CN105368833A - 一种扩增禽流感病毒全基因组的引物体系及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种扩增禽流感病毒全基因组的引物体系和方法，具体地，该引物体系包括1对扩增禽流感病毒全基因组的引物对UAIV-F和UAIV-R，以及8个节段引物对；上述引物对均包含正向5ˊ-AGCRAAAGCAGG和反向3ˊ-AGTAGAAACAAG序列。该方法之一为以病毒RNA为模板，用UAIV-F和UAIV-R进行一步法RT-PCR扩增得到禽流感病毒全基因组；该方法之二为以病毒RNA为模板扩增得到cDNA，再分别以8个节段引物对扩增禽流感病毒全基因组8节段。本发明是可适用于所有禽流感病毒全基因组扩增，既包括了上述各亚型禽流感病毒的基因组以及其两端极其保守的非编码区，适用性广。
Description
技术领域
本发明涉及属于分子生物学技术领域，具体涉及一种扩增禽流感病毒全基因组的引物体系及方法。
背景技术
流行性感冒病毒简称流感病毒，是危害最大的***共患病病原，至今不仅给养禽、畜牧业带来灾难性的破坏，造成巨大的经济损失，而且常引起世界性人流感大流行，严重危害人类生命健康。流感病毒分为A、B、C三型，其中A型流感病毒危害最大，分布最广，且以禽为敏感宿主。A型禽流感病毒基因组分为8个节段PB2/PB1/PA/HA/NP/NA/M/NS，表达12种蛋白，这12种蛋白分别在病毒吸附、融合、转录翻译及新一代病毒粒子释放中各司其职。其中诱导家禽等宿主机体产生中和抗体的主要表面抗原血凝素(Hemagglutinin，HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)种类分为不同亚型，迄今所发现有17个HA亚型(H1～H16)，10个NA亚型(N1～N10)，HA/NA的多亚型、不断变异，以及内部基因的交叉重组给流感病毒防治带来困难。
尤其是近年来出现的H5N1亚型禽流感、以及2009年的H1N1大流感、2013年3月出现的新亚型禽流感H7N9等事件愈演愈烈。目前，H10N8、H5N6、H5N8等众多新亚型不断出现。这种频繁变异重组给传统的HI检测、特异HA/NA引物检测方法带来了困难。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种适用性广的扩增各亚型禽流感病毒全基因组的引物体系。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种扩增禽流感病毒全基因组的引物体系，包括1对扩增禽流感病毒全基因组的引物对:
UAIV-F：AGCRAAAGCAGG；
UAIV-R：AGTAGAAACAAGG。
作为优选，还包括扩增禽流感病毒8个节段的引物对：
PB2-F：AGCRAAAGCAGGTCAATTATATTC；
PB2-R：AGTAGAAACAAGGTCGTTT；
PB1-F：AGCRAAAGCAGGCAAACCATTTG；
FB1-R：AGTAGAAACAAGGCATTT；
PA-F：AGCRAAAGCAGGTACTGATCC；
PA-R：AGTAGAAACAAGGTACTT；
HA-F：AGCRAAAGCAGGGGT；
HA-R：AGTAGAAACAAGGGTGTTTT；
NP-F：AGCRAAAGCAGGGTT
或AGCRAAAGCAGGGTTA；
NP-R：AGTAGAAACAAGGGTATTTTT；
NA-F：AGCAAAAGCAGGAGT；
NA-R：AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT；
M-F：AGCRAAAGCAGGTAGATATTG；
M-R：AGTAGAAACAAGTAGTTTTTT；
NS-F：AGCAAAAGCAGGGTGAC；
NS-R：AGTAGAAACAAGGGTGTTTT。
一种扩增禽流感病毒全基因组的方法，以上述UAIV-F和UAIV-R为引物对病毒RNA进行一步法RT-PCR，得到禽流感病毒全基因组。
作为优选，上述方法的RT-PCR反应体系如下：10.0μL病毒RNA、10.0μL5*buffer、10.0μL10mMdNTP、1.0μLUAIV-F、1.0μLUAIV-R、1.0μL酶、DEPCH2O补足50.0μL；
其中，UAIV-F与UAIV-R的浓度均为10pmol/μL。
作为优选，上述方法的RT-PCR反应条件如下：58℃30min，94℃预变性3min，然后加入循环：94℃30s，48℃30s，72℃7.0min；进行35个循环后，72℃10min。
一种扩增禽流感病毒全基因组的方法，包括以下步骤：
1)cDNA的合成：以RT引物AGCRAAAGCAGG为反转录引物，对病毒RNA进行PCR，合成cDNA；
2)8个节段的扩增：以cDNA为模板，分别使用上述8个节段的引物对进行PCR反应，分别得到禽流感病毒全基因组8个节段的PCR产物；
3)拼接：将PCR产物进行凝胶电泳分离，检测，目的条带送交测序或克隆后测序，拼接，得到禽流感病毒全基因组。
作为优选，步骤2)中，PCR反应体系如下：12.5μLTakarapremixExTaq、0.5μLF引物、0.5μLR引物、cDNA0.5μL、灭菌双蒸水补足25.0μL；
所述F引物和R引物的浓度均为10pmol/μL。
作为优选，其PCR反应条件如下：95℃预变性5min，然后进入循环：94℃30s，48-58℃30s，72℃1-3min，35个循环后，72℃10min。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
经过对众多A型流感病毒基因组进行比对分析，发现所有A型流感病毒基因组vRNA8个节段的5'末端的13个核苷酸及3'末端的12个核苷酸高度保守，5'末端的核苷酸序列为AGUAGAAACAAGA，3'末端的核苷酸序列为UCGUCUUUGUCC；由于每一个RNA节段的5'末端和3'末端分别有部分序列互补，使病毒RNA环化形成锅柄样的结构，以保护病毒基因组。本发明提供的扩增各亚型禽流感病毒全基因组的引物体系是针对亚型禽流感病毒高度保守序列设计的，既包括了上述禽流感病毒的基因组，还包括了两端极其保守的非编码区，其中包括一对扩增各亚型禽流感病毒全基因的引物对，可采用一步法快速地获得禽流感病毒基因组，另外8对分别用于扩增8个节段PB2/PB1/PA/HA/NP/NA/M/NS的引物对，可选择性地对8个节段进行扩增并拼接得到禽流感病毒基因组。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为采用一步法RT-PCR扩增禽流感病毒全基因组的凝胶电泳图；
图2为H7N9和H9N2的PCR扩增禽流感病毒8个节段的凝胶电泳图；
图3为H5N8病毒的凝胶电泳图。
具体实施方式
以下实施例中，所采用的PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像***均为常规设备，所用试剂如未特殊说明，均为市售或通过常规的实验方法获得。
实施例1：病料的采用与病毒的分离
1)病料的采集
无菌采集病禽泄殖腔拭子和气管拭子；气管、肺脏、肠道及肠道内容物、肝脏、脾脏、肾脏和脑等组织的混合样品。
2)病毒的分离
采集的泄殖腔拭子和气管拭子先浸在灭菌生理盐水中，将鼻拭子在管壁反复挤压后取出，充分振荡管中液体，加入适量抗生素，室温静置作用30m，4000rpm离心5min，取上清液，迅速用RNA提取试剂盒提取病毒总RNA，-70℃保存。
采集的病料组织，如：气管和肺脏等组织，首先用灭菌的玻璃研磨器在无菌的条件下研磨，用Hanks液制成10％匀浆，加入双抗至最终浓度分别为2000U/mL和2000ug/mL，4℃感作4h后，取液，迅速用RNA提取试剂盒提取病毒总RNA，-70℃保存。
上述处理的病料上清液经尿囊腔羊膜腔双腔接种9-11dSPF鸡胚，0.2mL/胚，37℃孵育，每天照蛋2次，连续观察6天，弃去24h污染死胚。将死亡或濒死鸡胚置4℃4h以上，剖检，观察胚胎病变、收获尿囊液，取尿囊液，用RNA提取试剂盒提取病毒总RNA，得到病毒总RNA，-70℃保存。
本实施例中，采用TaKaRa公司病毒总RNA提取试剂盒提取病毒总RNA。
实施例2：一步法RT-PCR扩增禽流感病毒全基因组
RT-PCR反应体系：10.0μL病毒总RNA、10.0μL5*buffer、10.0μL10mMdNTP、1.0μLUAIV-F、1.0μLUAIV-R、1.0μL酶、DEPCH2O补足50.0μL；
其中，UAIV-F与UAIV-R的浓度均为10pmol/μL。
RT-PCR反应条件：58℃30min，94℃预变性3min，然后加入循环：94℃30s，48℃30s，72℃7.0min；进行35个循环后，72℃10min。取5ul-RT-PCR产物于1.5％的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳30min，检测有梯度7条带，对H9N2亚型某毒株的扩增结果如图1所示。克隆后测序或者直接测序。
图1中，M1泳道为DL5000DNAMarker；
1泳道为H9N2亚型某毒株全基因组，其中，PB2/PB12341bp、PA2233bp、HA1742bp、NP1565bp、NA1458bp、M1027bp、NS890bp。其电泳条件为：1％琼脂糖凝胶，120v条件下电泳30min条带中形成PB2/PB1-PA、HA-NP-NA、M和NS四条带型；电泳2h，PB2/PB1与PA，HA、NP与NA均可以分开。
2泳道为H7N9亚型某毒株全基因组，其中，PB2/PB12341bp、PA2233bp、HA1683bp、NP1565bp、NA1398bp、M1027bp、NS890bp。其电泳条件为：1％琼脂糖凝胶，120v条件下电泳30min条带中形成PB2/PB1-PA、HA-NP-NA、M和NS四条带型；电泳2h，PB2/PB1与PA，HA、NP与NA均可以分开。
3泳道为H5N2亚型某毒株全基因组；PB2/PB12341bp、PA2233bp、HA1779bp、NP1565bp、NA1458bp、M1027bp、NS890bp。其电泳条件为：1％琼脂糖凝胶，120v条件下电泳30min条带中形成PB2/PB1-PA、HA-NP-NA、M和NS四条带型；电泳2h，PB2/PB1与PA，HA、NP与NA均可以分开。
4泳道为阴性对照；
M2泳道为:DL2000DNAMarker。
实施例3：二步法PCR扩增禽流感病毒全基因组
1)cDNA的合成：
以RT引物AGCRAAAGCAGG为反转录引物，对病毒总RNA进行PCR，合成cDNA；
其中，该PCR的反应液如表1所示：
表1基因组cDNA合成反应液
将上述反应液混匀后，于70℃水浴5min，冰上冷却2min，加入到表2所述体系中进行反应：
表2基因组cDNA合成反应体系
室温下放置10min，55℃水浴70min，94℃作用5min，反应产物直接进行PCR扩增或-20℃保存备用，得到cDNA。
2)8个节段的扩增：以cDNA为模板，分别使用上述的8个节段的引物对进行PCR反应，分别得到禽流感病毒全基因组8个节段的PCR产物；
其中，PB2节段PCR反应体系如表3所示，为25μL体系：
表3PB2节段PCR反应体系
PB2节段PCR反应条件如下：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，共进行34个循环，最后72℃延伸10min。
PB2节段凝胶电泳条件：将5μLPCR产物于1％的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳30min，检测。目的条带送交测序或克隆后测序。
其中，PB1节段PCR反应体系如表4所示，为25μL体系：
表4PB1节段PCR反应体系
PB1节段PCR反应条件如下：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸3min，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。
PB1节段凝胶电泳条件：将5μLPCR产物于1％的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳30min，检测。目的条带送交测序或克隆后测序。
其中，PA节段PCR反应体系如表5所示，为25μL体系：
表5PA节段PCR反应体系
PA节段PCR反应条件如下：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸3min，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。
PA节段凝胶电泳条件：将5μLPCR产物于1％的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳30min，检测。将目的条带送交测序或克隆后测序。
其中，HA节段PCR反应体系如表6所示，为25μL体系：
表6HA节段PCR反应体系
HA节段PCR反应条件如下：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。
HA节段凝胶电泳条件：将5μLPCR产物于1％的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳30min，检测，将目的条带送交测序或克隆后测序。
其中，NP节段PCR反应体系如表7所示，为25μL体系：
表7NA节段PCR反应体系
NP节段PCR反应条件如下：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。
NP节段凝胶电泳条件：将5μLPCR产物于1％的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳30min，检测，将目的条带送交测序或克隆后测序。
其中，NA节段PCR反应体系如表8所示，为25μL体系：
表8NA节段PCR反应体系
NA节段PCR反应条件如下：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。
NA节段凝胶电泳条件：将5μLPCR产物于1％的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳30min，检测，将目的条带送交测序或克隆后测序。
其中，M节段PCR反应体系如表9所示，为25μL体系：
表9M节段PCR反应体系
M节段PCR反应条件如下：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。
M节段凝胶电泳条件：将5μLPCR产物于1％的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳30min，检测，将目的条带送交测序或克隆后测序。
其中，NS节段PCR反应体系如表10所示，为25μL体系：
表10NS节段PCR反应体系
NS节段PCR反应条件如下：95℃预变性5min，然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。
NS节段凝胶电泳条件：将5μLPCR产物于1％的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳30min，检测。目的条带送交测序或克隆后测序。
3)拼接：将PCR产物进行凝胶电泳分离，检测，目的条带送交测序或克隆后测序，拼接，得到禽流感病毒全基因组。
检测例1：
采用实施例3提供的方法对H7N9基因组扩增，其节段PCR反应程序如表11所示，
表11H7N9基因组8个节段扩增试验及产物长度
将5μLPCR产物于1％的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳30min，检测，其凝胶条带如图2所示，其中，M泳道为DL2000DNAMarker；1泳道为H7N9PB22341bp；2泳道为H7N9PB12341bp；3泳道为H7N9PA2233bp；4泳道为H7N9HA1683bp；5泳道为NP1565bp；6泳道为NA1398bp；7泳道为M1027bp；8泳道为NS890bp；9泳道为阴性对照；10泳道为空白。将目的条带送交测序或克隆后测序后拼接。
检测例2：
采用实施例3提供的方法对H9N2基因组扩增，其节段PCR反应程序如表12所示，
表12H9N2基因组8个节段扩增试验及产物长度
将5μLPCR产物于1％的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳30min，检测，其凝胶条带如图2所示，11泳道为H9N2PB22341bp；2泳道为H9N2PB12341bp；3泳道为H9N2PA2233bp；4泳道为H9N2HA1742bp；5泳道为H9N2NP1565bp；6泳道为H9N2NA1458bp；7泳道为H9N2M1027bp；8泳道为H9N2NS890bp。将目的条带送交测序或克隆后测序后拼接。
检测例3：
采用实施例3提供的方法对H5亚型基因组扩增，其节段PCR反应程序如表13所示，
表13基因组8个节段扩增试验及产物长度
将5μLPCR产物于1％的琼脂糖凝胶上样孔中，130V电泳30min，检测，H5N8病毒的凝胶条带如图3所示，M泳道为DL2000DNAMarker；1泳道为PB22341bp；2泳道为PB12341bp；3泳道为PA2233bp；4泳道为HA1779bp；5泳道为NP1565bp；6泳道为NA1413bp；7泳道为M1027bp；8泳道为NS890bp；9泳道为阴性对照。
由检测例的结果可知，本发明是可适用于所有禽流感病毒全基因组扩增，既包括了上述病毒的基因组，还包括了其它亚型禽流感病毒基因组两端极其保守的非编码区，本专利扩增引物为禽流感病毒通用检测引物及方法，不局限于已知或某个亚型，即通用于H1-H16，NA1-NA10所有亚型；因此，该通用引物和方法可应用于新亚型的预警和不同亚型的分别和筛查，在流行病学调查和公共卫生方面新亚型的筛查有重要意义和实际应用价值。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种扩增禽流感病毒全基因组的引物体系，包括1对扩增禽流感病毒全基因组的引物对:
UAIV-F：AGCRAAAGCAGG；
UAIV-R：AGTAGAAACAAGG。
2.如权利要求1所述的扩增禽流感病毒全基因组的引物体系，还包括扩增禽流感病毒8个节段的引物对：
PB2-F：AGCRAAAGCAGGTCAATTATATTC；
PB2-R：AGTAGAAACAAGGTCGTTT；
PB1-F：AGCRAAAGCAGGCAAACCATTTG；
FB1-R：AGTAGAAACAAGGCATTT；
PA-F：AGCRAAAGCAGGTACTGATCC；
PA-R：AGTAGAAACAAGGTACTT；
HA-F：AGCRAAAGCAGGGGT；
HA-R：AGTAGAAACAAGGGTGTTTT；
NP-F：AGCRAAAGCAGGGTT
或AGCRAAAGCAGGGTTA；
NP-R：AGTAGAAACAAGGGTATTTTT；
NA-F：AGCAAAAGCAGGAGT；
NA-R：AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT；
M-F：AGCRAAAGCAGGTAGATATTG；
M-R：AGTAGAAACAAGTAGTTTTTT；
NS-F：AGCAAAAGCAGGGTGAC；
NS-R：AGTAGAAACAAGGGTGTTTT。
3.一种扩增禽流感病毒全基因组的方法，以如权利要求1所述的UAIV-F和UAIV-R为引物对病毒RNA进行一步法RT-PCR，得到禽流感病毒全基因组。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其RT-PCR反应体系如下：10.0μL病毒RNA、10.0μL5*buffer、10.0μL10mMdNTP、1.0μLUAIV-F、1.0μLUAIV-R、1.0μL酶、DEPCH2O补足50.0μL；
其中，UAIV-F与UAIV-R的浓度均为10pmol/μL。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其RT-PCR反应条件如下：58℃30min，94℃预变性3min，然后加入循环：94℃30s，48℃30s，72℃7.0min；进行35个循环后，72℃10min。
6.一种扩增禽流感病毒全基因组的方法，包括以下步骤：
1)cDNA的合成：以RT引物AGCRAAAGCAGG为反转录引物，对病毒RNA进行PCR，合成cDNA；
2)8个节段的扩增：以cDNA为模板，分别使用权利要求2所述的8个节段的引物对进行PCR反应，分别得到禽流感病毒全基因组8个节段的PCR产物；
3)拼接：将PCR产物进行凝胶电泳分离，检测，目的条带送交测序或克隆后测序，拼接，得到禽流感病毒全基因组。
7.如权利要求6所述的方法，步骤2)中，PCR反应体系如下：12.5μLTakarapremixExTaq、0.5μLF引物、0.5μLR引物、cDNA0.5μL、灭菌双蒸水补足25.0μL；
所述F引物和R引物的浓度均为10pmol/μL。
8.如权利要求6所述的方法，其PCR反应条件如下：95℃预变性5min，然后进入循环：94℃30s，48-58℃30s，72℃1-3min，35个循环后，72℃10min。
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