CN105349477A - 一种肠膜明串珠菌及其制备方法和应用 - Google Patents

一种肠膜明串珠菌及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肠膜明串珠菌(Leuconostoc？mesenteroides)，制备方法及其在多糖生产中的应用。该肠膜明串珠菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC？No.10064，培养物名称是BD3749。其可以用于大量制备不可溶性多糖，从而能够更好地控制乳清析出，能被用于乳制品发酵中，在牛奶制品贮藏中亦能避免因乳清析出造成产品的质构发生严重破坏，从而影响其品质及货架期。所述菌株培养方法简单易操作，其制备而得的不可溶性多糖量大，适合产业化应用，具有广阔的市场。

Description

一种肠膜明串珠菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种肠膜明串珠菌及其制备方法和应用。
背景技术
肠膜明串珠菌是乳酸菌中的明串珠菌属的重要菌种。美国FDA和AAFCO于1989年将其列为可以直接食(饲)用的42种安全微生物之一。我国***也于2012年将肠膜明串珠菌肠膜亚种列入了《可用于食品的菌种名单》。
研究证实，肠膜明串珠菌不仅具有普通乳酸菌的高产酸能力、抗氧化能力和颉颃致病菌的特性，还具有在发酵中可产生种类丰富、数量较多的胞外多糖的能力。肠膜明串珠菌也被发现广泛分布在发酵食品中，特别是发酵乳品、腌制泡菜和酿制果酒中。
肠膜明串珠菌发酵蔗糖合成大量的葡聚糖，是生产***的主要成分—右旋糖酐的原料。在医疗上十分重要，具有维持血液渗透压和增加血溶量的作用，是目前公认的优良血浆代用品之一，临床上常用于治疗由于失血、创伤、烧伤和中毒等引起的失血性休克。随着肠膜明串珠菌胞外多糖的研究越来越全面和深入，由肠膜明串珠菌合成的功能性低聚糖产品有望实现产业化生产。
目前，国内现有的肠膜明串珠菌主要产生可溶性多糖，不产生不可溶性多糖或者不可溶性多糖产量很低，故此缺乏可以大量产生不可溶性多糖的新菌株。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有的肠膜明串珠菌主要产生可溶性多糖，不产生不可溶性多糖或者不可溶性多糖产量很低的现状，本发明提供一株肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)及其培养方法和应用。所述的肠膜明串珠菌可以制备多糖，尤其是大量制备不溶性多糖，可以更好地应用于乳制品发酵以及贮藏中。
本发明的技术方案之一是：一种肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNo.10064。
从黑龙江省的农家腌制泡菜中分离而得，获得所述的肠膜明串珠菌CGMCCNo.10064。对该菌株进行鉴定，结果为肠膜明串珠菌Leuconostocmesenteroides，命名为BD3749。该菌株已于2014年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并收到保藏中心登记入册编号CGMCCNo.10064。
本发明的技术方案之二是：一种制备所述的肠膜明串珠菌CGMCCNo.10064的方法，其包括以下的步骤：在培养基中培养所述的肠膜明串珠菌CGMCCNo.10064即可。
其中，所述的培养基为本领域常规的培养基，能够生长所述的肠膜明串珠菌CGMCCNo.10064即可。较佳地为TYC培养基，所述的TYC培养基为本领域常规的TYC培养基，较佳地包括如下组分：胰胨(或酪朊水解物)1.5g；酵母膏0.5g；L-胱氨酸0.02g；乙酸钠2.0g；Na2SO40.01g；NaCl0.1g；蔗糖5.0g；蒸馏水100ml；如果为TYC固体培养基，则除了上述组分，较佳地还包括1.5-2.0克(g)的琼脂，更佳地包括1.8g琼脂。
所述培养的温度为本领域常规的温度，能够生长所述的肠膜明串珠菌CGMCCNo.10064，较佳地为25～37℃，更佳地为30～37℃，最佳为30℃。所述培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为18～72小时(h)，更佳地为18小时(h)或72小时(h)，最佳地为18小时(h)。所述培养的pH为本领域常规的pH，能够生长所述的肠膜明串珠菌CGMCCNo.10064，较佳地为4～6，更佳地为4～5。
本发明培养条件为本领域常规培养条件，较佳地为好氧静置培养，震荡培养或者厌氧静置培养，所述震荡培养的震荡速度为常规的，较佳地为180r/min。
较佳地，所述的培养前还包括使用种子培养基进行种子培养的步骤。所述的种子培养为本领域常规的种子培养。所述的种子培养基为本领域常规的种子培养基，较佳地为TYC培养基；所述种子培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为16～32h，更佳地为16～24h，最佳为24h；所述种子培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为28～32℃，更佳为30℃。所述种子培养的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为1～2％，更佳为1％，所述百分比为体积百分比。
本发明提供的技术方案之三是：所述的肠膜明串珠菌CGMCCNo.10064在胞外多糖生产中的应用。所述胞外多糖包括可溶性的和不溶性的。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)可以制备多糖，尤其能够大量制备不可溶性多糖，从而可以更好地控制乳清析出。因此所述菌株以及该菌株制备而得的不可溶性多糖均能被用于乳制品发酵中，尤其是在固体型蛋白产品(如奶酪)制备中起到凝固剂的作用，在牛奶制品贮藏中也能避免因乳清析出造成产品的质构发生严重破坏，从而影响其品质及货架期。所述菌株培养方法简单易操作，其制备而得的不可溶性多糖量大，适合产业化应用，具有广阔的市场。
生物材料保藏信息
本发明的肠膜明串珠菌BD3749，已于2014年11月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCCNo.10064，培养物名称是BD3749，分类命名是肠膜明串珠菌Leuconostocmesenteroides。
附图说明
图1为本发明肠膜明串珠菌BD3749在TYC上培养的菌落形态。
图2为本发明肠膜明串珠菌BD3749与标准菌株肠膜明串珠菌ATCC10830a菌落形态的对比。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明所用到的培养基成分如下：
TYC培养基(液体TYC培养基)：胰蛋白胨1.5g；酵母膏0.5g；L-胱氨酸0.02g；乙酸钠2.0g；Na2SO40.01g；NaCl0.1g；蔗糖5.0g；蒸馏水100ml；115℃，灭菌15min。
TYC固体培养基：液体TYC培养基另加入1.8g琼脂。
实施例1菌株BD3749的分离
取黑龙江省的农家腌制泡菜，以无菌方式取1g，浸入无菌生理盐水中，取浸出液进行梯度稀释，通过涂布的方式将稀释液均匀涂布于固体TYC培养基上，30℃培养24-48h。选取粘鼻涕状、具有良好拉丝性的单菌落多个，分别转接到新的固体TYC培养基上，得到多个纯化的菌落，将其中一个单菌落命名为BD3749。
实施例2菌株BD3749的特征
1、菌落特征
取菌株BD3749的单菌落，转接到TYC固体培养基(琼脂)上，于37℃厌氧箱恒温培养箱中培养24h后，观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结果如图1所示。结果显示，菌株BD3749形成粘鼻涕状、具有良好拉丝性的、边缘整齐、凸起、光滑、无色不透明的单菌落。
2、形态学观察及生理生化特征
挑取在TYC固体培养基(琼脂)上培养24h的新鲜培养物，进行生理生化测试。结果显示，BD3749为革兰氏阳性球菌，兼性厌氧。接触酶实验阴性，氧化酶阴性。
3、API50CH鉴定特征
利用API50CH鉴定***(生产厂商：bioMe′rieux)测定菌株BD3749发酵碳水化合物的产酸情况。API50CH的试剂条中，不同的序列号对应不同的碳源，同时，其中含有指示剂，这样，如果其对应的碳源被利用，则培养液pH下降，指示剂便会改变颜色，利于观察记录。
API50CH鉴定***操作步骤如下：
1)API50CH基础培养基成分：胰蛋白胨1g，酵母膏0.5g，硫酸铵2g，酚红0.18g，无机盐基础(Cohen-Bazire)10ml，磷酸盐缓冲液(pH7.8)1000ml。
2)在平板上培养菌株BD3749，挑取有多个大小相近，单菌落分离的平板。挑取大小相近的单菌落若干个，加入1)中的培养基中，制成OD600＝0.4～0.6的菌悬液。
3)将接过种的API50CH培养基加入到含有实验条的小管中，上面覆盖一层已灭菌的石蜡油。
4)在30℃的恒温培养箱中好氧培养，分别在24h和48h记录实验现象。
菌株BD3749利用碳水化合物发酵产酸的结果如表1所示。
表1.菌株BD3749的API50CH鉴定结果
“+”表示利用糖产酸，“-”表示不产酸。
4、16srDNA序列同源性分析
挑取TYC平板培养的BD3749菌株2-3环接入30ml液体TYC培养基中，置于30℃下，180r/min振荡培养18h。12000rpm离心5min收集菌体。利用试剂盒(天根生物)提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16srDNA通用引物，27f：5′-agagtttgatcctggctcag-3′(SEQIDNO:1)，1492r：5′-taccttgttacgactt-3′(SEQIDNO:2)进行PCR反应。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸8min。扩增产物用1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测，回收目标条带送上海生物生工测序。所得核苷酸序列(如SEQIDNO:3所示)通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线Blast比对。结果显示，与菌株BD3749的16srDNA序列(SEQIDNO:3)相似性最高的为Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroidesJ18，相似性为99％。
5、pheS基因序列同源性分析
以4中提取的BD3749总DNA作为基因扩增模板，以细菌pheS引物，pheS-f：5′-atgggcttaattgaagatct-3′(SEQIDNO:4)，pheS-r：5′-tcagttcccctttcgattgaat-3′(SEQIDNO:5)进行PCR反应。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸8min。扩增产物用1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测，回收目标条带送上海生物生工测序。所得核苷酸序列(如SEQIDNO:6所示)通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线Blast比对。结果显示，菌株BD3749的pheS基因序列(SEQIDNO:6)相似性最高的为Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroidesJ18，相似性为99％。
综合实施例2中结果，认为菌株BD3749属于Leuconostocmesenteroides的新菌株。
本发明的肠膜明串珠菌BD3749，已于2014年11月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCCNo.10064，分类命名是肠膜明串珠菌Leuconostocmesenteroides。
实施例3肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD3749的应用
(1)肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD3749发酵和发酵液的制备
制备肠膜明串珠菌BD3749的冻干粉：挑取2个菌落，接种于300ml的10％(w/w)的脱脂乳溶液里30℃培养4h，-80℃预冻过夜，-20℃冷冻干燥。
将肠膜明串珠菌BD3749的冻干粉100mg以0.1ml无菌蒸馏水溶解，用接种环挑取一环划线于TYC固体培养基上，30℃好氧静置培养24h后取出。
挑取TYC固体培养基中的单个菌落，转接到20ml液体TYC培养基中，30℃好氧静置培养24h，得到种子液。将种子液按接种量1％(v/v)的比例转接到新的液体TYC培养液中，30℃好氧静置培养72h，得发酵液。
(2)发酵液中胞外多糖粗品的制备
将步骤(1)所得的发酵液在100℃加热10min，冷却至室温，此溶液标记为溶液1。9000rpm离心20min，取上清液加入3倍体积的95％乙醇溶液，此溶液标记为溶液2。溶液2放4℃静置过夜，9000rpm离心20min收集沉淀物，冷冻干燥，经硫酸苯酚法检测，所得沉淀物中90％以上为多糖，即得可溶性粗多糖。
溶液1离心得到的沉淀，重悬于含1M的NaOH水溶液中。然后，9000rpm离心20min，取上清液。在所取上清液中，加入3倍体积的95％乙醇溶液。4℃静置过夜，9000rpm离心20min收集沉淀物，冷冻干燥，经硫酸苯酚法检测，所得沉淀物中90％以上为多糖，即得不可溶性粗多糖。
菌株BD3749发酵所得的不可溶性多糖与可溶性多糖的产量比(w/w)：4：5。
实施例4肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD3749的应用
将肠膜明串珠菌ATCC10830a和肠膜明串珠菌BD3749的冻干粉100mg以0.1ml无菌蒸馏水分别溶解，用接种环挑取一环分别划线于TYC固体培养基上，30℃好氧静置培养24h后取出。挑取单菌落，接种到灭菌(115℃，15min)的含5％(w/v)蔗糖的100ml纯牛奶中，30℃好氧静置发酵2天后，置于4℃冰箱内，分别取放置7天，14天后的样品，将液体倾倒出来测量体积，观察液体体积变化。结果如表2所示。
表2.菌株BD3749和ATCC10830a纯牛奶发酵液体积时间对照表
由上表结果可知，菌株BD3749加入牛奶中发酵后放置，所得液体体积随着时间推移而减少，证明菌株BD3749很好地控制了乳清的析出现象，相比之下菌株ATCC10830则无法控制乳清的析出。
在实际应用中，因牛奶里面的主要蛋白在乳清里面，一般通过加入凝固剂控制乳清析出而做成固体型蛋白产品(如奶酪)。牛奶制品在贮藏及货架期内也都会存在乳清析出的问题，乳清析出较多将导致产品的质构发生严重破坏从而影响其品质及货架期。本发明菌株BD3749自身就可以控制乳清的析出，可以应用于乳制品的制备，具有商业应用价值。
对比实施例1肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)ATCC10830a的胞外多糖的制备
将肠膜明串珠菌ATCC10830a的冻干粉(制备方法同肠膜明串珠菌BD3749的冻干粉的制备方法)100mg以0.1ml无菌蒸馏水溶解，用接种环挑取一环划线于TYC固体培养基上，30℃好氧静置培养24h后取出。
参照实施例3的方法，制备可溶性与不可溶性多糖。结果显示，肠膜明串珠菌ATCC10830a经实施例3中制备不可溶性粗多糖的步骤后，无法得到沉淀物，即肠膜明串珠菌ATCC10830a不产不可溶性多糖。
对比实施例2肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD3749与肠膜明串珠菌ATCC10830a形态特征对比
用实施例4方法接种的肠膜明串珠菌ATCC10830a与肠膜明串珠菌BD3749点接种在同一块TYC平板上。结果如图2所示。可以看出，肠膜明串珠菌BD3749由于产不溶性多糖，菌落不透明。而肠膜明串珠菌ATCC10830a不产不溶性多糖，菌落透明。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，其特征在于，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNo.10064。
2.一种制备肠膜明串珠菌CGMCCNo.10064的方法，其特征在于，其包括以下的步骤：在培养基中培养肠膜明串珠菌CGMCCNo.10064即可。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养基为TYC培养基。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的TYC培养基还包括1.5-2.0克的琼脂。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为25～37℃；所述培养的时间为18～72小时。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为30℃；所述培养的时间为18小时或72小时。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养条件为好氧静置培养或震荡培养，较佳地所述震荡培养的震荡速度为180r/min。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养条件为厌氧静置培养。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养前还包括使用种子培养基进行种子培养的步骤，所述的种子培养基为TYC培养基，所述种子培养的时间为24小时，所述种子培养的温度为30℃，所述种子培养的接种量为1％，所述百分比为体积百分比。
10.如权利要求1所述的肠膜明串珠菌CGMCCNo.10064在乳制品生产中的应用。
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