CN105368956A - 一种用于绿豆抗豆象新基因Br3辅助选择的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于绿豆抗豆象新基因Br3辅助选择的分子标记及其应用，本发明所述的分子标记，命名为SYD404，其是以绿豆品种V1128的基因组DNA为模板，通过采用1对SSR引物经PCR扩增后得到，与抗豆象基因Br3的遗传距离为4.0cM。本发明的一种分子标记为绿豆品种V1128的抗豆象育种提供了一条很好的途径，可以将选择提前到绿豆生长苗期进行，既可以免除大量费时费力的抗豆象鉴定工作，又可以对育种材料进行早代选择，并可以对目标基因进行精准的逐代跟踪。

Description

一种用于绿豆抗豆象新基因Br3辅助选择的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种与抗豆象新基因Br3紧密连锁的分子标记及其在绿豆抗豆象育种中的用途，本发明属于作物遗传育种技术领域。

背景技术

豆象是危害绿豆等食用豆类作物的主要仓储害虫。受危害后的食用豆重量降低，营养丧失，质量严重下降。目前，生产上防治豆象危害的方法主要为磷化铝熏蒸法，这不仅增加了食用豆生产的成本，而且容易导致农药残留、造成环境污染、影响食用者身体健康。防治豆象危害最为经济且环保的方法是培育抗豆象食用豆品种。

TC1966和ACC41是以往的研究中利用最多的2份抗豆象野生绿豆资源。研究者或者利用其本身，或者利用它们的杂交或回交后代作为分析材料，进行抗豆象遗传、抗豆象机理、抗豆象分子标记及抗豆象育种等方面的研究。然而这些野生材料往往具有炸荚、蔓生、晚熟、小粒等育种中的不利性状，且较难克服，更为重要的是TC1966的回交后代中可能存在某些对人体健康不利的成分[MiuraK,1996，Effectsofbruchid-resistantmungbeanmealongrowthandblood-biochemicalvaluesinmice.JapanInternationalResearchCenterforAgriculturalSciencesJournal,3:23-31]，因此对栽培绿豆中抗豆象资源的筛选利用越来越受重视。目前为止，已报道的栽培绿豆抗豆象资源有4份，其中V2709和V1128均来自印度，V2802和V2817分别来自菲律宾和尼日利亚。V2709和V2802对豆象具有中等抗性，V1128和V2817对象豆象具有完全抗性[TalekarNS,1992,CharacterizationofCallosobruchuschinensis(Coleoptera:Bruchidae)resistanceinmungbean.JournalofEconomic,85:1150-1153；SomtaC,2008,Characterizationofnewsourcesofmungbean(Vignaradiata(L.)Wilczek)resistancetobruchids,Callosobruchusspp.(Coleoptera:Bruchidae).JournalofStoredProductsResearch,44:316-321]。Young等(1992)以TC1966和感豆象绿豆的杂交F₂群体为材料利用RFLP标记对抗性基因进行定位，将抗豆象基因(Br)定位在第8连锁群上10cM的区间，两侧标记pA882和pM151距与Br基因的距离为3.6cM和6.5cM。Kaga等(1998)用TC1966构建的回交群体，进一步对Br基因进行定位，将Br定位到了0.7cM的区间内，其中Bng143标记与Br相距仅0.2cM。Miyagi等(2004)最早对抗豆象野生绿豆ACC41的抗性基因进行了研究，找到了2个与抗豆象基因Br1连锁的STS标记：STSbr1和STSbr2。此后梅丽(2007)和赵丹(2011)又相继对ACC41的抗性基因进行研究，将Br1基因到定位到约11cM的区间，其中与右翼SSR标记C220的距离约2.6cM，左翼标记RAPD标记C78约8.4cM。孙蕾等(2008)利用VC1973A和V2709构建的F₂群体对V2709的抗豆象基因Br2进行了初步定位，将Br2基因定位在16.8cM的区间，距其两侧的RAPD标记和STS标记分别为11.0cM和5.8cM。

栽培绿豆V1128较以往鉴定出的V2709和V2802(中等抗性)抗豆象能力更强，因此在绿豆抗豆象育种中具有更大的潜力，容易用其培育出抗豆象绿豆品种。然而，由于每年的抗豆象鉴定工作非常繁杂，目前还没有利用V1128作为抗豆象基因供体育成绿豆品种的报道。如果能利用与抗豆象基因紧密连锁的分子标记在绿豆生长苗期进行辅助选择，将大大降低后期抗豆象鉴定的工作量，加速绿豆抗豆象育种进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于绿豆品种V1128抗豆象新基因Br3辅助选择的分子标记及其应用。

本发明的上述目的是通过如下技术方案实现的：

本发明的一种用于绿豆品种V1128抗豆象新基因Br3辅助选择的分子标记，命名为SYD404，其特征在于所述的分子标记是以绿豆品种V1128的基因组DNA为模板，采用1对SSR引物经PCR扩增后得到；所述的SSR引物的序列为：

上游引物：5ˊACGGCTATTCATCGTTTTGC3ˊ

下游引物：5ˊCAACCCGAAGCCAAAAACTA3。

所述标记SYD404与绿豆抗豆象基因Br3的遗传距离为：4.0cM。

在本发明中，优选的，用于扩增所述分子标记的PCR反应体系和扩增程序为：

PCR反应体系为10μL，含1×PCR缓冲液，0.2mMdNTPs,上下游引物各0.2μM，20ng绿豆品种V1128的基因组DNA，0.5UTaq酶；

PCR扩增程序：95℃预变性5min，然后每个循环：95度变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35次循环，最后72℃延伸10min。

本发明还提出了所述的分子标记及所述SSR引物在抗豆象绿豆品种V1128辅助育种中的用途。

进一步的，本发明还提出了一种筛选含有抗豆象基因Br3的绿豆品种V1128杂交后代的方法，包括以下步骤：以待测绿豆品种V1128的杂交后代基因组DNA为模板，用本发明所述的SSR引物进行PCR扩增，电泳检测扩增产物，扩增产物中有113bp条带的待测绿豆材料为候选的含有抗豆象基因Br3的后代材料。

其中，优选的，所述的PCR扩增的反应体系和扩增程序为：

PCR反应体系为10μL，含1×PCR缓冲液，0.2mMdNTPs,上下游引物各0.2μM，20ng绿豆品种V1128的杂交后代基因组DNA，0.5UTaq酶；

PCR扩增程序：95℃预变性5min，然后每个循环：95度变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35次循环，最后72℃延伸10min。

其中，所述的电泳检测为使用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。在PCR产物中加2μL上样缓冲液，280V恒电压电泳1h。0.1％AgNO₃染色10min，1.5％NaOH(含0.5％甲醛)溶液显影。

相较于现有技术本发明的有益效果为：

在国际上首次获得与抗豆象绿豆资源V1128抗豆象基因Br3紧密连锁的分子标记：本发明从2882个SSR标记中筛选到8个与抗豆象新基因Br3连锁的标记，其中标记SYD404与Br3的遗传距离为4.0cM。上述标记为自主开发，且与Br3基因紧密连锁，可以用于分子标记辅助选择育种。

本发明的一种分子标记为绿豆品种V1128的抗豆象育种提供了一条很好的途径，可以将选择提前到绿豆生长苗期进行，既可以免除大量费时费力的抗豆象鉴定工作，又可以对育种材料进行早代选择，并可以对目标基因进行精准的逐代跟踪。

附图说明

图1为抗豆象亲本(V1128)和感豆象亲本(冀绿7号)及其杂交F₁代的抗豆象鉴定结果；

其中V1128和F₁代完全抗豆象，冀绿7号完全感豆象；

图2为分子标记SYD404在抗感池、亲本及部分F₂群体中的扩增结果；

其中M为maker，1为感池，2为抗池，3为亲本冀绿7号，4为亲本V1128，5-49为部分F₂群体；

图3为Br3基因紧密连锁图谱；

图4为分子标记SYD404在重组自交系(RILs)后代中的扩增结果；

其中M为maker，P1为亲本冀绿7号，P2为亲本V1128，S为感豆象后代，R为抗豆象后代。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1SYD404分子标记的确定

实验材料：

感豆象材料冀绿7号作母本，该绿豆品种为河北省农林科学院粮油作物研究所育成品种；抗豆象材料V1128作父本，该绿豆种质引自亚洲蔬菜中心(AVRDC)。将冀绿7号和V1128杂交，单株收获F₁代。将来自于同一F₁单株的种子繁殖成F₂代分离群体，共获得158个F₂单株。同时将F₁单株与轮回亲本冀绿7号进行回交，获得105个BC₁单株。F₂随机取30粒种成株行，获得F_2:3家系。

抗豆象鉴定方法：

对亲本、F₁、F₂和BC₁和F_2:3家系进行抗豆象鉴定。每个单株随机取90粒种子，分成3个重复，每个重复30粒，分别放于直径5cm，高2.5cm的小塑料盒中(无盖)，然后将小塑料盒放入大塑料盒内(规格：660×440×180mm)。上面盖两层黑布，置于养虫室中，养虫室温度控制在28±2℃，相对湿度70％-80％。每个大塑料盒内放入400-500头刚羽化1-3d的豆象成虫进行产卵，待每粒种子上着卵量达5粒以上时除去成虫。利用感虫亲本冀绿7号作为对照，待对照种子受害率达100％时，调查每份材料的受害率。抗感标准：受害率小于20％为高抗，受害率20％-80％为中等抗性，受害率大于80％为感。

分子标记引物设计及多态性标记筛选：

利用自主测序获得的绿豆转录组Unigenes序列数据库，采用MISA寻找SSR位点，并利用Primer3设计SSR引物，产物片段范围150-300bp，共获得2882对SSR引物。根据F_2:3代抗豆象鉴定结果，从F₂中选取10株纯合感豆象单株和10株纯合抗豆象单株的DNA等量混合，构建抗感池。利用抗感池和两亲本DNA筛选多态性SSR标记。

基因组DNA提取：

取新鲜的三出复叶0.1g用液氮冷冻并磨成粉，使用天根公司的植物基因组DNA快速提取试剂盒提取基因组DNA,用1％的琼脂糖凝胶检测DNA质量，经紫外分光光度计测定浓度后,加ddH₂O稀释至10ng/μL备用。

PCR扩增及电泳检测：

PCR扩增反应在ABIAppliedBiosystemsVeriti96WellThermolCycler扩增仪上进行,反应体系为10μL,包含1×PCRbuffer，0.2mMdNTPs,上下游引物各0.2μM，20ng基因组DNA，0.5UTaq酶。反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s,55℃退火45s,72℃延伸45s,循环35次；72℃延伸10min。扩增产物经8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,在280V恒压下电泳,根据PCR产物分子量大小及差异带型的可辨程度调整电泳时间。将凝胶从玻璃板转移到染色盒,用蒸馏水洗涤2次,然后用0.1％AgNO₃溶液染色10min,蒸馏水快速漂洗2次,加1.5％NaOH(0.5％甲醛)溶液显影至条带清晰,再用蒸馏水洗掉凝胶上残留的显影液,拍照读带。

抗豆象基因遗传分析：

亲本V1128对绿豆象表现高抗，亲本冀绿7号表现高感，F₁代表现高抗(图1)。F₂代抗感分离比为115抗：37感，卡方检验符合3：1的理论比率，χ²＝0.035(χ²0.05＝3.54，df＝1)。BC₁代抗感分离比为59抗：46感，卡方检验符合1：1的理论比率，χ²＝1.61(χ²0.05＝3.54，df＝1)。因此推断V1128的抗豆象基因为单显性主基因。延续前人的命名规则，将该基因定名为Br3。

抗豆象基因定位：

从2882个SSR标记中筛选出13个在抗感池间表现多态性的标记。利用13个多态性SSR标记对F₂分离群进行基因分型(图2)，并利用QTLIciMappingV4.0计算各个分子标记与抗豆象基因之间的遗传距离，结果有8个SSR标记成功构建到连锁群中，其中离抗豆象基因Br3最近的分子标记为SYD404，遗传距离为4.00cM(图3)，所对应的SSR引物的序列为：

上游引物：5ˊACGGCTATTCATCGTTTTGC3ˊ

下游引物：5ˊCAACCCGAAGCCAAAAACTA3ˊ。

实施例2分子标记的验证

为了验证分子标记SYD404在实际育种中的选择效果，我们根据抗豆象鉴定结果，从冀绿7号×V1128F₈代重组自交系群体(RILs)中分别随机选择了20个抗豆象株系和感豆象株系，采用SSR引物(上游引物：5ˊACGGCTATTCATCGTTTTGC3ˊ；下游引物：5ˊCAACCCGAAGCCAAAAACTA3ˊ)进行PCR扩增验证，分别以感豆象亲本冀绿7号(无抗性基因)和抗豆象亲本V1128(有抗豆象Br3基因)作为对照。

PCR反应体系为10μL，含1×PCR缓冲液，0.2mMdNTPs,上下游引物各0.2μM，20ng冀绿7号×V1128F₈代株系基因组DNA，0.5UTaq酶；

PCR扩增程序：95℃预变性5min，然后每个循环：95度变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35次循环，最后72℃延伸10min。

电泳检测使用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。在PCR产物中加2μL上样缓冲液，280V恒电压电泳1h。0.1％AgNO₃染色10min，1.5％NaOH(含0.5％甲醛)溶液显影。

扩增结果表明感豆象后代全部扩增出与冀绿7号相同的带型，抗豆象后代株系的扩增产物中均有113bp条带，表现为与V1128相同的带型(图4)。因此，说明SYD404引物可以作为筛选V1128抗豆象基因Br3的分子标记，用于抗豆象绿豆品种V1128的分子标记辅助育种。

Claims (7)

1.一种用于绿豆品种V1128抗豆象新基因Br3辅助选择的分子标记，命名为SYD404，其特征在于所述的分子标记是以绿豆品种V1128的基因组DNA为模板，采用1对SSR引物经PCR扩增后得到；所述的SSR引物的序列为：

上游引物：5ˊACGGCTATTCATCGTTTTGC3ˊ

下游引物：5ˊCAACCCGAAGCCAAAAACTA3。

2.如权利要求1所述的分子标记，其特征在于用于扩增所述分子标记的PCR反应体系和扩增程序为：

PCR反应体系为10μL，含1×PCR缓冲液，0.2mMdNTPs,上下游引物各0.2μM，20ng绿豆品种V1128的基因组DNA，0.5UTaq酶；

PCR扩增程序：95℃预变性5min，然后每个循环：95度变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35次循环，最后72℃延伸10min。

3.权利要求1或2所述的分子标记在抗豆象绿豆品种V1128辅助育种中的用途。

4.一种用于绿豆品种V1128抗豆象新基因Br3辅助选择的SSR引物，其特征在于所述的SSR引物的序列为：

上游引物：5ˊACGGCTATTCATCGTTTTGC3ˊ

下游引物：5ˊCAACCCGAAGCCAAAAACTA3ˊ。

5.权利要求4所述的SSR引物在抗豆象绿豆品种V1128辅助育种中的用途。

6.一种筛选含有抗豆象基因Br3的绿豆品种V1128杂交后代的方法，其特征在于包括以下步骤：以待测绿豆品种V1128的杂交后代基因组DNA为模板，用权利要求4所述的SSR引物进行PCR扩增，电泳检测扩增产物，扩增产物中有113bp条带的待测绿豆材料为候选的含有抗豆象基因Br3的后代材料。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的PCR扩增的反应体系和扩增程序为：

PCR反应体系为10μL，含1×PCR缓冲液，0.2mMdNTPs,上下游引物各0.2μM，20ng绿豆品种V1128的杂交后代基因组DNA，0.5UTaq酶；

PCR扩增程序：95℃预变性5min，然后每个循环：95度变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35次循环，最后72℃延伸10min。