pM。

附图说明

图1为实施例4中检测不同浓度CaMV35S所得到的光电流响应图，其中a为0.05pM、b为0.01pM、c为0.5pM、d为1pM、e为10pM、f为50pM、g为100pM；

图2为实施例3和实施例7中的实验对比图，其中a为实施例3中的空白电极的光电流响应，b为t-DNA光电流响应，c为2个碱基错配DNA，d为5个碱基错配DNA各，e为完全不互补DNA。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述：

本发明中所用的硅球和CdTe均可以采用现有的方法制备得到，本发明所用的硅球是指二氧化硅纳米微球。

本发明所用的氧化石墨烯的制备方法为：

GO的制备采用改进的Hummers法：在冰水浴与搅拌条件下，将1g天然鳞片石墨加入到50mL浓H₂S₂O₄(98％)中，冷却至零度；缓慢加入0.5g KNO₃和6g KMnO₄。在控制反应温度不超过10℃的条件下反应4h。然后将该体系转移至35℃恒温水浴搅拌反应2h，加入300mL去离子水，在≤80℃条件下继续反应2h。用过量的5％H₂O₂还原剩余的KMnO₄，并用5％HCl洗涤若干次，最后用足够的去离子水充分洗涤至溶液不再含有SO₄ ^2-离子(BaCl₂检测无白色沉淀)。将最终产物转移至65℃烘箱中干燥，储存备用。

rGO/Au的制备方法为：

称取25mg GO超声分散在50mL无水乙醇溶液中，加入1g EDC和0.5g NHS，室温下搅拌反应8h；然后将1.0g 2-ATP加入到上述反应体系中，室温下继续搅拌12h；反应结束后，用无水乙醇和二次蒸馏水分别洗涤、离心3～5次，最后在60℃下真空干燥24h，得到GO-SH；称取10mg上述制备的GO-SH于30mL二次蒸馏水中超声分散，并转移至三孔烧瓶中，搅拌状态下加热回流0.5h；然后将10mL新鲜配制的柠檬酸钠溶液(0.2g mL^-1)缓慢加入到三孔烧瓶中，搅拌条件下继续加热回流2.5h；再将50μL HAuCl₄溶液(2wt％)缓慢滴加到上述反应体系中，继续加热回流0.5h后停止加热，搅拌状态下冷却至室温。最后用二次蒸馏水洗涤、离心3～5次，真空干燥后即可得到rGO/AuNPs。

实施例1：

SiO₂@CdTe的制备

取1mg 100nm左右的硅球，加入到40mL 0.4％邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(PDDA)中，搅拌1小时，7000转离心5分钟，蒸馏水离心水洗3次后，取沉淀加入到8mL含有2.4mgCdTe的蒸馏水中，搅拌反应1小时，将产物离心、洗涤、干燥，备用。

实施例2：

Probe2/SiO₂@CdTe的制备：

取1mL 1mg/mL的SiO₂@CdTe蒸馏水分散液和40μL 0.2M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到40μL 0.4M乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)中，反应2小时后，离心移除多余的EDC和NHS，加入100μL 10μM的Probe2tris-HCl缓冲液，振荡12小时，得到Probe2/SiO₂@CdTe。

实施例3：

(1)ITO电极的预处理：将ITO导电玻璃切割成1cm*2cm大小，依次用洗洁精、乙醇、超纯水超声清洗30min，之后用氮气吹干，用绝缘胶带在ITO电极的一段固定出1cm*0.5cm的面积用以修饰材料及检测；

(2)取20μL分散有2mg/mL rGO/Au的蒸馏水分散液均匀滴涂在ITO导电玻璃上，放置干燥；

(3)取10μL 4μM带巯基的Probe1滴涂在步骤(2)的电极表面，借助Au-S键把Probe1固定在电极表面，反应12小时，用PH7.0的PBS缓冲液冲洗电极3次，冲洗除去过量的Probe1，干燥，得到ITO-rGO/Au-Probe1；

(4)取新鲜配置的0.01mM 6-巯基己醇20μL，滴加在电极表面，用以封闭rGO/Au上多余的活性位点，2小时后用PH7.0的PBS缓冲液冲洗电极3次，以除去过量的MCH；

(5)取20μL 4μM的Probe2/SiO₂@CdTe蒸馏水分散液滴涂到电极表面，形成空白DNA的对照试验，孵育50分钟后，用PH7.0的PBS缓冲液冲洗电极3次，以除去过量的Probe2/SiO₂@CdTe，得到ITO-rGO/Au-Probe1-Probe2/SiO₂@CdTe光电化学传感器。

实施例4：

(2)取20μL分散有1mg/mL rGO/Au的蒸馏水分散液均匀滴涂在ITO导电玻璃上，放置干燥；

(5)分别取0.05、0.1、0.5、1、10、50、100pM的t-DNA各20μL滴加在6片不同的ITO电极表面，使目标DNA和Probe1互补配对，室温孵育50分钟，用PH7.0的PBS缓冲液冲洗电极3次，以除去过量的目标DNA，得到ITO-rGO/Au-Probe1-t-DNA；

(6)取20μL 4μM的Probe2/SiO₂@CdTe蒸馏水分散液滴涂到电极表面，使Probe2和目标DNA互补配对以接上光电化学信号标志物质SiO₂@CdTe，孵育50分钟后，用PH7.0的PBS缓冲液冲洗电极3次，以除去过量的Probe2/SiO₂@CdTe，得到对应浓度的t-DNA的ITO-rGO/Au-Probe1-t-DNA-Probe2/SiO₂@CdTe光电化学传感器。

本实施例制备的ITO-rGO/Au-Probe1-t-DNA-Probe2/SiO₂@CdTe光电化学传感器用于检测CaMV35S启动子，其结果如图1，图1显示在0.05～100pM范围内，对CaMV35S的检测呈现很好的线性，检测限达到了0.017pM，因此该传感器可以用于CaMV35S的定量检测。

实施例5：

(6)取1mL SiO₂@CdTe，加入40μL 400mM乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和40μL 200mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，反应2小时后，离心移除多余的EDC和NHS，加入100μL含有10μM Probe2的tris-HCl缓冲液，振荡12小时，得到Probe2/SiO₂@CdTe。取20μL4μM的Probe2/SiO₂@CdTe蒸馏水分散液滴涂到电极表面，使Probe2和目标DNA互补配对以接上光电化学信号标志物质SiO₂@CdTe，孵育50分钟后，用PH7.0的PBS缓冲液冲洗电极3次，以除去过量的Probe2/SiO₂@CdTe，得到对应浓度的t-DNA的ITO-rGO/Au-Probe1-t-DNA-Probe2/SiO₂@CdTe光电化学传感器。

实施例6：

(2)取20μL分散有4mg/mL rGO/Au的蒸馏水分散液均匀滴涂在ITO导电玻璃上，放置干燥；

由于实施例4～6中修饰的rGO/Au的量不同，所以最终负载的探针以及目标DNA的量均有区别，但是其检测结果的区别仅限于光电流大小，因此该3个实施例的电极均可以用于光电化学检测CaMV35S。

实施例7：

(5)分别取20μL 200pM的t-DNA、2个碱基错配DNA、5个碱基错配DNA各和完全不互补DNA 20μL滴加在6片不同的ITO电极表面，使DNA和Probe1互补配对，室温孵育50分钟，用PH7.0的PBS缓冲液冲洗电极3次，以除去过量的DNA，得到ITO-rGO/Au-Probe1-t-DNA；

(6)取20μL 4μM的Probe2/SiO₂@CdTe蒸馏水分散液滴涂到电极表面，使Probe2和目标DNA互补配对以接上光电化学信号标志物质SiO₂@CdTe，孵育50分钟后，用PH7.0的PBS缓冲液冲洗电极3次，以除去过量的Probe2/SiO₂@CdTe，得到对应DNA的光电化学传感器。

图2为本实施例与实施例3所制备的传感器的对比数据，可以发现本实施例的传感器随着碱基错配数量的增多，其光电相应信号逐渐降低，当电极修饰完全不互补的DNA之后，其光电响应值和空白对照基本相同，说明本传感器对CaMV35S具有良好的选择特异性。

上述实施例中，所用的探针1序列为5’HS-G GCC ATC GTT GAA 3’；CaMV35S(t-DNA)序列为5’GGC AGA GGC ATC TTC AAC GAT GGC C 3’；探针2序列为5’GAT GCC TCTGCC-NH23’；2个碱基错配DNA的序列为：5’GGC AGA GGC AAC TTC AAG GAT GGC C 3’；5个碱基错配DNA的序列为：5’GCC AGA GGC AAC TTC AAG GAT GCC G 3’；完全不互补配对DNA的序列为：5’CCT GCT CCG TAG CCT GCG TCA TCT G 3’。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏大学

<120> 一种检测转基因CaMV35S启动子的电极的制备方法及用途

<130> 一种检测转基因CaMV35S启动子的电极的制备方法及用途

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggccatcgtt gaa 13

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcagaggca tcttcaacga tggcc 25

<210> 3

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatgcctctg cc 12

Claims

1.一种检测转基因CaMV35S启动子电极的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1、还原氧化石墨烯/金纳米复合材料RGO/Au的制备步骤；

步骤3、在ITO电极上制备探针1的步骤：将RGO/Au分散于蒸馏水中得到RGO/Au分散液后滴涂于ITO电极表面的修饰区，进行干燥；取溶有探针1的tris-HCl缓冲液滴涂于所述干燥后的RGO/Au表面，进行干燥；冲洗电极表面后，进行干燥，得到ITO-rGO/Au-Probe1；

步骤5、向目标DNA CaMV35S启动子修饰探针2的步骤：将SiO₂@CdTe的蒸馏水分散液和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液加入到乙基-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺盐酸盐的水溶液中进行反应，反应结束后，离心并洗涤得到固体A，将所得固体A加入到溶有探针2的tris-HCl缓冲液中，得到混合液A，振荡反应一段时间后，得到固体产物Probe2/SiO₂@CdTe；将Probe2/SiO₂@CdTe分散于蒸馏水中后，得到混合液B，将混合液B滴涂于所述ITO-rGO/Au-Probe1-t-DNA表面，孵育，待干燥后冲洗电极表面，得到ITO-rGO/Au-Probe1-t-DNA-Probe2/SiO₂@CdTe；

所用的探针1序列为5’HS-G GCC ATC GTT GAA 3’；目标DNA CaMV35S启动子序列为5’GGC AGA GGC ATC TTC AAC GAT GGC C 3’；探针2序列为5’GAT GCC TCT GCC-NH2 3’。

2.由权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中，RGO/Au分散液的浓度为1~4mg/mL，滴涂于ITO表面的RGO/Au分散液的量为20μL；溶有探针1的tris-HCl缓冲液用量为10μL，探针1的浓度为4μM。

3.由权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4中，溶有目标DNA的tris-HCl缓冲液用量为20μL，目标DNA CaMV35S启动子的浓度为0.05pM~100pM。

4.由权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5中，所用的SiO₂@CdTe的蒸馏水分散液、N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液、乙基-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺盐酸盐的水溶液的体积比25:1:1；所用的SiO₂@CdTe的蒸馏水分散液的浓度为1mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液的浓度为0.2M，乙基-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺盐酸盐的水溶液的浓度为0.4M；混合液A中，所用的溶有探针2的tris-HCl缓冲液中探针2的浓度为10μM，且混合液A中，每100μL tris-HCl缓冲液中含有1mg SiO₂@CdTe；混合液B中，Probe2/SiO₂@CdTe的浓度为4μM。

5.由权利要求1~4任意一项所述的方法，其特征在于，SiO₂@CdTe的制备方法为：选取硅球加入到邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯中，搅拌反应，搅拌反应完毕进行离心、洗涤后，取沉淀加入到CdTe的蒸馏水分散液中，搅拌反应，反应结束后，离心、洗涤、干燥，得到产物，备用。

6.由权利要求1~4任意一项所述的方法，其特征在于，在进行向目标DNA修饰探针2前，先取新鲜配置的0.01mM 6-巯基己醇20μL，滴加在ITO-rGO/Au-Probe1-t-DNA表面， 2小时后用，用PH7.0的PBS缓冲液冲洗电极3次。

7.由权利要求1~4任意一项所述的方法，其特征在于，所有的电极冲洗方法均为用PH7.0的PBS缓冲液冲洗电极3次，所有的tris-HCl缓冲液pH均为7.4，浓度均为4.5mM。

8.由权利要求1~7任意一项所述的方法制备的电极的用途，其特征在于，所述电极用于光电化学检测CaMV35S启动子，检出限可达0.017pM。