CN105368729B

CN105368729B - 一株耐酸絮凝性工业酿酒酵母菌株及构建方法

Info

Publication number: CN105368729B
Application number: CN201510759592.XA
Authority: CN
Inventors: 汤岳琴; 木田建次; 苟敏; 孙照勇
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2015-11-10
Filing date: 2015-11-10
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2035-11-10
Also published as: CN105368729A

Abstract

本发明公开的是一株耐酸絮凝性工业酿酒酵母菌株及构建方法，解决了现有融合技术融合出的菌株大多只能有效兼有双亲遗传性状，而不能有效提高融合后菌株遗传性状性能的问题。本发明包括所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae SEB4)菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC11324。本发明还提供了该酿酒酵母SEB4的构建方法。本发明中融合后酿酒酵母SEB4菌株，不仅兼有双亲遗传性状，既具有亲本融合子1号良好的絮凝性和发酵能力，和亲本SEB2良好的耐酸能力；而且其在乙醇产量及葡萄糖消耗速率上均优于亲本菌株。

Description

一株耐酸絮凝性工业酿酒酵母菌株及构建方法

技术领域

本发明涉及一种酵母菌株，具体涉及的是一株耐酸絮凝性工业酿酒酵母菌株以及该菌株的构建方法。

背景技术

生物燃料乙醇被认为是可替代传统燃油的重要能源。酿酒酵母是生物乙醇工业生产中主要使用的微生物，一般菌株的最适pH值为4-5。当pH高于或低于该范围时，菌株的生长和发酵能力下降。而大规模工业化生产需要很好的控制杂菌污染，尽量降低发酵体系的pH值是比较有效的措施。此外，木质纤维素类生物质是重要的燃料乙醇生产原料，对其利用的首要步骤需采用稀酸进行预处理，由此产生的水解液pH值较低，需要调节至合适的pH值后才能用于酵母的乙醇发酵。因此，获取耐受低pH值的优良酵母菌株有助于提高乙醇生产的稳定性，降低生产成本。

原生质体融合是一种常用的微生物育种技术，指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。与其他育种技术相比，原生质体融合技术具有重组频率较高、受接合型或致育型限制较小和遗传物质更为完整等优势，因而被国内外微生物育种学者广泛应用。

发明内容

本发明的目的在于解决现有融合技术融合出的菌株大多只能有效兼有双亲遗传性状，而不能有效提高融合后菌株遗传性状性能的问题；提供一株既能有效兼有双亲遗传性状、同时还能在乙醇产量、葡萄糖消耗量及消耗速率上均优于亲本菌株的耐酸絮凝性工业酿酒酵母菌株，并提供了该菌株的构建方法。

为达到上述目的，本发明的具体技术方案如下：

一株耐酸絮凝性工业酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiaeSEB4) 菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC11324，时间为2105年9月6日。

本发明中融合后的酿酒酵母SEB4菌株，不仅兼有双亲遗传性状，即具有亲本融合子RHZ-1良好的絮凝性和发酵能力，和亲本SEB2良好的耐酸能力；而且其在乙醇产量、葡萄糖消耗量及消耗速率上均优于亲本菌株。

经过实验证明，在30°C、pH 2.2、入糖浓度为150 g/l条件下：

24 h时，酿酒酵母SEB4菌株糖消耗量为78.7%、糖消耗速率为4.9 g/l/h、乙醇产量为47.87 g/l，亲本融合子RHZ-1糖消耗量为64.9%、糖消耗速率为4.1 g/l/h、乙醇产量为35.93 g/l，亲本SEB2糖消耗量为71.6%、糖消耗速率为4.5 g/l/h、乙醇产量为32.69 g/l；

48 h时，所有菌株均可将葡萄糖全部消耗，酿酒酵母SEB4菌株乙醇产量为57.76g/l，亲本融合子RHZ-1乙醇产量为51.93 g/l，亲本SEB2乙醇产量为54.42 g/l。

如权利要求1所述酿酒酵母菌株的构建方法，包括以下步骤：

1）营养缺陷型突变菌的构建

1.1）以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae IR-2和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae SEB1为亲本，通过细胞融合方式得到融合子RHZ-1；

其中，SEB1菌株，具有乙醇生产能力，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC11321。IR-2菌株：分离自印度尼西亚发酵食品中，具有乙醇生产能力，有絮凝性，来源记载在下述文献中：Hiroshi K, Yoshio S, Toshio M, Harumi K, YorikazuS. 1985. Continuous ethanol fermentation with cell recycling usingflocculating yeast. J. Ferment. Technol. 63:159-165；该文献翻译后的名称为：使用絮凝性酵母进行带细胞循环的连续乙醇发酵；上述IR-2生物材料从日本产业技术综合研究所（National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST）获得。上述IR-2菌株和SEB1菌株的融合方法如下：

SEB1和IR-2在产孢子培养基（0.5%醋酸锂，2%琼脂）上生长3天，所得的子囊经酵母裂解酶处理得到孢子，经甲基磺酸乙酯(EMS)处理2小时，超声分散后涂到YPD平板培养，然后影印至最小营养平板上生长4天，检验在最小营养平板上不生长的菌落的营养缺陷型。从SEB1得到异亮氨酸和缬氨酸缺陷型的菌株SIV-2，从IR-2得到赖氨酸缺陷型的菌株IL-1。

上述YPD平板的构成为：2%葡萄糖，1%酵母粉，2%多聚蛋白胨，2%琼脂，其余为蒸馏水；上述最小营养平板的构成为：2%葡萄糖，0.67%无氨基酸酵母氮源，2%琼脂，其余为蒸馏水。

SIV-2和IL-1经酵母裂解酶处理2小时后，得到的原生质体在30%的PEG6000中混匀处理15分钟，涂到再生平板和选择平板上。在选择平板上生长的菌落视为融合子，融合子数量与再生原生质的数量比值为融合效率。共获得8株融合子RHZ-1（融合效率为1.1×10^-5），筛选获得利用25%糖蜜发酵产乙醇最快（1.3 g/l/h)和乙醇浓度最高(65 g/l)的融合子RHZ-1。

上述再生平板的构成为：2%葡萄糖，0.5%酵母粉，1%多聚蛋白胨，4.5%氯化钾，2%琼脂，其余为蒸馏水；上述选择平板的构成为：2%葡萄糖，0.67%无氨基酸酵母氮源，2%琼脂，其余为蒸馏水。

1.2）将融合子RHZ-1和SEB2进行紫外诱变，分别筛选出融合子RHZ-1和SEB2的单种营养缺陷型突变菌；SEB2保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC11322。

1.3）从融合子RHZ-1单种营养缺陷型突变菌中筛选出絮凝性良好的菌株，并对该菌株进行生长能力和发酵性能评价实验，挑选出发酵性能最优的菌株作为后续原生质体融合的营养缺陷型突变菌KFU；对SEB2单种营养缺陷型突变菌进行生长能力和发酵性能评价实验，筛选出性能最优的菌株作为后续原生质体融合的营养缺陷型突变菌KAGOU；

2）原生质体融合菌株的构建

2.1）以营养缺陷型突变菌KFU和营养缺陷型突变菌KAGOU作为亲本，进行原生质体细胞的融合，获得融合子RHZ-2；

2.2）将融合后的悬浮液涂布到平板上，对长出的融合子RHZ-2进行筛选，筛选出同时具有絮凝性和耐酸能力且发酵性能最佳的菌株，该菌株即为酿酒酵母SEB4。

本发明以2个工业酿酒酵母为亲本菌株，结合紫外诱变及原生质体融合技术，获取了1株发酵性能较好的耐酸絮凝性酵母菌株，可为燃料乙醇的生产提供优良的微生物资源。本发明的方法构建出的菌株，不仅兼有双亲遗传性状，即具有亲本融合子RHZ-1良好的絮凝性和发酵能力，和亲本SEB2良好的耐酸能力；而且还能有效提高融合后菌株遗传性状性能，即本发明的方法构建的融合菌株在乙醇产量、葡萄糖消耗量及葡萄糖消耗速率上均优于亲本菌株。

进一步，所述紫外诱变的具体操作过程如下：

将融合子RHZ-1和SEB2分别转入2 % YPD培养基中，30°C活化16 h；菌液经无菌水稀释后涂布到YPD平板上，平板在紫外灯下照射50 s后，于30°C静置培养即可。

更进一步地，所述单种营养缺陷型突变菌的筛选过程如下：

将经紫外灯处理的YPD平板培养的菌株落影印至MM平板上，并于30°C过夜培养，对比YPD及MM平板长出的菌落，从YPD平板上挑选出无法在MM平板生长的菌落，即营养缺陷型突变菌；

向MM平板添加不同的营养物质，每个平板1种营养物，将营养缺陷型突变菌同时接种到YPD及MM平板上培养，鉴定其营养缺陷类型，并筛选出单种营养缺陷型突变菌。

其中，2%YPD培养基包括：20 g/l葡萄糖、10 g/l酵母浸出粉、20 g/l蛋白胨，其余为蒸馏水；MM培养基包括：1.7 g/l无氨基酵母氮源、10 g/l 酵母粉、20 g/l葡萄糖，其余为蒸馏水。平板在培养基的基础上添加了20 g/l的琼脂。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

本发明中融合后酿酒酵母SEB4菌株，不仅仅兼有双亲遗传性状，即具有亲本融合子RHZ-1良好的絮凝性和发酵能力，和亲本SEB2良好的耐酸能力；而且其在乙醇产量、葡萄糖消耗量及葡萄糖消耗速率上均优于亲本菌株。

本发明中涉及保藏的微生物的保藏信息如下：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2015年9月6日；保藏编号：CGMCC11321、CGMCC11322、CGMCC11324；分类命名：Saccharomyces cerevisiae。

附图说明

图1为添加不同的营养物质时营养缺陷型突变菌的生长结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一株耐酸絮凝性工业酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae SEB4) 菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC11324。该酿酒酵母菌株SEB4的具体构建方法如下：

1）营养缺陷型突变菌的构建

1.1）以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae IR-2和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae SEB1为亲本，通过细胞融合方式得到融合子RHZ-1。

本实施例中该SEB1菌株，具有乙醇生产能力，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC11321。IR-2菌株：分离自印度尼西亚的一发酵食品中，具有乙醇生产能力，有絮凝性，来源记载在下述文献中：Hiroshi K, Yoshio S, Toshio M, HarumiK, Yorikazu S. 1985. Continuous ethanol fermentation with cell recyclingusing flocculating yeast. J. Ferment. Technol. 63:159–165；该文献翻译后的名称为：使用絮凝性酵母进行带细胞循环的连续乙醇发酵；上述IR-2生物材料从日本产业技术综合研究所（National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,AIST）获得。上述IR-2菌株和SEB1菌株的融合方法如下：

SEB1和IR-2在产孢子培养基上生长3天，所得的子囊经酵母裂解酶处理得到孢子，经甲基磺酸乙酯(EMS)处理2小时，超声分散后涂到YPD平板培养，然后影印至最小营养平板上生长4天，检验在最小营养平板上不生长的菌落的营养缺陷型。从SEB1得到异亮氨酸和缬氨酸缺陷型的菌株SIV-2，从IR-2得到赖氨酸缺陷型的菌株IL-1。

上述产孢子培养基的构成为：0.5%醋酸锂，2%琼脂，其余为蒸馏水；上述YPD平板的构成为：2%葡萄糖，1%酵母粉，2%多聚蛋白胨，2%琼脂，其余为蒸馏水；上述最小营养平板的构成为：2%葡萄糖，0.67%无氨基酸酵母氮源，2%琼脂，其余为蒸馏水。

1.2）将融合子RHZ-1和SEB2进行紫外诱变，分别筛选出融合子RHZ-1和SEB2的单种营养缺陷型突变菌；SEB2保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC11322。具体过程如下：

首先，将融合子RHZ-1和SEB2分别转入2% YPD培养基中，30°C活化16 h；菌液经无菌水稀释后涂布到YPD平板上，平板在紫外灯下照射50 s后，于30°C静置培养。

其次，在静置培养2 d后将平板长出的菌落影印至MM平板，并于30°C过夜培养。对比YPD及MM平板长出的菌落，从YPD平板上挑选出无法在MM平板生长的菌落，即营养缺陷型突变菌。经过4次反复筛选验证，最终获得3株融合子RHZ-1的营养缺陷型菌株，每株挑选2个克隆，分别命名为：KFU-A1、KFU-A2；KFU-B1、KFU-B2；KFU-C1、KFU-C2；获得5株SEB2的营养缺陷型菌株，每株挑选2个克隆，分别命名为：KAGOU-A1、KAGOU-A2；KAGOU-B1、KAGOU -B2；KAGOU-C1、KAGOU -C2；KAGOU-D1、KAGOU-D2；KAGOU-E1、KAGOU-E2。

最后，向MM平板中添加不同的营养物质，每个平板1种营养物，共22种，如表1所示，将营养缺陷型突变菌同时接种到YPD及MM平板上培养，培养结果如图1所示，图1(a)中为融合子RHZ-1的营养缺陷型菌株，图1(b)中为SEB2的营养缺陷型菌株。

通过图1显示：KFU-A1，KFU-A2和KAGOU-D1，KAGOU-D2为4株尿嘧啶缺陷型菌株(Ura^-)；KFU-B1，KFU-B2为2株赖氨酸缺陷型菌株(Lys^-)；KFU-C1，KFU-C2为2株半胱氨酸缺陷型菌株(Cys^-)；KAGOU-B1，KAGOU-B2为2株腺嘌呤缺陷型菌株(Ade^-)；KAGOU-E1，KAGOU-E2为2株组氨酸缺陷型菌株(His^-)；KAGOU-A1，KAGOU-A2，KAGOU-C1，KAGOU-C2在所有MM平板上均不生长。

通过上述结果表明：KAGOU-A1，KAGOU-A2，KAGOU-C1和KAGOU-C2这4株菌为两种或多种不同营养缺陷型菌株，无法用于原生质体融合子的筛选，后续不再对其进行考察。

本实施例筛选出的单种营养缺陷型突变菌为：KFU-A1、KFU-A2、KFU-B1、KFU-B2、KFU-C1和KFU-C2；以及KAGOU-B1、KAGOU-B2、KAGOU-D1、KAGOU-D2、KAGOU-E1和KAGOU-E2。

表1

其中，2%YPD培养基：20 g/l葡萄糖，10 g/l酵母浸出粉，20 g/l蛋白胨。MM培养基：1.7 g/l无氨基酵母氮源，10 g/l 酵母粉，20 g/l葡萄糖。平板是在培养基的基础上添加了20 g/l的琼脂。

1.3）筛选出作为后续原生质体融合的亲本菌株

1.3.1）筛选出融合子RHZ-1单种营养缺陷型突变菌中絮凝性良好的菌株，并对该菌株进行生长能力和发酵性能评价实验，挑选出发酵性能最优的菌株作为后续原生质体融合的营养缺陷型突变菌KFU；具体过程如下：

将融合子RHZ-1单种营养缺陷型突变菌接种至2%YPDU培养基中培养16 h，分别取5ml菌体培养液于试管中，经漩涡振荡均匀，静置不同时间后观察菌株的絮凝性，经过观察发现除菌株KFU-A2外，其它菌株均保留有亲本融合子RHZ-1的良好絮凝性。所述2%YPDU培养基包括：2 g/l蛋白胨，1 g/l 硫酸铵，20 g/l葡萄糖，0.04 g/l尿嘧啶，其余为蒸馏水。

因此，考察除菌株KFU-A2外所有菌株在酸性条件下的生长能力；生长能力评价步骤为：将融合子RHZ-1突变菌株分别接种至pH 3.0和pH 2.7的2%YPDU培养基中，并在35°C条件下于小型试管培养仪(ADVANTEC，日本)中培养，仪器自动记录不同pH值下菌体生长24小时的OD₆₆₀值；结果如表2所示。

表2

通过表2可知，菌株KFU-A1，KFU-B1，KFU-B2在pH 3.0和pH 2.7条件下，生长能力均与亲本融合子RHZ-1菌株接近；菌株KFU-C1和KFU-C2的生长有部分抑制，但KFU-C1的生长在pH 2.7条件下严重被抑制。

因此，选择菌株KFU-A1，KFU-B2和KFU-C2进行发酵性能评价。

发酵性能评价的具体评价过程如下：将亲本融合子RHZ-1的单种营养缺陷型突变菌株分别接种至5%YPDU培养基(pH自然)中，并于30°C，160 rpm(摇床振荡)预培养16 h。再接种至pH 2.7的15%YPDU培养基中，于35°C，400 rpm(磁力搅拌)发酵48 h，定期取发酵液检测总细胞数、葡萄糖浓度和乙醇浓度。通过发酵性能评价后得到如下结果：菌株KFU-B2(Lys^-)具有较高的发酵性能，其在细胞存活数，乙醇产量，葡萄糖消耗方面优于其他菌株。所述5%YPDU培养基：将2%YPDU培养基中的葡萄糖浓度调整为50 g/l，其余组分不变；所述15% YPDU培养基：将2%YPDU培养基中的葡萄糖浓度调整为150 g/l，其余组分不变。

综上，因而选择KFU-B2作为后续原生质体融合的亲本菌株。

1.3.2）对SEB2单种营养缺陷型突变菌进行生长能力和发酵性能评价实验，筛选出性能最优的菌株作为后续原生质体融合的营养缺陷型突变菌KAGOU；具体过程如下：

以亲本菌株SEB2作为对照，采用与上述融合子RHZ-1菌株相同的生长能力评价步骤，比较SEB2各突变菌株的生长速率μ_max(h^-1)，OD₆₆₀达到0.5所需时间t_OD660=0.5(min)以及达到的最大OD_max，具体结果如表3所示。

表3

通过表3可知：在pH 3.0和pH 2.7条件下，菌株KAGOU-E1，KAGOU-E2的生长能力与亲本SEB2类似。而其他菌株的生长受到一定抑制，当pH为2.7时，抑制情况更加明显。

同时，选择菌株KAGOU-B2，KAGOU-D2和 KAGOU-E2进行发酵性能评价。即通过与上述融合子RHZ-1菌株相同的发酵性能评价步骤，与亲本菌株SEB2进行对比，发酵实验显示：KAGOU-E2 (His^-)在细胞存活数，乙醇产量，葡萄糖消耗方面，均比其余两个菌株具有较好的性能。

综上，因此选择KAGOU-E2作为后续原生质体融合的亲本菌株。

2）原生质体融合菌株的构建

2.1）以营养缺陷型突变菌KFU-B2(Lys^-)和营养缺陷型突变菌KAGOU-E2(His^-)作为亲本，进行原生质体细胞的融合，获得融合子RHZ-2；

原生质体制备过程中，测得两菌株的原生质体形成率均达到100%，KFU-B2和KAGOU-E2的原生质体再生率分别为4.0%和7.5%，表明酵母细胞破壁较为理想，有利于下一步融合。

2.2）将融合后的悬浮液涂布到平板上，对长出的融合子RHZ-2进行筛选，共获得16株融合菌株，命名为SEB4~11，F2-1~F2-8。对上述16株融合菌株均考察了絮凝性，表明所有的融合菌株均具有亲本融合子RHZ-1同等程度的絮凝性。同时，在30°C酸性条件下，所有融合菌株均可以发酵葡萄糖产乙醇，表明它们被赋予了亲本SEB2的耐酸特性。

即本发明既具有亲本融合子RHZ-1同等程度的絮凝性，也具有亲本SEB2的耐酸特性。

本发明对上述16株融合菌株进行发酵性能检测，通过实验证明：菌株SEB4的发酵性能最佳，其在乙醇产量、葡萄糖消耗量及葡萄糖消耗速率上均优于亲本菌株。菌株SEB4的具体发酵性能结果如下：

24 h时，菌株SEB4消耗了最多的葡萄糖，残糖量为31.88 g/l (糖消耗量为78.7%，糖消耗速率为4.9 g/l/h)，乙醇产量为47.87 g/l。

而此时，亲本融合子RHZ-1和亲本SEB2的残糖量分别为52.7 g/l (糖消耗量为64.9%，糖消耗速率为4.1 g/l/h)和42.51 g/l(糖消耗量为71.6%，糖消耗速率为4.5 g/l/h)，乙醇产量均比SEB4低，分别为35.93 g/l和32.69 g/l。

48 h时，菌株SEB4和亲本菌株均能在48 h时将葡萄糖全部消耗，且SEB4的乙醇产量最高，为57.76 g/l，亲本融合子RHZ-1和亲本SEB2的乙醇产量分别为51.93和54.42 g/l。

综上所述，本研究以IR-2和SEB1构建的融合子RHZ-1，以及SEB2为出发菌株，通过原生质体细胞融合的方式，最终获得一株兼有双亲遗传性状，且具有优秀乙醇发酵性能的耐酸絮凝性酿酒酵母菌株SEB4(Lys⁺, His⁺)。

上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明保护范围的限制，但凡采用本发明的设计原理，以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变化，均应属于本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株耐酸絮凝性工业酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae SEB4)菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNo.11324。