CN105343886B - 一种抑菌性壳聚糖药物载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医用材料领域，尤其涉及一种具有抑菌功能的可降解药物载体及制备方法。本发明提供一种可溶性壳聚糖药物载体，其化学式如式I所示。本发明所得壳聚糖药物载体具有良好的生物相容性、具有一定装载药物的能力、溶解性和一定的抗菌性能。

Description

一种抑菌性壳聚糖药物载体及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，尤其涉及一种具有抑菌功能的可降解药物载体及制备方法。
背景技术
药物洗脱血管支架介入治疗已成为心血管疾病的有效临床手段，除了支架的物理支撑作用保持血管畅通外，支架表面的药物涂层对防止炎症反应、血管内膜增生和晚期支架内再狭窄都具有重要作用。其中，药物涂层采用高分子材料为载体，药物分子与高分子载体以物理或化学方法结合，在生理环境中通过降解、扩散等控制方式，将药物分子以一定浓度持续地释放出来，达到充分发挥药物功效和持续治疗的目的。作为药物载体的材料，是药物涂层缓释体系的重要组成部分，也是调节药物释放速度的介质，将直接影响药物在发挥作用的程度和效果。对药物载体材料一般需要具有良好的生物相容性和生物可降解性，在体内环境中降解为小分子，容易被组织或有机体代谢、吸收或***，对人体无毒副作用，同时载体材料具有一定抑菌性能将有助于防止术中器械被污染的风险。
药物载体一般选用高分子材料，包括天然高分子材料和合成高分子材料。天然高分子材料主要是蛋白质类和植物胶类,具有稳定、无毒、成膜性或成球性好、生物适应性、能大量分离和纯化、具有已知的结构、物理或化学特性等特点,常用的有明胶、海藻酸盐、壳聚糖,蛋白类(胶原、白蛋白)等，但也存在原料不稳定、大多数易引起异体免疫反应、批间重现性差、材料纯度差等缺点。由于天然高分子载体材料在物理、化学和生物学性能方面不能完全适合临床要求，研究开发向分子载体材料成为研究的热点：通过特定官能团的修饰、接技和替代，可实现特异的生物、化学和物理性能，如具有良好的生物相容性，对细胞有良好的黏附能力；能保持细胞的正常生长、分化、增殖能力和分泌基质；具有要求的生物降解速率，材料及其降解产物对机体无毒副作用；具有良好的物理、化学和机械性能，具有可消毒性。目前合成的药物载体材料分为半合成和全合成高分子材料。半合成高分子材料常用的是纤维素类衍生物，其特点是毒性小、黏度大、成盐后溶解度增大，主要有羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、醋酸纤维素酞酸酯(CAP)、乙基纤维素(EC)、甲基纤维素(MC)。合成高分子主要有聚碳酯、聚氨基酸、聚乳酸，乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)等，共同特点是无毒、成膜性及成球性好、化学稳定性高，可用于注射给药。而后者已作为药物持续释放载体应用于药物血管支架(DES)、药物球囊(DCB)等医疗器械上。
壳聚糖以其良好的生物相容性，在食品、美容、生物医学等领域有广泛应用。壳聚糖是甲壳素的主要衍生物，是甲壳素脱除乙酰基后的产物——脱乙酰甲壳素，是一种可降解的生物相容性材料，及良好的抗菌作用。它具有与黏多糖相似的结构特点，后者在组织中分布广泛，是细胞膜有机组成成分之一，故壳聚糖具有优异的生物相容性。壳聚糖所具有的独特分子结构、化学性质，医用级的壳聚糖一般脱乙酰度≥90％，高脱乙酰度的壳聚糖具有良好的生物相容性、体内可降解性、成膜性、可塑性，此外壳聚糖膜还具有促创伤愈合性、抗菌性和药物缓释性等优良的医疗特性并有易于加工成型性等众多优点，因此壳聚糖的应用研究越来越受到人们的关注。
为提高壳聚糖的应用范围，有学者研究了壳聚糖及衍生物在药物制剂中的应用，其中通过脱乙酰化可以提高壳聚糖的可溶性，如CN1283634公开了水溶性壳聚糖的制备方法。抗菌方面亦有大量工作者进行过一些工作，如CN1712417A公开了一种硫脲壳聚糖-Ag+络合物的制备方法、CN1685831A公开了一种壳聚糖/金属铜复合抗菌剂的制备方法、CN101766188A公开了一种壳聚糖抗菌剂，采用一定分子量、一定脱乙酰度的壳聚糖与聚季铵盐的螯合剂作用获得，具有抗菌力强、成本低的特点。在药物胶囊和缓释中也有一些研究，如CN101784267A公开了壳聚糖聚合物提高可溶活性成分的包封率，实现调节可溶活性成分的缓释。近年来还有通过制备壳聚糖微球的方式来作用组织工程或药物载体材料。
有研究者对壳聚糖载体材料进行结构修饰，通过接枝、重组分子链、官能团重建等方式来获得其衍生物，以改变其水溶性和载药能力，但其它性能如聚合物力学性能、溶解性、降解方式却发生了改变，不适合用于血管支架表面涂层。如专利CN 102276756公布了在微波作用下对壳聚糖的羟丁基进行改造，获得一种水溶性好的壳聚糖衍生物，但对抑菌性和药物装载能力未做评估；专利201510080616.9公布了一种具有良好水溶性和抗菌活性的壳聚糖季铵盐衍生物及其制备方法，但不适合于药物器械上的药物载体；专利201210054657.7公布了一种两亲性壳聚糖衍生物(I)及其制备方法，以适合用于药物、与药物组配或作为药物载体，在制备与药物相互组合形成复合体，对于血管支架器械中药物涂层中药物的配比和缓释控制不易调节。
国内外关于通过壳化学修饰提高壳聚糖的水溶性或油溶性专利上百种，大多对壳聚糖分子的C6-OH，C3-OH，C2-NH2进行取代，破坏分子氢键。这些化学改性改变了壳聚糖分子的物理、化学及生物学性能，且未能将壳聚糖的水溶性、载药能力和抗菌性能有机结合在一起。壳聚糖及衍生物作为药物载体材料不仅需要具有良好的生物相容性，同时也需要有一定装载药物的能力、溶解性和一定的抗菌性能。
发明内容
针对上述缺陷，本发明提供一种壳聚糖药物载体，其具有良好的生物相容性、具有一定装载药物的能力、溶解性和一定的抗菌性能。
本发明的技术方案：
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种可溶性壳聚糖药物载体，其化学式如式I所示：
本发明要解决的第二个技术问题是提供上述壳聚糖药物载体的制备方法，步骤如下：
1)壳聚糖与邻苯二甲酸酐反应得到式II所示的胺基保护的壳聚糖产物；
2)再将式II所示的胺基保护的壳聚糖产物与氢氧化钠、氯乙醇反应得式III所示的酰化壳聚糖产物；
3)最后将式III所示的酰化壳聚糖产物还原得式I所示的壳聚糖药物载体(实施例1所得O-壳聚糖)；
其中，式II、式III如下：
进一步，步骤1具体为：壳聚糖中加入有机溶剂搅拌溶胀2～3小时；再搅拌加入邻苯二甲酸酐，然后升温至120～150℃，保温搅拌10～14小时；最后将所得产物经沉降、洗涤、干燥即得式II所示化合物；其中，壳聚糖与邻苯二甲酸酐的摩尔比为：1：2～1：5，每1g壳聚糖有机溶剂的加入量为20-40ml/。
进一步，步骤1中，采用丙酮进行沉降，采用酒精、***进行洗涤，五氧化二膦进行干燥。
步骤1中，所述有机溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)。
进一步，步骤2为：将式II所述化合物与氢氧化钠溶液搅拌混匀后，置于-15～-25℃环境中放置40～55小时，取出解冻后挤出多余的氢氧化钠，然后倒入溶剂充分搅拌后缓慢加入氯乙醇，室温下搅拌40～55小时即得式III所示的化合物；其中，溶剂、氯乙醇的体积比为1.5：1～3：1，氢氧化钠溶液的加入量为每1g式II所示化合物加入2-10ml氢氧化钠溶液；氢氧化钠溶液的浓度为40～60％(质量分数)。
步骤2中，所述溶剂为异丙醇、丁醇、正己烷、甲苯、二甲苯或二氯甲烷中的至少一种；进一步，所述溶剂为异丙醇、异丙醇/丁醇混合物、异丙醇/丁醇/二甲苯混合物。
进一步，步骤3为：式III所示化合物中加入水合肼并升温至40～60℃反应6～10小时，反应结束后冷却至室温，所得反应液用透析膜透析3～5天后，滤去透析液，所得过滤液于-10～-20℃下冷冻干燥即得式I所示壳聚糖药物载体；其中，透析膜分子量为2500-3500。
进一步，上述壳聚糖药物载体的制备方法的反应式如式IV所示：
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种抗菌壳聚糖药物载体，其化学式如式V所示：
本发明要解决的第四个技术问题是提供上述抗菌壳聚糖药物载体的制备方法，具体为：将式I所示化合物用水溶解，再加入乙酰化没食子酸，再依次加入缓冲剂、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，室温搅拌30～50h后，过滤；滤液经沉降、洗涤获得预产物，预产物采用碱液搅拌碱化6～10小时，然后经过滤、洗涤和干燥，即可得到式V所示抗菌壳聚糖药物载体；其中，各原料的物料配比关系为：
式I所示化合物与乙酰化没食子酸的摩尔比为1：3～1：5，，缓冲剂加入量使溶液体的pH值为5-6即可，加入EDC与NHS的摩尔比为1：1～1：1.5。
所述乙酰化没食子酸的制备方法为：将无水没食子酸与乙酰氯及二甲基甲酰胺(DMF，作催化剂)回流反应，直至气泡消失；蒸出过量的乙酰氯，加入溶剂洗涤，减压蒸除溶剂及残留的乙酰氯，产物在真空烘箱中脱除挥发性物质即得乙酰化没食子酸；其中，无水没食子酸、乙酰氯的摩尔比为1：3～1：5，每1g没食子酸加入二甲基甲酰胺的量为20-50ml。
所述溶剂为苯、二甲苯、苯甲醇或三氯化碳中的至少一种。
所述缓冲剂可以是2-吗啉乙磺酸(MES)、柠檬酸或巴比妥酸。缓冲剂是调节溶液pH值约为5，此条件下EDC/NHS的活性最好，EDC/NHS是羧基和氨基成酰胺反应的缩合剂(NMH活化羧基，EDC缩水剂)。
进一步，上述方法中，沉降采用四氢呋喃、苯或四氯化碳等有机溶剂，洗涤采用甲醇、乙醇、丙酮或***等有机溶剂；碱液为NaOH溶液(质量分数为10-25％)、KOH溶液；干燥采用真空干燥。
进一步，上述抗菌壳聚糖药物载体的制备方法的反应式如式VI所示：
本发明的有益效果：
本发明通过化学改性的方式来制备一种具有水溶性、抑菌性和具有良好载药功能的壳聚糖衍生物，特别是用于药物血管支架可控释放的载体材料。该方法中先对壳聚糖中的C2-NH2进行保护，对C6、C3进行烷基化后还原的C2-NH2，C6的接枝使得C2-NH2质子化程度提高，增强了装载药物的能力；在此修饰过程中氢键间作用力受到破坏，提高了壳聚糖溶解性能。获得的壳聚糖衍生物易溶于水，物理、化学及生物学性能符合药物载体材料特性。由于作为药物载体，本发明所得壳聚糖药物载体具有药物缓释功能，同时载体材料能溶于常规有机溶剂，成膜性能良好等特点。
附图说明
图1是壳聚糖和实施例1所得O-壳聚糖的红外图谱。
图2是PLGA和实施1所得O-壳聚糖单位厚度为1um时的载药量。
图3是实施例2抗菌O-壳聚糖的红外图谱。
图4是实施例3壳聚糖载体中药物累积释放曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1水溶性O-壳聚糖的制备
将5g壳聚糖放入500ml圆底烧瓶中，加入100ml二甲基甲酰胺(DMF)搅拌溶胀两小时后，再加入10g邻苯二甲酸酐充分搅拌。将烧瓶置于油浴锅中迅速升温到130℃，一直保温并搅拌12小时，所得产物用丙酮沉降后用酒精洗涤两次，再用***洗涤一次，用五氧化二磷干燥。将上述保护胺基产物放入50ml烧杯中，加入30-50％(wt)氢氧化钠溶液(按1g式II所示化合物中添加2～10ml氢氧化钠溶液的比例添加氢氧化钠溶液)后充分搅拌后，放入-20℃环境中放置48小时，取出解冻后挤出多余的氢氧化钠，将固定放入250ml圆底烧瓶中，倒入30ml异丙醇充分搅拌后，缓慢倒入氯乙醇15-20ml，保持室温搅拌48小时。待反应结束后将反应液冷却至室温，加入过量的水合肼并升温到50℃继续反应8小时，待反应结束后冷却至室温，倒出反应液用分子量为3000的透析膜透析3-5天后，将透析液过滤，过滤液进行冷冻干燥，所得固体即为水溶性的O-壳聚糖，该方法简单，获得的壳聚糖水溶性好，可用于生物医学工程材料中，如药物载体、医用器械材料等。
图1是壳聚糖和O-壳聚糖的红外图谱。可以看到，壳聚糖在1655cm-1的峰为酰胺II谱，说明分子中还存在乙酰胺基，在1320cm-1存在酰胺III的弱吸收峰。C6-OH是一级羟基，在1032cm-1处有特征吸收峰，C3-OH是二级羟基，在1081cm-1处有特征吸收峰。通过化学修饰的O-壳聚糖分子结构未发生改变，但化学修饰后的壳聚糖分子内和分子间的氢键作用被减弱，使得壳聚糖溶解性提高。
由于修饰过程中，壳聚糖中-NH2在反应前后均没有发生改变，但-NH2在被保护和还原时，存在电子云的偏离，特别是C-6上的接技加剧了这种作用，使得整个分子的极性提高，作为载体其载药能力发生较大改变。
PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)是药物血管支架临床上应用的聚合物载体材料，本发明以相同药物浓度和喷涂工艺，通过测量支架载药后涂层厚度和载药量来比较其载药能力。PLGA的药物支架涂层厚度为15μm，血管支架单位载药量为115μg/cm，O-壳聚糖为载体药物涂层厚度为5μm，载药量为135μg/cm。图2是PLGA和本发明所得水溶性O-壳聚糖单位厚度为1um时的载药量；若以血管支架单位面积载药量相当的情况下，而聚合物载体的使用量却少了1/3，说明O-壳聚糖载体材料具有更好的药物装载能力，该载体可以保证药物量的同时，聚合物的使用量可以降低，有利于药物器械的设计要求。
实施例2抑菌O-壳聚糖的制备过程
酰化没食子酸的制备，将1g无水没食子酸与1.8g乙酰氯及30ml二甲基甲酰胺(DMF，作催化剂)回流反应，直至气泡消失；蒸出过量的乙酰氯，加入少量苯洗涤，减压蒸除苯及残留的乙酰氯，产物在真空烘箱中脱除挥发性物质。
将实施例1中的O-壳聚糖用少量水溶解后，加入5g乙酰化没食子酸，再依次加入过量的MES、NHS、EDC，室温搅拌36h后，过滤；向滤液中加入过量的四氢呋喃沉降，再用大量甲醇洗涤，所得产物再用浓度为15wt％的NaOH碱化处理8小时，再用甲醇进行洗涤，真空干燥，即可得到抑菌O-壳聚糖。
图3是抗菌O-壳聚糖的红外图谱。从图中可以看到，抗菌O-壳聚糖在3011cm-1处出现了芳香环上的-C-H吸收峰，说明壳聚糖分子上已成功接枝了没食子酸，由于C6-OH和C3-OH均在提高溶解性时已被-CH2CH2OH所取代，因此没食子酸取代反应主要在活性较高的-NH2上。这类壳聚糖修饰产物，由于在不同基团上的取代反应，进一步削弱了壳聚糖分子间(内)的作用力。
本发明采用浸渍滤纸进行细菌培养，通过抑菌圈直径来判断抑菌能力大小：抑菌圈直径越大，表明抑菌效果越好。本发明分别对空白滤纸、壳聚糖、O-壳聚糖、没食子酸O-壳聚糖和酰化没食子酸进行对比实验，与与空白样品相比，本实施例所得没食子酸抑菌O-壳聚糖的抑菌圈直径达7mm，酰化没食子酸的抑菌圈直径为10mm、壳聚糖的抑菌圈直径为1.5mm、对照样(空白滤纸)的抑菌圈直径为0mm、实施例1所得O-壳聚糖的抑菌圈直径为3.5mm；由此可见，与壳聚糖相比，本发明所得抑菌壳聚糖药物载体呈现出良好的抑菌能力。
实施例3抗菌壳聚糖药物载体的具体应用
实施例2所得抑菌壳聚糖溶液有一定粘度，结合超声雾化的特点，先将支架浸入含药壳聚糖溶液中，取出将滤纸吸干一端过量液体后，将支架一端固定于超声雾化工装上，启动程序，进药管放入丙酮，进样速率为0.001-0.01ml/s，待支架表面干燥后取下，重复多次可获设计厚度的药物涂层。图4是该药物载体涂层的药物释放曲线，可以看出，在前六个小时内出现了药物突释，平均释放速率为13.35ug/天；由于抑菌壳聚糖薄膜的降解特征，药物在六小时后释放趋于平稳，保持在1.5mg/天，三天时药物释放不到20％，具有很好的缓释放功能。
对比例1壳聚糖直接接枝没食子酸
将5g壳聚糖中加入二甲基甲酰胺搅拌溶胀2～3小时，直接加入2g没食子酸，在100～150℃加热搅拌5～8小时，冷却后进行丙酮洗涤、干燥，通过上述方法拟获得壳聚糖接枝没食子酸的衍生物。但结果表明，在上述条件下，壳聚糖很难接枝上具有抑菌功能的没食子酸。
对比例2酰化没食子酸后接枝壳聚糖
先将没食子酸酰化处理：将无水没食子酸与乙酰氯及少量二甲基甲酰胺(DMF，作催化剂)回流反应，直至气泡消失。蒸出过量的乙酰氯，加入少量苯洗涤，减压蒸除苯及残留的乙酰氯，产物在真空烘箱中脱除挥发性物质(与实施例2制备方法完全相同)。
壳聚糖用少量稀醋酸溶解后，加入3g乙酰化没食子酸，再依次加入过量的MES、NHS、EDC，室温搅拌30h后，过滤；向滤液中加入过量的四氢呋喃沉降，再用大量甲醇洗涤，所得产物再用15％的NaOH碱化处理8小时，再用甲醇进行洗涤、干燥，以获得具有抑菌功能的没食子酸壳聚糖。但是对产物进行分析，发现壳聚糖接枝上没食子酸的衍生物产量不高(接枝率只有2-5％，而本发明化学修饰后的壳聚糖与酰化没食子酸反应的接枝率可达20-30％)，而且伴随大量的副产物，其结果主要由于未对壳聚糖进行化学修饰，不能充分与酰化没食子酸进行反应。

Claims (11)

1.抗菌壳聚糖药物载体的制备方法，其特征在于，将式I所示化合物用水溶解，再加入乙酰化没食子酸，再依次加入缓冲剂、N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，室温搅拌30～50h后，过滤；滤液经沉降、洗涤获得预产物，预产物采用碱液搅拌碱化6～10小时，然后经过滤、洗涤和干燥，即可得到式V所示抗菌壳聚糖药物载体；其中，各原料的物料配比关系为：
式I所示化合物与乙酰化没食子酸的摩尔比为1：3～1：5，缓冲剂加入量使溶液体的pH值为5-6，EDC与NHS的摩尔比为1：1～1：1.5；
2.根据权利要求1所述抗菌壳聚糖药物载体的制备方法，其特征在于，所述乙酰化没食子酸的制备方法为：将无水没食子酸与乙酰氯及二甲基甲酰胺回流反应，直至气泡消失；蒸出过量的乙酰氯，加入溶剂洗涤，减压蒸除溶剂及残留的乙酰氯即得产物，产物脱除挥发性物质即得乙酰化没食子酸；其中，无水没食子酸、乙酰氯的摩尔比为1：3～1：5，每1g没食子酸加入二甲基甲酰胺的量为20～50ml。
3.根据权利要求1或2所述抗菌壳聚糖药物载体的制备方法，其特征在于，所述缓冲剂为2-吗啉乙磺酸、柠檬酸或巴比妥酸；沉降采用四氢呋喃、苯或四氯化碳，洗涤采用甲醇、乙醇、丙酮或***；碱液NaOH溶液或KOH溶液；干燥采用真空干燥。
4.根据权利要求1所述抗菌壳聚糖药物载体的制备方法，其特征在于，所述式I所示化合物的制备方法包括如下步骤：
1)壳聚糖与邻苯二甲酸酐反应得到式II所示的胺基保护的壳聚糖产物；
2)再将式II所示的胺基保护的壳聚糖产物与氢氧化钠、氯乙醇反应得式III所示的酰化壳聚糖产物；
3)最后将式III所示的酰化壳聚糖产物还原得式I所示的可溶性壳聚糖药物载体；
其中，式II、式III为：
5.根据权利要求4所述抗菌壳聚糖药物载体的制备方法，其特征在于，步骤1壳聚糖与邻苯二甲酸酐反应得到式II所示的胺基保护的壳聚糖产物的过程为：壳聚糖中加入有机溶剂搅拌溶胀2～3小时；再搅拌加入邻苯二甲酸酐，然后升温至120～150℃，保温搅拌10～14小时；最后将所得产物经沉降、洗涤、干燥即得式II所示化合物；其中，壳聚糖与邻苯二甲酸酐的摩尔比为：1：2～1：5，每1g壳聚糖中有机溶剂的加入量为20～40ml。
6.根据权利要求5所述抗菌壳聚糖药物载体的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述有机溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮或1,3-二甲基-2-咪唑啉酮；采用丙酮进行沉降，采用酒精、***进行洗涤，采用五氧化二膦进行干燥。
7.根据权利要求4～6任一项所述抗菌壳聚糖药物载体的制备方法，其特征在于，步骤2的反应过程为：将式II所述化合物与氢氧化钠溶液搅拌混匀后，置于-15～-25℃环境中放置40～55小时，取出解冻后挤出多余的氢氧化钠，然后倒入溶剂充分搅拌后加入氯乙醇，室温下搅拌40～55小时即得式III所示的化合物；其中，1g式II所示化合物中添2～10ml氢氧化钠溶液，溶剂与氯乙醇的体积比为1.5：1～3：1。
8.根据权利要求7所述抗菌壳聚糖药物载体的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述溶剂为异丙醇、丁醇、正己烷、甲苯、二甲苯或二氯甲烷中的至少一种。
9.根据权利要求8所述抗菌壳聚糖药物载体的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述溶剂为异丙醇、异丙醇/丁醇混合物、异丙醇/丁醇/二甲苯混合物。
10.根据权利要求4～6、8或9任一项所述抗菌壳聚糖药物载体的制备方法，其特征在于，步骤3反应过程为：式III所示化合物中加入水合肼并升温至40～60℃反应6～10小时，反应结束后冷却至室温，所得反应液用透析膜透析3～5天后，滤去透析液，所得过滤液于-20～-10℃下冷冻干燥即得式I所示壳聚糖药物载体；其中，透析膜分子量为2500-3500。
11.根据权利要求7所述抗菌壳聚糖药物载体的制备方法，其特征在于，步骤3反应过程为：式III所示化合物中加入水合肼并升温至40～60℃反应6～10小时，反应结束后冷却至室温，所得反应液用透析膜透析3～5天后，滤去透析液，所得过滤液于-20～-10℃下冷冻干燥即得式I所示壳聚糖药物载体；其中，透析膜分子量为2500-3500。
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