CN105358703A - 用于使用N-末端截短的β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶变体的糖蛋白的单-和二唾液酸化的方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及具有N-末端截短缺失的某些糖基转移酶变体的用途。发现人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I(hST6Gal-I)的两种不同的截短变体的组合表现出不同的唾液酸转移酶比活性。在一个例子中，在其中第一变体?89？hST6Gal-I催化双唾液酸化目标分子的形成的条件下，第二变体?108？hST6Gal-I催化单唾液酸化目标分子的形成。因此，公开了哺乳动物糖基转移酶的变体，编码其的核酸，用于重组产生哺乳动物糖基转移酶的变体的方法和方式及其用途，特别是用于以定量受控方式唾液酸化作为糖蛋白诸如免疫球蛋白的部分的聚糖部分的末端受体基团的用途。

Description

用于使用N-末端截短的β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶变体的糖蛋白的单-和二唾液酸化的方法

本公开涉及具有N-末端截短缺失的某些糖基转移酶变体的用途。发现人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I(hST6Gal-I)的两种不同的截短变体的组合表现出不同的唾液酸转移酶比活性。在一个例子中，在其中第一变体∆89 hST6Gal-I催化双唾液酸化目标分子的形成的条件下，第二变体∆108 hST6Gal-I催化单唾液酸化目标分子的形成。因此，公开了哺乳动物糖基转移酶的变体，编码其的核酸，用于重组产生哺乳动物糖基转移酶的变体的方法和方式及其用途，特别是用于以定量受控方式唾液酸化作为糖蛋白诸如免疫球蛋白的部分的聚糖部分的末端受体基团的用途。

背景

转移酶(EC 2)催化官能团从一种物质转移至另一种物质。糖基转移酶，酶的一个超家族，参与合成糖蛋白、糖脂和糖胺聚糖的碳水化合物部分。特定糖基转移酶通过将活化的糖供体的单糖部分的相继转移至受体分子来合成寡糖。因此，“糖基转移酶”催化糖部分从其核苷酸供体转移至多肽、脂质、糖蛋白或糖脂的受体部分。该过程也被称为“糖基化”。作为例如糖蛋白的结构部分的碳水化合物部分也被称为“聚糖”。聚糖构成最流行的所有已知的翻译后蛋白修饰。聚糖参与和粘附、免疫应答、神经细胞迁移和轴突延伸一样多样的广泛系列的生物识别过程。作为糖蛋白的结构部分，聚糖也在蛋白折叠和蛋白稳定性和生物活性的支持中具有作用。

在糖基转移酶催化中，单糖单元葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、葡糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)和木糖被活化为尿苷二磷酸(UDP)-α-D衍生物；***糖被活化为UDP-β-L衍生物；甘露糖(Man)和岩藻糖分别被活化为GDP-α-D和GDP-β-L衍生物；且唾液酸(= Neu5Ac；= SA)被活化为β-D-Neu5Ac的CMP衍生物。

许多不同的糖基转移酶有助于聚糖的合成。糖蛋白的碳水化合物部分的结构多样性特别大，且通过复杂的生物合成途径来确定。在真核生物中，糖蛋白的聚糖-部分的生物合成发生于内质网(“ER”)和高尔基体的内腔中。糖蛋白的单一(支链或直链)碳水化合物链通常是N-或O-连接的聚糖。在翻译后加工过程中，碳水化合物通常经由天冬酰胺(“N-连接的糖基化”)，或经由丝氨酸或苏氨酸(“O-连接的糖基化”)连接至多肽。聚糖的合成（无论N-连接或O-连接(=“N-/O-连接的”)）由几种不同的膜锚定的糖基转移酶的活性影响。糖蛋白可以包含一个或多个聚糖连接的氨基酸(=“糖基化位点”)。特定聚糖结构可以是直链或支链的。支链是碳水化合物的显著特征，其与DNA、RNA和多肽通常的线性性质相反。与它们的基本构建块的大异质性组合，单糖，多糖结构表现出高多样性。此外，在特别的糖蛋白种类的成员中，连接至特定糖基化位点的聚糖的结构可以变化，因此导致各自糖蛋白种类(即，共享多肽部分的相同氨基酸序列的种类)的微异质性（microheterogeneity）。

唾液酸转移酶(=“ST”)是催化唾液酸(= 5-N-乙酰神经氨酸 = Neu5Ac = NANA)残基从供体化合物转移至(ⅰ)糖脂或神经节苷脂的末端单糖受体基团或(ii)糖蛋白的N-/O-连接的聚糖的末端单糖受体基团的糖基转移酶。对于哺乳动物唾液酸转移酶（其包括人ST种类），存在作为胞苷-5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸(= CMP-Neu5Ac = CMP-NANA)的共同供体化合物。唾液酸残基的转移也被称为“唾液酸化(sialylating)”和“唾液酸化(sialylation)”。

在唾液酸化的糖蛋白的聚糖结构中，通常在寡糖的末端位置中发现(一个或多个)唾液酸部分。由于所述末端（即暴露位置），唾液酸可以参与许多不同的生物识别现象且服务于不同种类的生物相互作用。在糖蛋白中，可以存在多于一个唾液酸化位点，即能够充当唾液酸转移酶的底物且作为适合于唾液酸残基的转移的受体基团的位点。此类多于一个位点原则上可以是锚定在糖蛋白的不同的糖基化位点的多个线性聚糖部分的末端。此外，支链聚糖可以具有其中可以发生唾液酸化的多个位点。

根据目前知识，可以发现末端唾液酸残基(ⅰ)α2→3(α2,3)连接至半乳糖基-R，(ii) α2→6(α2,6)连接至半乳糖基-R，(iii) α2→6(α2,6)连接至N-乙酰半乳糖胺基-R，(ⅳ)α2→6(α2,6)连接至N-乙酰葡糖胺基-R，和(v)α2→8/9(α2,8/9)连接至唾液酸基(sialidyl)-R，其中-R表示受体底物部分的其余部分。因此，唾液酸缀合物的生物合成(=“唾液酸化”)中有活性的唾液酸转移酶通常根据其各自的单糖受体底物且根据其催化的糖苷键的3、6或8/9位置进行命名和分类。因此，在本领域已知的文献中，例如在Patel RY,等人, Glycobiology 16 (2006) 108-116中，根据转移Neu5Ac残基、同时形成糖苷键的受体糖残基的羟基位置，参考真核生物唾液酸转移酶，诸如(i) ST3Gal, (ii) ST6Gal, (iii) ST6GalNAc, 或(v) ST8Sia。也可以更通用的方式参考唾液酸转移酶，例如，作为ST3、ST6、ST8；因此，“ST6”明确涵盖催化α2,6唾液酸化的唾液酸转移酶。

二糖部分β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺(= Galβ1,4GlcNAc)是糖蛋白的N-连接的聚糖的触角(antennae)的常见末端残基，但也可以存在于O-连接的聚糖和糖脂中。酶β-半乳糖苷-α2,6-唾液酸转移酶(= “ST6Gal”)能够催化聚糖的末端Galβ1,4GlcNAc或聚糖的支链(=“触角(antennae)”)的α2,6-唾液酸化。对于其一般方面，参考DallOlio F. Glycoconjugate Journal 17 (2000) 669-676的文献。在人和其它哺乳动物中，似乎存在几种ST6Gal。本公开特别涉及人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I(= hST6Gal-I；根据IUBMB酶命名法，EC 2.4.99.1)，但不限于此。

唾液酸转移酶的ST6组包含2个亚组，ST6Gal和ST6GalNAc。ST6Gal酶的活性催化Neu5Ac残基转移至作为聚糖的末端Galβ1,4GlcNAc的部分或聚糖的触角的游离半乳糖基残基的C6羟基，从而在聚糖中形成α2→6连接至Galβ1,4GlcNAc部分的半乳糖基残基的末端唾液酸残基。聚糖中所得新形成的末端部分是Neu5Acα2,6Galβ1,4GlcNAc。

人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I (hST6Gal-I)的野生型多肽在本文献申请时在公开可得的NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/115445)中被公开为“UniProtKB/Swiss-Prot: P15907.1”。包括编码序列的进一步信息被提供为数据库条目“Gene ID:6480”内编译的超链接(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6480)。

哺乳动物唾液酸转移酶与其它哺乳动物高尔基体驻留的（Golgi-resident）糖基转移酶共享所谓的“II型构造（type II architecture）”，其具有(i) 短胞质N-末端尾部，(ii) 跨膜片段，随后为(iii) 可变长度的茎区域和(iv) 面向高尔基体的内腔的C-末端催化结构域(Donadio S.等人 in Biochimie 85 (2003) 311-321)。哺乳动物唾液酸转移酶表现出在它们的催化结构域中展示显著的序列同源性。

Donadio S.等人在CHO细胞中表达hST6Gal-I的几种N-末端截短的变体，且发现包含前35、48、60和89个氨基酸的N-末端缺失产生突变酶，然而其在将唾液酸转移至外源受体中仍然具有活性。

糖基化是影响蛋白折叠、稳定性和生物活性的调节的蛋白的重要的翻译后修饰。唾液酸部分(=唾液酸，5-N-乙酰神经氨酸，Neu5Ac)通常暴露于N-糖基化的末端位置并因此，是对于生物识别和配体功能的重要贡献因素，例如，特征在于末端唾液酸的IgG被显示诱导更少的炎症反应和增加的血清半衰期。

使用糖基转移酶用于酶促合成定义的聚糖结构正成为引导治疗性蛋白诸如抗体的N-糖基化的工具。由于原核生物来源的糖基转移酶通常不对复杂糖蛋白结构起作用，所以哺乳动物来源的唾液酸转移酶是优选的。例如，Barb等人 (2009)使用分离的人ST6Gal-I制备免疫球蛋白G的Fc片段的高度有效的唾液酸化的形式。然而，由于在各种宿主(毕赤酵母(Pichia pastoris)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和大肠杆菌)中的低表达和/或不良活性，重组ST6Gal-I用于治疗应用仍然受限。

本领域已知的是，哺乳动物糖基转移酶可以有利地用于在体外唾液酸化复杂的目标分子诸如糖蛋白或糖脂的触角受***点。然而，仍然缺乏以定量控制的方式进行唾液酸化(特别是关于具有两个或更多个能够被唾液酸化的受***点的目标分子)的手段和方法。也就是说，期望提供了与唾液酸化目标分子的两个或更多个或甚至所有受***点相反，允许唾液酸化几个受***点中的仅一个的方式、方法和条件。进一步期望在批次唾液酸化反应混合物中控制目标分子的单事件唾液酸化及其多事件唾液酸化之间的平衡。

令人惊讶地，最初发现两种截短变体∆89 hST6Gal-I和∆108 hST6Gal-I表现出不仅对抗体、而且对其它目标分子的不同的体外唾液酸化活性。显然，IgG-Fc触角聚糖G2在可以被唾液酸化的分枝的末端具有两个半乳糖部分。在相同的反应条件下，∆89 hST6Gal-I优选催化双唾液酸化聚糖(G2 + 2SA)的合成，而变体∆108 hST6Gal-I合成单唾液酸化聚糖(G2 + 1SA)。因此，两种酶都是适合用于聚糖结构、特别是N-聚糖的选择性唾液酸化的工具。

本发明人的最初发现是人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的∆108 hST6Gal-I变体主要能够将仅单一唾液酸残基添加至具有两个或更多个触角受***点的目标分子。相比之下，人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I及其特定变体诸如∆89 hST6Gal-I的酶促活性导致目标分子的多重唾液酸化。因此，借助使用单独的∆108 hST6Gal-I，例如在分批处理中，单-唾液酸化的目标分子可以从具有两个或更多个非唾液酸化的触角受***点的目标分子产生。

这为许多不同的方法、特别是在体外糖工程改造免疫球蛋白和还有其它糖基化的目标分子的领域中铺平了道路。此处，具体地和示例性地提供了导致产生单唾液酸化和双唾液酸化的免疫球蛋白G分子的方法，其中其比率借助控制(i)∆108 hST6Gal-I酶促活性和(ii)能够以饱和方式唾液酸化目标分子的受***点的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的酶促活性的量来控制。然而，定量唾液酸化控制待唾液酸化的目标分子的许多其它体外唾液酸化方法变得可行，且可以从本公开内容来推断。

在一个具体实施方案中，本文献公开了通过在HEK293细胞中瞬时基因表达而高产量表达人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I(hST6Gal-I, EC 2.4.99.1；数据库条目P15907)的两种不同变体，其中产率高达100 mg/L。发现两种变体的特征在于令人惊讶不同的唾液酸化活性。

概述

在第一个方面，在此公开了SEQ ID NO:3的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I(Δ108 hST6Gal-I)用于从目标分子特异性形成单唾液酸化目标分子的用途，其中所述目标分子选自糖蛋白或糖脂，其中所述目标分子包含多个触角目标部分，所述触角目标部分具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分，其中所述单-唾液酸化目标分子包含单一唾液酸化末端触角目标部分，且其中所述唾液酸化末端触角目标部分包含一个N-乙酰神经氨酰基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基。

在进一步的方面中，公开了用于体外产生具有添加至目标分子的一个触角末端结构的单一唾液酸残基的唾液酸化目标分子的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供组合物，所述组合物包含(i)目标分子，所述目标分子选自糖蛋白和糖脂，所述目标分子包含多个触角，所述触角中的至少两个各自具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分；(ii)SEQ ID NO:3的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I(∆108 hST6Gal-I)；(iii)胞苷-5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸或其功能等效物，作为用于唾液酸转移酶催化的反应的供体化合物；(b)在允许糖基转移酶酶促活性的条件下温育步骤(a)的组合物，从而每个目标分子形成单一末端触角N-乙酰神经氨酰基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基(=α2,6唾液酸化末端触角残基)；从而体外产生具有添加至目标分子的一个触角末端结构的单一唾液酸残基的唾液酸化目标分子。

在还进一步的方面中，公开了选自糖蛋白和糖脂的单-唾液酸化目标分子，所述单-唾液酸化目标分子可通过如本文公开的方法获得。

在还进一步的方面中，公开了包含允许糖基转移酶酶促活性的水性缓冲剂的组合物，所述组合物进一步包含：(a)糖基化目标分子，所述目标分子选自糖蛋白和糖脂，所述目标分子包含多个触角，所述触角中的至少两个各自具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分；(b)SEQ ID NO:2的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I (Δ89 hST6Gal-I)或具有高于或等于Δ89 hST6Gal-I的酶促活性的唾液酸转移酶酶促活性的可溶性N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I变体；(c)SEQ ID NO:3的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I (Δ108 hST6Gal-I)；(d)胞苷-5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸或其功能等效物，作为用于唾液酸转移酶催化的反应的供体化合物。

在还进一步的方面中，公开了如本文公开的组合物用于在体外和允许糖基转移酶酶促活性的条件下产生具有添加至目标分子的一个或多个触角末端结构的一个或多个唾液酸残基的唾液酸化目标分子的用途。

在还进一步的方面中，公开了用于体外产生具有受控量的添加至目标分子的一个或多个触角末端结构的唾液酸残基的唾液酸化目标分子的方法，所述目标分子选自糖蛋白和糖脂，所述目标分子包含多个触角，所述触角中的至少两个各自具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分，所述方法包括以下步骤：(a)提供如本文公开的组合物；(b)在允许糖基转移酶酶促活性的条件下且持续预定时间间隔温育步骤(a)的组合物，从而形成末端触角N-乙酰神经氨酰基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基[=α2,6唾液酸化末端触角残基]；其中Δ89 hST6Gal-I催化双唾液酸化IgG的形成且Δ108 hST6Gal-I催化单唾液酸化IgG的形成，从而体外产生具有受控量的添加至目标分子的一个或多个触角末端结构的唾液酸残基的唾液酸化目标分子。

在还进一步的方面中，公开了糖基化的目标分子的制备物，所述目标分子为IgG亚类的免疫球蛋白分子，其中所述制备物中的单和双唾液酸化的目标分子的量是受控量，所述制备物通过如本文公开的方法获得。

附图说明

图1 纯化的HEK细胞中表达的重组hST6Gal-I变体的SDS-PAGE。泳道1和4：分子量标记物；泳道2：将5 µg纯化的酶∆108 hST6Gal-I上样至凝胶；泳道3：将5 µg纯化的酶∆89 hST6Gal-I上样至凝胶上。

图2 使用重组△89 hST6Gal-I唾液酸化脱唾液酸MAB IgG4的时程。显示具有末端半乳糖残基的聚糖(G2+0SA，“脱唾液酸”)、单唾液酸化的聚糖(G2+1SA)和双唾液酸化的聚糖(G2+2SA)的相对含量。

图3 使用重组Δ108 hST6Gal-I唾液酸化脱唾液酸MAB IgG4的时程。显示具有末端半乳糖残基的聚糖(G2+0SA；“脱唾液酸”)、单唾液酸化的聚糖(G2+1SA)和和双唾液酸化的聚糖(G2+2SA)的相对含量。

详述

术语 “一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”通常包括复数对象，除非上下文另有清楚指出。如本文所使用，“多个/种”被理解为是指多于一个/种。例如，多个/种是指至少两个/种、三个/种、四个/种、五个/种或更多个/种。除非特别说明或从上下文显而易见，如本文所使用，术语“或”被理解为是包括性的。

除非特别说明或从上下文显而易见，如本文所使用，术语“约”被理解为在本领域中的正常公差的范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可以被理解为在所示值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%内。除非从上下文另外清楚，本文提供的所有数值可以通过术语约进行修饰。

术语“氨基酸” 通常是指可以掺入肽、多肽或蛋白的任何单体单位。如本文所使用，术语“氨基酸”包括下列二十种天然或遗传编码的α-氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷胺酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。在其中“X”残基未定义的情况下，这些应该定义为“任何氨基酸”。这二十种天然氨基酸的结构显示于例如Stryer等人, Biochemistry, 第5版, Freeman and Company (2002)。额外的氨基酸，诸如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸，也可以被遗传编码(Stadtman (1996) “Selenocysteine,” Annu Rev Biochem. 65:83-100和Ibba等人 (2002) “Genetic code: introducing pyrrolysine,” Curr Biol. 12(13):R464-R466)。术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸、修饰的氨基酸(例如，具有修饰的侧链和/或骨架)和氨基酸类似物。参见，例如Zhang等人 (2004) “Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887, Anderson等人 (2004) “An expanded genetic code with a functional quadruplet codon” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571, Ikeda等人 (2003) “Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo,” Protein Eng. Des. Sel. 16(9):699-706, Chin等人 (2003) “An Expanded Eukaryotic Genetic Code,” Science 301(5635):964-967, James等人 (2001) “Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues,” Protein Eng. Des. Sel. 14(12):983-991, Kohrer等人 (2001) “Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25):14310-14315, Bacher等人 (2001) “Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue,” J. Bacteriol. 183(18):5414-5425, Hamano-Takaku等人 (2000) “A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine,” J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328, 和Budisa等人 (2001) “Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids,” Protein Sci. 10(7):1281-1292。为了进一步说明，氨基酸通常为包括取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的羧基和一种或多种侧链或基团，或这些基团的任一种的类似物的有机酸。示例性侧链包括，例如巯基、硒基、磺酰基、烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤素、酰肼、烯基、炔基、醚基、硼酸酯(borate)、硼酸盐(boronate)、二氧磷基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺或这些基团的任何组合。其它代表性氨基酸包括但不限于，包含光敏交联剂的氨基酸、金属结合氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、含有金属的氨基酸、具有新型官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、对光不稳(photocaged)和/或可光异构化的氨基酸、放射性氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化的氨基酸、其它碳水化合物修饰的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化学可切割的和/或光可切割的氨基酸、含有碳连接糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含有氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或多个毒性部分的氨基酸。

术语“蛋白”是指作为核糖体翻译过程的产物的多肽链(氨基酸序列)，其中所述多肽链已经经历翻译后折叠过程，产生三维蛋白结构。术语“蛋白”还涵盖具有一种或多种翻译后修饰诸如(但不限于)糖基化、磷酸化、乙酰化和泛素化的多肽。

如本文公开的任何蛋白、特别是如本文公开的重组产生的蛋白，在一个具体实施方案中可以包括“蛋白标签”，其为遗传上接枝(grafted)至重组蛋白上的肽序列。蛋白标签可以包含具有促进通过蛋白水解去除标签的特异性蛋白酶切割位点的接头序列。作为一个具体实施方案，“亲和标签”被附加至目标蛋白，使得可以使用亲和技术从其粗生物来源纯化目标。例如，所述来源可以是表达目标蛋白的转化的宿主生物体或由转化的宿主生物体将目标蛋白分泌至其中的培养上清液。亲和标签的具体实施方案包括几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。聚(His)标签是促进结合至某些金属螯合基质的广泛使用的蛋白标签。

术语“嵌合蛋白”、“融合蛋白”或“融合多肽”是指其氨基酸序列代表来自至少两种不同蛋白的氨基酸序列的子序列的融合产物的蛋白。融合蛋白通常不是通过氨基酸序列的直接操作产生，而是从编码该嵌合氨基酸序列的“嵌合”基因表达。

术语“重组体”是指已经通过重组方法有意识地修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。本文中的术语“重组核酸”是指通常通过内切核酸酶操作核酸，最初在体外形成的呈自然中通常不存在的形式的核酸。因此，线性形式的分离的突变DNA聚合酶核酸或通过连接通常不接合的DNA分子在体外形成的表达载体都被认为是用于本发明的目的的重组体。应当理解的是，一旦制备重组核酸且重新引入宿主细胞，其将非重组地复制，即，使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作；然而，此类核酸，一旦重组产生，尽管随后非重组复制，仍然被认为是用于本发明的目的的重组体。“重组蛋白”或“重组产生的蛋白”是使用重组技术(即通过上述重组核酸的表达)而制备的蛋白。

当核酸被置于与另一核酸序列的功能性关系中时，其为“可操作连接的”。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作连接；或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则其与编码序列可操作连接。

术语“宿主细胞”是指单细胞的原核生物和真核生物体(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌、酵母和放线菌)两者，和当在细胞培养物中生长时来自高等植物或者动物的单一细胞。

术语“载体”指DNA片段，通常为双链的，其可以具有***其中的外源DNA片段。载体可以是例如质粒来源的。载体含有在宿主细胞中促进载体的自主复制的“复制子”多核苷酸序列。外源DNA被定义为异源DNA，其是在宿主细胞中天然不存在的DNA，例如，其复制载体分子，编码可选择或可筛选的标记物，或者编码转基因。载体用于将外源的或异源的DNA转运入合适的宿主细胞。一旦在宿主细胞中，载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA同时复制，且可以生成载体及其***的DNA的几个拷贝。此外，载体还可以含有容许***的DNA转录为mRNA分子或者以其它方式引起***的DNA复制为多拷贝的RNA的必要元件。一些表达载体额外含有***的DNA邻近的序列元件，其增加表达的mRNA的半衰期，和/或允许所述mRNA翻译为蛋白分子。因此，可以迅速地合成***的DNA编码的mRNA和多肽的许多分子。

术语“核酸”或“多核苷酸”可互换使用且是指聚合物，其可以对应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物或其类似物。这包括核苷酸的聚合物诸如RNA和DNA，以及其合成形式、修饰(例如化学或生物化学修饰的)形式，和混合聚合物(例如包括RNA和DNA亚单位两者)。示例性修饰包括甲基化，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰诸如不带电的连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物(phosphoramidates)、氨基甲酸酯等)，悬垂部分(pendent moieties)(例如多肽)，嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)，螯合剂，烷化剂，和修饰的连接(例如α异头核酸等)。还包括在其经由氢键键合和其它化学相互作用结合至指定序列的能力中模拟多核苷酸的合成分子。尽管合成形式的核酸可以包含其它连接(例如，如Nielsen等人(Science 254:1497-1500, 1991)描述的肽核酸)，通常核苷酸单体经由磷酸二酯键连接。核酸可以是或可以包括，例如，染色体或染色体区段、载体(例如表达载体)、表达盒、裸DNA或RNA聚合物、聚合酶链式反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针和引物。核酸可以是，例如，单链、双链、或三链的，并且不限于任何特别的长度。除非另外指出，除了明确指出的任何序列以外，特定的核酸序列还包含或编码互补序列。

术语“糖基化”是指将糖基残基共价偶联至受体基团的化学反应。一种特异性受体基团是羟基，例如另一种糖的羟基。“唾液酸化”是糖基化的一种具体形式，其中所述受体基团与唾液酸(= N-乙酰神经氨酸)残基反应。此类反应通常由唾液酸转移酶使用胞苷-5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸作为供体化合物或共底物进行催化。

“唾液酸化”是糖基转移酶酶促活性(在具体情况下的唾液酸转移酶酶促活性)在允许其的条件下的结果的特定实施方案。通常，技术人员理解，可以进行糖基转移酶酶促反应 (=“允许糖基转移酶酶促活性”) 的水性缓冲剂需要使用缓冲盐诸如Tris、MES、磷酸盐、乙酸盐或具体地能够缓冲在pH 6至pH 8的pH范围、更具体地pH 6至pH 7的范围内、甚至更具体地能够缓冲约pH 6.5的溶液的另一种缓冲盐进行缓冲。该缓冲剂可以进一步含有中性盐，诸如但不限于NaCl。进一步，在具体实施方案中，技术人员可以考虑向水性缓冲剂中添加包含二价离子诸如Mg²⁺或Mn²⁺的盐，例如但不限于MgCl₂和MnCl₂。本领域已知的允许糖基转移酶酶促活性的条件包括环境(室内)温度，但更通常为0℃至40℃、特别是10℃至30℃、特别是20℃的范围内的温度。

术语“聚糖”是指聚糖或寡糖，即，在酸水解之后产生多个单糖的多聚化合物。糖蛋白包含通常经由天冬酰胺或精氨酸(“N-连接的糖基化”)或经由丝氨酸或苏氨酸(“O-连接的糖基化”)共价偶联至多肽链的侧基的一个或多个聚糖部分。

使用糖基转移酶用于酶促合成复杂多糖结构是一种获得复杂的生物活性糖蛋白的有吸引力的方法。例如，Barb等人 Biochemistry 48 (2009) 9705-9707使用分离的人ST6Gal-I制备免疫球蛋白G的Fc片段的高度有效的唾液酸化的形式。然而，糖蛋白的治疗应用中的越来越大的兴趣导致日益增加需求糖基转移酶，包括唾液酸转移酶。Bork K.等人 J. Pharm. Sci. 98 (2009) 3499–3508描述了增加或修饰糖蛋白的唾液酸化的不同策略。一种有吸引力的策略是在体外唾液酸化重组产生的蛋白(诸如但不限于免疫球蛋白和生长因子)，特别是治疗性蛋白。为此，几个研究组描述了在转化的生物体中表达唾液酸转移酶和纯化重组产生的唾液酸转移酶。由于原核生物来源的糖基转移酶通常不对复杂糖蛋白(例如抗体)起作用，所以优先研究来自哺乳动物来源的唾液酸转移酶。

经受本公开和本文献的所有方面和本文的方面和实施方案的具体糖蛋白包含但不限于细胞表面糖蛋白和血清中以可溶形式存在的糖蛋白(“血清糖蛋白”)，所述糖蛋白特别是哺乳动物来源的。“细胞表面糖蛋白”应当理解为其中一部分通过表面糖蛋白的多肽链的膜锚定部分的方式位于膜表面上且结合至膜表面的糖蛋白，其中所述膜是生物细胞的部分。术语细胞表面糖蛋白也涵盖细胞表面糖蛋白的分离的形式以及其可溶性片段，其分离自膜锚定部分，例如，通过蛋白水解切割或通过重组产生此类可溶性片段。“血清糖蛋白”被理解为血清中存在的糖蛋白，即全血的非细胞部分(例如，细胞血液组分的沉降之后的上清液)中的血液蛋白。非限制地，特别注意且实施的血清糖蛋白是免疫球蛋白。本文提及的具体免疫球蛋白属于IgG组(其特征在于γ重链)，特别是四个IgG亚组中的任一者。对于本文的公开内容、方面和实施方案，术语“血清糖蛋白”也涵盖单克隆抗体；单克隆抗体人工是本领域众所周知的，且可以例如通过杂交瘤细胞或重组地使用转化的宿主细胞来制备。进一步的血清特异性糖蛋白是载体蛋白诸如血清白蛋白、胎球蛋白、或胎球蛋白是其成员的富含组氨酸的糖蛋白的超家族的另一种糖蛋白成员。进一步，但非限制地，关于本文的所有公开内容、方面和实施方案特别注意且实施的血清糖蛋白是糖基化的蛋白信号传导分子。该组的一种具体分子是***(EPO)。

对于糖蛋白的体外工程改造，糖基转移酶可以用作一种有效的工具(Weijers 2008)。哺乳动物来源的糖基转移酶与作为底物的糖蛋白相容，而细菌糖基转移酶通常修饰更简单的底物，像寡糖。为此，使用哺乳动物糖基转移酶作为选择工具有利地进行糖蛋白的聚糖部分中的合成变化。然而，对于糖基化转移酶在糖工程改造中的大规模应用，需要可用大(即，工业)量的合适的酶。本文描述的发明特别提供了两种具有截短缺失的变体。两种变体Δ89 hST6Gal-I和Δ108 hST6Gal-I表现出唾液酸化hST6Gal-I酶活性。

本文描述的每种截短变体被给予“delta”(=“Δ”)名称，其表明从根据SEQ ID NO:1的野生型hST6Gal-I多肽的N-末端计数的分别的截短缺失的最后氨基酸位置的数目。更详细研究两种不同的N-末端截短变体Δ89 hST6Gal-I (SEQ ID NO:2中显示的氨基酸序列)和Δ108 hST6Gal-I (SEQ ID NO:3中显示的氨基酸序列)。

构建表达载体用于表达Δ89 hST6Gal-I和Δ108 hST6Gal-I，具体地使用用哺乳动物细胞诸如CHO细胞和HEK细胞的表达***。制备具有hST6Gal-I的Δ108截短变体的表达构建体的载体，且制备具有hST6Gal-I 的Δ89截短变体的表达构建体的载体。为了促进重组表达的酶的纯化，由构建体编码的截短变体多肽任选地包括N-末端His-标签。

然而，如本文公开的另一个方面是转化的宿主生物体，其中所述宿主生物体用如本文公开的表达载体转化。特别有利地，人胚肾293 (HEK)细胞可用于实践如本文公开的教导。这些细胞的一个具体优点是，它们是转染和随后的后续培养的非常合适的目标。因此，HEK细胞可以有效地用于通过重组表达和分泌的方式来产生目标蛋白。尽管如此，HeLa、COS和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是众所周知的替代方案，且在本文中被包括为如本文公开的所有方面的具体实施方案。

如本文公开的所有其它方面的一个进一步方面和特定实施方案是选自Δ89 hST6Gal-I和Δ108 hST6Gal-I的重组产生的变体哺乳动物糖基转移酶。具体地，所述变体在转化的HEK细胞中产生。

然而，如本文公开的另一个方面是重组产生变体哺乳动物糖基转移酶的方法，所述方法包括在用表达载体转化的宿主生物体中表达编码如本文公开的变体哺乳动物糖基转移酶的核苷酸序列的步骤，其中形成多肽，从而产生变体哺乳动物糖基转移酶。

本公开的一个方面是能够催化糖蛋白聚糖中的N-乙酰神经氨酰基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分的α2,6糖苷键的形成的变体哺乳动物糖基转移酶，其中所述哺乳动物糖基转移酶是SEQ ID NO:2 (Δ89 hST6Gal-I)的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I。Δ89 hST6Gal-I的酶促活性允许目标分子上的不仅单一一个可能受***点的唾液酸化，如本文用IgG1和IgG4作为目标分子以非限制性方式所例举。

本公开的一个进一步方面是能够催化糖蛋白聚糖中的N-乙酰神经氨酰基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分的α2,6糖苷键的形成的变体哺乳动物糖基转移酶，其中所述哺乳动物糖基转移酶是SEQ ID NO:3 (Δ108 hST6Gal-I)的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I。与Δ89 hST6Gal-I或其功能等效物相反，Δ108 hST6Gal-I与目标分子的相互作用通常允许仅单一受***点的唾液酸化。

由于其缺乏跨膜结构域，有利地体外使用糖基转移酶的N-末端截短的变体。因此，此类变体可用于在溶液中催化和进行糖基转移酶反应。

令人惊讶地，发现hST6Gal-I的截短变体∆108(即，具有缺乏相应的野生型多肽中存在的位置1-108的氨基酸的多肽的变体hST6Gal-1蛋白)是酶促活性的；也就是说，hST6Gal-I的∆108截短变体能够催化Neu5Ac残基转移至作为聚糖中的末端Galβ1,4GlcNAc的部分或聚糖的触角的游离半乳糖基残基的C6羟基，从而在聚糖中形成α2→6连接至Galβ1,4GlcNAc部分的半乳糖基残基的末端唾液酸残基。此外，hST6Gal-I的∆108截短变体适合于糖工程改造应用以合成改变糖蛋白的聚糖部分的组成。此外，hST6Gal-I的∆108截短变体非常适合于在不同的宿主生物体中的重组表达，从而允许以高量和合理成本产生该酶。

此外，单独的变体Δ108 hST6Gal-I甚至更令人惊讶地表现出关于其唾液酸化活性是受限的；因此其能够催化仅单一唾液酸残基添加至选自糖蛋白和糖脂的目标分子的触角聚糖部分中包含的末端受体部分(Galβ1,4GlcNAc)，其中所述末端受体部分能够被α2,6唾液酸化。由于还没有观察到单一目标分子的多于一个受体(目标)部分的唾液酸化，Δ108 hST6Gal-I可以有利地用于特定的单唾液酸化。据本发明人所知，此酶促特性到目前为止是独特的。

如本文公开的所有实施方案的第一个方面因此是SEQ ID NO:3 (Δ108 hST6Gal-I)的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I用于从目标分子特异性形成单唾液酸化目标分子的用途，其中所述目标分子选自糖蛋白和糖脂，其中所述目标分子包含多个(= 两个或更多个)触角目标分子，所述触角目标分子具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分，其中所述单唾液酸化目标分子包含单一唾液酸化末端触角目标部分，且其中所述唾液酸化末端触角目标部分包含一个N-乙酰神经氨酰基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基。一个特定实施方案是用于体外产生具有添加至目标分子的一个触角末端结构的单一唾液酸残基的唾液酸化目标分子的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供组合物，所述组合物包含(i)目标分子，所述目标分子选自糖蛋白和糖脂，所述目标分子包含多个触角，所述触角中的至少两个各自具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分；(ii)SEQ ID NO:3 (∆108 hST6Gal-I)的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I；(iii)胞苷-5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸或其功能等效物，作为用于唾液酸转移酶催化的反应的供体化合物；(b)在允许糖基转移酶酶促活性的条件下温育步骤(a)的组合物，从而每个目标分子形成单一末端触角N-乙酰神经氨酰基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基(=α2,6唾液酸化末端触角残基)；从而体外产生具有添加至目标分子的一个触角末端结构的单一唾液酸残基的唾液酸化目标分子。

在如本文公开的所有方面的一个具体实施方案中，步骤(a)中提供的目标分子无α2,6唾液酸化末端触角残基。获得此目标分子的一种方法是用具有糖苷酶，且具体地唾液酸酶活性的酶去除任何末端唾液酸残基。这，使用用此“脱唾液酸”目标蛋白(然而其保留其用于唾液酸化的两个或更多个受***点)的上述方法，本公开内容，具体地上述用途和方法使得技术人员能够特异性制备选自糖蛋白和糖脂的单唾液酸化目标分子，所述单唾液酸化目标分子可通过如本文公开的方法获得。

Δ108 hST6Gal-I与无限制的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I活性的酶(诸如具体地Δ89 hST6Gal-I)的组合，同时使用两种酶变体是特别有利的，因为其可以用于具有两个或更多个可接近的触角受体部分的目标分子的进一步受控的体外唾液酸化。因此，发现，尽管Δ89 hST6Gal-I能够催化唾液酸化以形成双唾液酸化的目标蛋白(在本文中通过人单克隆IgG1和IgG4以非限制性方式例举)，但相同条件下，Δ108 hST6Gal-I仅能够催化唾液酸化以形成单唾液酸化的目标蛋白，所述目标蛋白在唾液酸化之前无作为末端触角部分的唾液酸残基。因此，设想用于定量受控唾液酸化的进一步方法，其中预先确定Δ89 hST6Gal-I和Δ108 hST6Gal-I各自的酶促活性的量。

值得注意地，具体两种酶Δ89 hST6Gal-I和Δ108 hST6Gal-I的组合允许以定量受控的方式唾液酸化，因为可以产生单唾液酸化的IgG目标分子和双唾液酸化的IgG目标分子的比率受控的体外唾液酸化的IgG目标分子，如本文中以非限制性方式所例举。在本实施方案中，合适的目标还包括脱唾液酸糖蛋白，即无末端触角唾液酸残基的糖蛋白，例如获得为在体外唾液酸化之前已经通过唾液酸酶-展示酶的作用从触角聚糖去除末端唾液酸残基的糖蛋白。其一个例子是神经氨酸酶。

作为如本文公开的一个进一步方面，用于应用具有β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I活性的酶的组合，在第一个步骤中，形成组合物，所述组合物包含允许糖基转移酶酶促活性的水性缓冲剂，所述组合物进一步包含：(a)糖基化目标分子，所述目标分子选自糖蛋白和糖脂，所述目标分子包含多个触角，所述触角中的至少两个各自具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分；(b)SEQ ID NO:3 (Δ108 hST6Gal-I)的末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I；(c)具有高于或等于SEQ ID NO:2 (Δ89 hST6Gal-I)的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I的酶促活性的唾液酸转移酶酶促活性的可溶性N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I变体；(d)胞苷-5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸或其功能等效物，作为用于唾液酸转移酶催化的反应的供体化合物。在一个特定实施方案中，(c)的组分是SEQ ID NO:2 (Δ89 hST6Gal-I)的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I。

据发现，通过改变两种糖基转移酶的比率，可以控制单唾液酸化的IgG目标分子和双唾液酸化的IgG目标分子的比率。因此，在一个特定实施方案中，Δ89 hST6Gal-I和Δ108 hST6Gal-I各自以预定量存在。在另一个特定实施方案中，Δ89 hST6Gal-I和Δ108 hST6Gal-I的各量具有预定的酶促活性。也就是说，就两种酶各自而言，组合物中的酶促活性的绝对量是这样的测量量，其最终决定在何种程度上将形成单唾液酸化的目标分子相比于双唾液酸化的目标分子或甚至更高唾液酸化的目标分子。因此，单-和二-或更高唾液酸化的目标分子的可重复比率变得可能产生。

因此，如本文公开的一个进一步方面是如本文公开的组合物用于在体外和允许糖基转移酶酶促活性的条件下产生具有添加至目标分子的一个或多个触角末端结构的一个或多个唾液酸残基的唾液酸化目标分子的用途。在一个特定实施方案中，定量确定唾液酸化，使得一方面单唾液酸化的目标分子，和另一方面二或更高唾液酸化的目标分子通过将酶促活性同时应用于目标分子的方式来产生。此处重申，如在如本文公开的彼此方面中，脱唾液酸目标分子是对于本公开的实践者具有特别优势的特定实施方案。

本公开的一个进一步方面是用于体外产生具有受控量的添加至目标分子的一个或多个触角末端结构的唾液酸残基的唾液酸化目标分子的方法，所述目标分子选自糖蛋白和糖脂，所述目标分子包含多个触角，所述触角中的至少两个各自具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分，所述方法包括以下步骤：(a)提供如本文公开的组合物，所述组合物包含测量量的Δ108 hST6Gal-I和Δ89 hST6Gal-I或具有高于或等于Δ89 hST6Gal-I的酶促活性的唾液酸转移酶酶促活性的可溶性N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I变体，和/或测量酶促活性的Δ89 hST6Gal-I或其功能等效物和Δ108 hST6Gal-I；(b)在允许糖基转移酶酶促活性的条件下且持续预定时间间隔温育步骤(a)的组合物，从而形成末端触角N-乙酰神经氨酰基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基[=α2,6唾液酸化末端触角残基]；其中Δ89 hST6Gal-I催化双唾液酸化IgG的形成且Δ108 hST6Gal-I催化单唾液酸化IgG的形成，从而体外产生具有受控量的添加至目标分子的一个或多个触角末端结构的唾液酸残基的唾液酸化目标分子。

在如本文公开的所有方面的一个特定实施方案中，所述目标分子选自糖脂和糖蛋白。糖蛋白的一个具体实施方案选自细胞表面糖蛋白、糖基化的蛋白信号传导分子、糖基化的免疫球蛋白和糖基化的病毒来源的蛋白。在一个特定实施方案中，糖基化的免疫球蛋白选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。在一个又更特定实施方案中，糖基化的免疫球蛋白是单克隆抗体。

在如本文公开的所有方面的一个特定实施方案中，所述目标分子是糖蛋白，且特别是糖基化的蛋白信号传导分子、糖基化的免疫球蛋白和糖基化的病毒来源的蛋白。组合的∆89和Δ108 hST6Gal-I变体在使用重组产生的人单克隆IgG4抗体作为复合目标(底物)(作为几个非限制性例子之一)的唾液酸化实验中是有活性的；使用人IgG1单克隆抗体作为唾液酸化目标获得了类似的发现。

显然，IgG-Fc 聚糖G2在可以被唾液酸化的触角支链的末端具有两个半乳糖部分。在合适的反应条件下，N-末端截短的变体Δ89 hST6Gal-I 优选催化双唾液酸化的聚糖(G2 + 2SA)的合成。在相同时间和相同条件下，Δ108 hST6Gal-I催化形成仅单唾液酸化(G2 + 1SA)聚糖。且因此，通过以测量量组合两种酶的方式，变得可能以预定比率特异性合成单-和双-唾液酸化聚糖。

如由本公开提供的受控的唾液酸化是体外合成具有期望唾液酸化程度的单、双和更高的唾液酸化的糖蛋白的新型方式。因此，尽管通过用IgG分子显示期望的技术效果来例举，根据本文的公开内容的用途也允许以类似方式处理其它糖蛋白，条件是，关于糖基化转移酶活性，所述糖蛋白包含两个或更多个末端触角的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分。相同的推理以类似方式适用于糖脂。

特征在于G2+0SA以及EPO的重组人源化的IgG1和IgG4单克隆抗体(mAb)用作唾液酸化实验中的目标(30 μg酶/300 μg目标蛋白)。在相同反应条件下使用ST6Gal-I (Δ89和Δ108)的两种酶变体，且G2+0SA、G2+1SA和G2+2SA状态通过质谱进行分析。

由于高表达率和有效纯化程序，重组人ST6-Gal-I的两种变体(Δ89和Δ108)可以大量和高纯度获得。两种变体对于高分子量底物如单克隆抗体是有活性的。使用具有双触角聚糖的单克隆抗体作为底物，它们在唾液酸化实验中显示了不同的性能。使用变体Δ89，优选获得双唾液酸化的聚糖，而在相同条件下使用Δ89，获得单唾液酸化的聚糖。

四触角聚糖也被接受作为底物(数据未显示)。结果表明，两种变体可以成功地用于治疗性抗体的体外糖工程改造。

重组人ST6-Gal-I是第一种可大量获得的酶。连同已经可得的供体底物(用作共底物的活化糖)，提供了非常有利的试剂集合，用于蛋白的体外糖工程改造。

通过实践如本文提供的教导，人ST6-Gal-I的重组Δ89变体是可大量获得的酶。连同已经可得的供体底物(用作共底物的活化糖)，提供了非常有利的试剂集合，用于蛋白的定量受控的体外糖工程改造。

以下项进一步提供本公开的特定方面和特定实施方案以实践本文提供的教导。

1. 组合物，其包含允许糖基转移酶活性的水性缓冲液，所述组合物进一步包含：

(a) 糖基化的目标分子，所述目标分子选自糖蛋白和糖脂，所述目标分子包含多个触角，所述触角中的至少两个各自具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分；

(b) SEQ ID NO:2的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I (Δ89 hST6Gal-I)或具有高于或等于Δ89 hST6Gal-I的唾液酸转移酶酶促活性的可溶性N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I变体；

(c) SEQ ID NO:3的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I (Δ108 hST6Gal-I)；

(d) 作为唾液酸转移酶催化的反应的供体化合物的胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰神经氨酸或其功能等效物。

2. 根据第1项的组合物，所述缓冲液包含乙酸钠、Tris(=Tris(羟甲基)氨基甲烷)、磷酸钾和NaCl。

3. 根据第1和2项中任一项的组合物，其中所述缓冲液的pH为6.5。

4. 根据第1至3项中任一项的组合物，其中Δ89 hST6Gal-I和Δ108 hST6Gal-I各自以预定量存在。

5. 根据第4项的组合物，其中Δ89 hST6Gal-I和Δ108 hST6Gal-I的各量具有预定的酶促活性。

6. 根据第1至5项中任一项的组合物的用于，其用于在体外和允许糖基转移酶酶促活性的条件下产生具有添加至目标分子的一个或多个触角末端结构的一个或多个唾液酸残基的唾液酸化目标分子。

7. 根据第6项的用途，其中在唾液酸化目标分子中，具有添加的唾液酸残基的各末端触角结构是N-乙酰神经氨酰基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基。

8. 根据第6和7项中任一项的用途，其为根据第4项或第5项的组合物用于体外产生具有受控量的添加至目标分子的一个或多个触角末端结构的唾液酸残基的唾液酸化目标分子的用途。

9. 根据第6至8项中任一项的用途，其在预定时间间隔内，具体地选自0.5至8小时的时间间隔内，更具体地选自0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时和8小时的时间间隔内。

10. 根据第6至9项中任一项的用途，其中Δ89 hST6Gal-I主要催化二-或更高唾液酸化的目标分子的形成，且Δ108 hST6Gal-I主要催化单唾液酸化的目标分子的形成。

11. 用于体外产生具有受控量的添加至目标分子的一个或多个触角末端结构的唾液酸残基的唾液酸化目标分子的方法，所述目标分子选自糖蛋白和糖脂，所述目标分子包含多个触角，所述触角中的至少两个各自具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分，所述方法包括以下步骤：

(a) 提供根据第4项或第5项的组合物；

(b) 在允许糖基转移酶酶促活性的条件下且持续预定时间间隔温育步骤(a)的组合物，从而形成末端触角N-乙酰神经氨酰基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基[=α2,6唾液酸化末端触角残基]， 其中∆89 hST6Gal-I催化双唾液酸化目标分子的形成，且∆108 hST6Gal-I催化单唾液酸化目标分子的形成，

从而体外产生具有受控量的添加至目标分子的一个或多个触角末端结构的唾液酸残基的唾液酸化目标分子。

12. 根据第11项的组合物，其中所述目标分子与Δ89 hST6Gal-I和Δ108 hST6Gal-I在相同容器中和相同条件下同时温育。

13. 根据第12项的方法，其中Δ89 hST6Gal-I主要催化二-或更高唾液酸化的目标分子的形成，且Δ108 hST6Gal-I主要催化单唾液酸化的目标分子的形成。

14. 根据第13项的方法，其中(i) Δ89 hST6Gal-I酶促活性和(ii) Δ108 hST6Gal-I酶促活性的两个值的比率确定步骤(b)中添加至所述目标分子的一个或多个触角末端结构的唾液酸残基的量。

15. 根据第13至14项中任一项的方法，其中Δ108 hST6Gal-I酶促活性的量相对于Δ89 hST6Gal-I酶促活性的量更高导致形成单唾液酸化的目标分子的可能性与形成二-或更高唾液酸化的目标分子的可能性相比增加。

16. 根据第11至15项中任一项的方法，其中所述目标分子不含作为触角末端结构的唾液酸残基。

17. 根据第11至16项的方法，其中在步骤(a)之前，所述目标分子用具有唾液酸酶酶促活性的酶预处理。

18. 根据第11至17项中任一项的方法，其中所述目标分子选自糖脂和糖蛋白，且具体地糖基化的细胞表面蛋白、糖基化的蛋白信号传导分子、糖基化的免疫球蛋白和糖基化的病毒来源的蛋白。

19. 根据第18项的方法，其中所述糖基化的免疫球蛋白是IgG类的单克隆抗体，具体地选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

20. 糖基化的目标分子的制备物，所述目标分子为IgG亚类的免疫球蛋白分子，其中所述制备物中的单和双唾液酸化的目标分子的量是受控量，所述制备物通过根据第11至19项中任一项的方法获得。

21. 根据第20项的糖基化的免疫球蛋白分子的制备物用于制备药物组合物的用途。

22. SEQ ID NO:3的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I (Δ108 hST6Gal-I)用于从目标分子特异性形成主要单唾液酸化目标分子的用途，

其中所述目标分子选自糖蛋白或糖脂，

其中所述目标分子包含多个触角目标部分，所述触角目标部分具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分，

其中所述单-唾液酸化目标分子包含单一唾液酸化末端触角目标部分，且

其中所述唾液酸化末端触角目标部分包含一个N-乙酰神经氨酰基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基。

23. 用于体外产生主要具有添加至目标分子的一个触角末端结构的单一唾液酸残基的唾液酸化目标分子的方法，所述方法包括以下步骤

(a) 提供组合物，其包含

i. 目标分子，所述目标分子选自糖蛋白和糖脂，所述目标分子包含多个触角，所述触角中的至少两个各自具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分；

ii. SEQ ID NO:3的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I (Δ108 hST6Gal-I)；

iii. 作为唾液酸转移酶催化的反应的供体化合物的胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰神经氨酸或其功能等效物；

(b) 在允许糖基转移酶酶促活性的条件下温育步骤(a)的组合物，从而每个目标分子形成单一末端触角N-乙酰神经氨酰基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基[=α2,6唾液酸化末端触角残基]；

从而体外产生具有添加至所述目标分子的一个触角末端结构的单一唾液酸残基的唾液酸化目标分子。

24. 根据第23项的方法，其中步骤(a)中提供的目标分子无α2,6唾液酸化末端触角残基。

25. 选自糖蛋白和糖脂的单-唾液酸化目标分子，所述单-唾液酸化目标分子可通过根据第24项的方法获得。

26. 根据第25项的单-唾液酸化目标分子用于制备药物组合物的用途。

随后的实施例说明本公开的具体实施方案及其各种用途。它们仅出于解释目的进行记载，而不应当被视为限制本公开。

实施例1

唾液酸转移酶酶促活性的测试

脱唾液酸胎球蛋白(去唾液酸胎球蛋白，Roche Applied Science)用作受体且CMP-9-荧光-NANA (CMP-9-荧光素基-NeuAc)用作供体底物(Brossmer, R. & Gross H. J. (1994) Meth. Enzymol. 247, 177-193)。酶促活性通过测量唾液酸从供体化合物转移至脱唾液酸胎球蛋白来确定。反应混合物(35 mM MES, pH 6.0, 0,035% Triton X-100, 0.07% BSA)在51 µL的总体积中含有2.5 µg酶样品，5 µL脱唾液酸胎球蛋白(20 mg/ml)和2 µL CMP-9-荧光-NANA (1.0 mg/ml)。将反应混合物在37℃温育30 分钟。通过添加10 µL抑制剂CTP (10 mM)来停止反应。将反应混合物上样至用0.1 M Tris/HCl, pH 8.5平衡的PD10脱盐柱上。使用平衡缓冲液从柱中洗脱胎球蛋白。级分大小为1 mL。使用荧光分光光度计确定形成的胎球蛋白的浓度。激发波长为490 nm，在520 nm测量发射。酶促活性表示为RFU(相对荧光单位)。10 000 RFU/µg等于0.0839 nmol/µg x min的比活性。

实施例2

SDS凝胶电泳

使用NuPAGE凝胶(4-12%, Invitrogen)实施分析SDS凝胶电泳。样品(36 μl)用12 µl NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen)稀释，且在85℃温育2 分钟。将通常含有5μg蛋白的等分试样上样于凝胶上。凝胶使用SimplyBlue SafeStain (Invitrogen)染色。

实施例3

通过Edman降解的N-末端测序

通过使用从Life Technologies获得的试剂和设备的Edman降解分析表达的人ST6Gal-I的变体的N-末端序列。如ProSorb样品制备药筒(目录号401950)和ProBlott Mini PK/10膜(目录号01194)的指导手册中所述进行样品的制备。对于测序，使用Procise蛋白测序平台。

实施例4

质谱法

在质谱法中分析HEK细胞中表达的人ST6Gal-I的变体的分子质量。因此，使用Micromass Q-Tof Ultima和Synapt G2 HDMS设备(Waters UK)和MassLynx V 4.1软件制备和分析人ST6Gal-I的糖基化和去糖基化形式。

实施例5

糖基化的人ST6Gal-I酶的质谱法

对于质谱法测量，在电喷雾介质(20％乙腈+ 1％甲酸)中缓冲样品。用illustra™ MicroSpin™ G-25柱(GE-Healthcare)进行缓冲液交换。将浓度为1 mg/ml的20 µg唾液酸转移酶变体应用于预平衡的柱，且通过离心洗脱。所得洗脱物通过电喷雾离子化质谱法进行分析。

实施例6

去糖基化的人ST6Gal-I酶的质谱法

对于去糖基化，将唾液酸转移酶的样品变性和还原。向100 µg唾液酸转移酶中添加45 µL变性缓冲液(6 M盐酸胍)和13 µL TCEP (0.1 mM，稀释于变性缓冲液中)。进一步添加适当体积的超纯水，使得盐酸胍的总浓度为约4 M。将样品在37℃温育1小时之后，使用用超纯水预平衡的Bio-SpinR 6 Tris柱(Bio Rad)交换缓冲液。将整个样品应用于柱上，且通过离心洗脱。向所得洗脱物中添加5.5 µl的PNGase F的0.1 U/µl溶液，且在37℃温育过夜。之后将样品调节至30 % ACN和1 % FA且通过电喷雾离子化质谱法进行分析。

实施例7

克隆pM1MT表达构建体用于在哺乳动物宿主细胞中瞬时基因表达(TGE)

使用***信号序列(Epo)和两个(AP)或四个(APPR)氨基酸的肽间隔基克隆人ST6Gal-I的两种片段用于瞬时真核表达。对于N-末端截短的片段Epo-AP-Δ89 hST6Gal-I (SEQ ID NO:4)和Epo-APPR-Δ108 hST6Gal-I (SEQ ID NO:6)，合成密码子优化的cDNA。替代天然前导序列和N-末端蛋白序列，两种hST6Gal-I编码区具有***信号序列加上AP和APPR接头序列，以确保宿主细胞系的分泌机器对多肽的正确处理。此外，所述表达盒的特征在于SalI和BamHI位点，其用于克隆至预先消化的pM1MT载体片段(Roche Applied Science)的多克隆位点中。hST6Gal-I编码序列的表达因此在人巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子/启动子区域的控制下，随后为用于调节表达的内含子A，和BGH多腺苷酸化信号。

如实施例8中所述执行在HEK细胞中表达上述构建体，和使变体hST6Gal-I蛋白分泌至细胞上清液。

实施例8

转化HEK细胞和瞬时表达和分泌

通过转染质粒DNA的瞬时基因表达(TGE)是在哺乳动物细胞培养物中产生蛋白的快速策略。对于重组人蛋白的高水平表达，使用基于悬浮适应的人胚胎肾(HEK) 293细胞系的TGE平台。在摇瓶中在37℃在无血清培养基条件下培养细胞。根据制造商的指南用通过293-Free™ (Merck)转染试剂复合的pM1MT表达质粒(0.5至1 mg/L细胞培养物)以约2x 10⁶ vc/ml转染细胞。转染后三小时，添加丙戊酸(HDAC抑制剂)(最终浓度4 mM)，以便加强表达(Backliwal等人(2008), Nucleic Acids Research 36, e96)。每天，用6% (v/v)的基于大豆蛋白胨水解产物的给料补充培养物。在转染后第7天通过离心收集培养上清液。

实施例9

从HEK细胞纯化重组人ST6Gal-I变体

使用简化的纯化方案从HEK细胞发酵的上清液纯化hST6Gal-I的不同变体 (Epo-AP-Δ89 hST6Gal-I和Epo-APPR-Δ108 hST6Gal-I)。在第一步骤中，过滤(0.2 µm) 0.1升培养上清液，将溶液针对缓冲液A (20 mM磷酸钾, pH 6.5)进行透析。将透析物上样至用缓冲液A平衡的S-Sepharose ff柱(1.6 cm x 2 cm)。用100 ml缓冲液A洗涤之后，用10 ml缓冲液A和10ml缓冲液A + 200 mM NaCl的线性梯度，随后使用48 ml缓冲液A + 200 mM NaCl的洗涤步骤，洗脱酶。通过分析SDS凝胶电泳分析级分(4 ml)。合并含有该酶的级分，且针对缓冲液B(50 mM MES, pH 6.0)进行透析。将透析合并物上样至用缓冲液B平衡的肝素琼脂糖ff柱(0.5 cm x 5 cm)，且使用缓冲液B + 200 m M NaCl进行洗脱。合并含有该酶的级分(1 ml)，且针对缓冲液B进行透析。在280 nm确定蛋白浓度(对于Δ89ST6Gal-I，E280nm [10 mg/ml] = 1.931，对于Δ108ST6Gal-I，E280nm [10 mg/ml] = 1.871)。该酶的质谱法分析显示，表达不具有N-末端氨基酸AP的Epo-AP-△89 hST6Gal-I的构建体。该令人惊讶的发现表明信号肽酶对表达的蛋白的不寻常的切割。对于构建体Epo-APPR-△108 hST6Gal-I，将N-末端序列验证为APPR，表明预期的信号肽对EPO信号序列的切割。对于来自HEK细胞的重组人△108 hST6Gal-I，确定了>600 RFU/mg的比活性。变体△89 hST6Gal-I显示>1100 RFU/mg的增加的比活性。

图1显示了来自HEK细胞的纯化的重组hST6Gal-I变体的SDS-PAGE的结果。

实施例10

唾液酸化人源化单克隆抗体(MAB)

高度半乳糖化的人源化单克隆抗体MAB IgG4 (WO 2005/023872)用于唾液酸化实验中。反应混合物含有MAB IgG4 (300 µg/55 µl 35 mM乙酸钠/Tris缓冲液pH 7.0)、供体底物CMP-NANA (150 µg/50 µl水)和唾液酸转移酶(30 µg /20 mM磷酸钾, 0.1 M NaCl, pH 6.5)。将样品在37℃温育定义时间。为了停止反应，将100 µl变性缓冲液(6 M盐酸胍)和30 µl TCEP (0.1 mM，稀释于变性缓冲液中)添加至样品，且将样品在37℃温育1小时。使用预平衡的illustra™ Nap5-Columns (GE-Healthcare)将该样品缓冲于电喷雾介质(20 % ACN, 1 % FA)中。通过电喷雾离子化质谱法分析样品，且确定G2+0SA、G2+1SA和G2+2SA N-聚糖的含量。使用Micromass Q-Tof Ultima和Synapt G2 HDMS设备(Waters UK)，且使用的软件是MassLynx V 4.1。为了确定唾液酸化的动力学，将反应物温育长达8小时。

通过质谱法确定G2+0SA、G2+1SA和G2+2SA的含量。图2显示在与89 hST6Gal-I温育期过程中的不同时间点后Δ获得的差异唾液酸化的目标蛋白的相对量。对于变体△89 hST6Gal-I，已经在温育2小时之后，获得高含量(88％)的双唾液酸化的形式G2+2SA，参见图2。数据还显示，G2+2SA的含量在延长温育8小时之后没有显著增加(89％)。

相反，变体△108 hST6-Gal-I合成单唾液酸化形式G2+1SA。温育2小时之后，获得46%的含量的单唾液酸化形式G2+1SA。温育8小时之后，含量增加至70% G2+1SA(图3)。

Claims (18)

1.一种组合物，其包含允许糖基转移酶活性的水性缓冲液，所述组合物进一步包含：

(a) 糖基化的目标分子，所述目标分子选自糖蛋白和糖脂，所述目标分子包含多个触角，所述触角中的至少两个各自具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分；

(b) SEQ ID NO:2的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I (Δ89 hST6Gal-I)；

(c) SEQ ID NO:3的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I (Δ108 hST6Gal-I)；

(d) 作为唾液酸转移酶催化的反应的供体化合物的胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰神经氨酸。

2.根据权利要求1的组合物，其中所述目标分子是选自糖基化的细胞表面蛋白、糖基化的蛋白信号传导分子、糖基化的免疫球蛋白和糖基化的病毒来源的蛋白的糖蛋白。

3.根据权利要求1和2中任一项的组合物，其中Δ89 hST6Gal-I和Δ108 hST6Gal-I各自以预定量存在。

4.根据权利要求3的组合物，其中Δ89 hST6Gal-I和Δ108 hST6Gal-I的各自量具有预定的酶促活性。

5.根据权利要求1至4中任一项的组合物的用途，其用于在体外和允许糖基转移酶酶促活性的条件下产生具有添加至目标分子的一个或多个触角末端结构的一个或多个唾液酸残基的唾液酸化目标分子。

6.根据权利要求5的用途，其为根据权利要求3或权利要求4的组合物用于体外产生具有受控量的添加至目标分子的一个或多个触角末端结构的唾液酸残基的唾液酸化目标分子的用途。

7.根据权利要求5和6中任一项的用途，其中Δ89 hST6Gal-I催化二-唾液酸化的目标分子或更高唾液酸化的目标分子的形成，且Δ108 hST6Gal-I催化单唾液酸化的目标分子的形成。

8.用于体外产生具有受控量的添加至目标分子的一个或多个触角末端结构的唾液酸残基的唾液酸化目标分子的方法，所述目标分子选自糖蛋白和糖脂，所述目标分子包含多个触角，所述触角中的至少两个各自具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分，所述方法包括以下步骤：

(a) 提供根据权利要求3或权利要求4的组合物；

(b) 在允许糖基转移酶酶促活性的条件下且持续预定时间间隔温育步骤(a)的组合物，从而形成末端触角N-乙酰神经氨酰基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基，其中∆89 hST6Gal-I催化双唾液酸化目标分子的形成，且∆108 hST6Gal-I催化单唾液酸化目标分子的形成，

从而体外产生具有受控量的添加至目标分子的一个或多个触角末端结构的唾液酸残基的唾液酸化目标分子。

9.根据权利要求8的组合物，其中所述目标分子与Δ89 hST6Gal-I和Δ108 hST6Gal-I在相同容器中和相同条件下同时温育。

10.根据权利要求9的方法，其中Δ89 hST6Gal-I催化二-唾液酸化的目标分子或更高唾液酸化的目标分子的形成，且Δ108 hST6Gal-I催化单唾液酸化的目标分子的形成。

11.根据权利要求10的方法，其中Δ108 hST6Gal-I酶促活性的量相对于Δ89 hST6Gal-I酶促活性的量更高导致形成单唾液酸化的目标分子的可能性与形成二-或更高唾液酸化的目标分子的可能性相比增加。

12.根据权利要求8至11中任一项的方法，其中所述目标分子不含作为触角末端结构的唾液酸残基。

13.根据权利要求12的方法，其中所述目标分子是IgG类的单克隆抗体，具体地选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

14.糖基化的目标分子的制备物，所述目标分子为IgG亚类的免疫球蛋白分子，其中所述制备物中的单和双唾液酸化的目标分子的量是受控量，所述制备物通过根据权利要求8至13中任意的方法获得。

15.SEQ ID NO:3的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I (β108 hST6Gal-I)的用途，其用于从目标分子特异性形成单唾液酸化目标分子，

其中所述目标分子选自糖蛋白或糖脂，

其中所述目标分子包含多个触角目标部分，所述触角目标部分具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分，

其中所述单-唾液酸化目标分子包含单一唾液酸化末端触角目标部分，且

其中所述唾液酸化末端触角目标部分包含一个N-乙酰神经氨酰基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基。

16.用于体外产生具有添加至目标分子的一个触角末端结构的单一唾液酸残基的唾液酸化目标分子的方法，所述方法包括以下步骤

(a) 提供组合物，其包含

i. 目标分子，所述目标分子选自糖蛋白和糖脂，所述目标分子包含多个触角，所述触角中的至少两个各自具有作为末端结构的在半乳糖基残基中的C6位置具有羟基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分；

ii. SEQ ID NO:3的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸转移酶I (β108 hST6Gal-I)；

iii. 作为唾液酸转移酶催化的反应的供体化合物的胞苷-5’-单磷酸-N-乙酰神经氨酸；

(b) 在允许糖基转移酶酶促活性的条件下温育步骤(a)的组合物，从而每个目标分子形成单一末端触角N-乙酰神经氨酰基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺残基；

从而体外产生具有添加至所述目标分子的一个触角末端结构的单一唾液酸残基的唾液酸化目标分子。

17.根据权利要求16的方法，其中步骤(a)中提供的目标分子无α2,6唾液酸化末端触角残基。

18.选自糖蛋白和糖脂的单-唾液酸化目标分子，所述单-唾液酸化目标分子可通过根据权利要求17的方法获得。