CN105331634A - 一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于将成纤维细胞转化为PV神经元的组合物，所述组合物含有Ascl1基因以及FSK中的一种或多种。本发明还提供了一种将成纤维细胞转化为神经元细胞的方法。本发明还提供了根据本发明的方法制备的神经元细胞。在制备用于治疗神经***疾病的药物中的应用。本发明还提供了根据本发明的方法制备的神经元细胞在制备用于治疗神经***疾病的药物中的应用。本发明通过试验证明，所述转分化技术可以高效获得PV神经元，移植后很好的治疗癫痫疾病，通过癫痫发作次数的降低，提高记忆力，从而为治疗癫痫及相关疾病的治疗开辟了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和神经发育领域。本发明具体涉及一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法及其应用。
背景技术
基于干细胞移植技术的再生医学为人类战胜难治性退行性疾病带来了巨大的希望。诱导多能干细胞由于突破了胚胎干细胞的伦理障碍，曾被认为是再生医学的新希望。然而，其诱导效率的低下，批次间的不稳定性及高致瘤性使其很难直接用于疾病治疗。
自2010年以来，国内外一些科学家通过表达特定转录因子实现了将一种类型的成体细胞转变为另一种类型的成体细胞或成体干细胞。这一方法被称为“转分化”。这一技术不需要经历多能性干细胞这一中间状态，因此可以降低致癌风险。如果能将人体内的其他细胞直接转变为疾病治疗所需要细胞类型，则可以避免细胞移植带来的一系列问题。因此转分化技术有可能为退行性疾病和器官机械损伤等疾病提供良好的治疗方法，具有广阔的临床应用价值。
小白蛋白Parvalbumin(PV)是一种脑中特异的重要的神经元。小白蛋白最先是从蛙与鱼的肌肉中分离出来的一种水溶性酸性蛋白质，分子量大约12K，被称为“低分子白蛋白”。1981年，发现PV存在于神经组织内，并且发现含PV的神经元分布与GABA神经元的分布有很高的一致性，因而开始了神经组织中含PV神经元的研究，也对GABA神经元的研究提出了新的内容。PV神经元在大脑中的分布比较广泛，PV神经元属于GABA神经元家族，在脑中发挥独特的功能，维持脑电活动的平衡，已有报道癫痫疾病可能由于PV神经元的异常引起的。
癫痫是神经***常见疾病之一，癫痫已成为神经内科的第二大常见疾病，患病率仅次于脑卒中。世界卫生组织统计，截止到2013年，我国约有近1000万癫痫患者，其中600万名为活动性癫痫患者，且每年新增癫痫患者40万名，给社会、家庭和个人带来了沉重的负担。
癫痫是慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征。以脑神经元异常放电引起反复痫性发作为特征。癫痫的发病率与年龄有关。一般认为1岁以内患病率最高，其次为1～10岁以后逐渐降低。
癫痫由大脑神经元异常放电，导致短暂中枢神经***功能失常的慢性脑部疾病，根本原因是兴奋性与抑制性神经递质的失衡。通过移植抑制性神经元治疗此类疾病已经取得了很好的效果。但抑制性神经元的来源极大的限速了癫痫病的治疗。
发明内容
因此，本发明的目的是针对当前无法高效获得抑制性神经元的不足，提供一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法。同时，本申请提供了将所述神经元细胞用于治疗神经***癫痫相关疾病的用途，从而为癫痫或其它神经相关疾病的治疗开辟新的治疗途径。
除非特别指明，本说明书中的“PV”神经元均指小白蛋白神经元。
除非特别说明，本说明书中的“FSK”均指福思科林(Forskolin)，是一种分离自印度植物(Coleusforskohlii)的天然二萜产物，细胞生理学实验研究中Forskolin通常用来提高环腺苷酸(cAMP)水平。
针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种组合物，所述组合物用于将成纤维细胞转分化为神经元细胞，所述组合物含有Ascl1基因和FSK。
优选地，所述神经元细胞为PV神经元细胞。
另一方面，本发明还提供了上述组合物的用途，所述组合物用于制备将成纤维细胞转分化为神经元细胞，优选PV神经元细胞的试剂。
本发明还提供了一种用于将成纤维细胞转分化为神经元细胞的培养基，所述培养基中含有FSK，优选地，所述FSK的浓度为5-30μM，优选10μM；
优选地，将FSK溶于水，制备为一定浓度的储液，然后用于制备上述培养基，优选地，所述FSK储液的浓度为0.5M-1M；
优选地，所述神经元培养基由DMEM培养基、B-27添加剂、脑源性神经营养因子(BDNF)和FSK组成，其中，所述各成分的比例为每1升培养基中含有980毫升的DMEM培养基，20毫升50×B-27添加剂,10微升10μg/mlBDNF以及5-30微升1M的FSK储液。
再一方面，本发明提供了一种将成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将Ascl1基因导入成纤维细胞；
优选地，所述成纤维细胞为小鼠成纤维细胞；
优选地，所述成纤维细胞使用DMEM培养基加10％胎牛血清培养基培养；
优选地，所述Ascl1基因使用腺病毒pAD载体导入成纤维细胞；
2)将已导入Ascl1基因的成纤维细胞，使用含有FSK的神经元培养基培养；得到神经元细胞。
优选地，所述方法还包括步骤3)鉴定神经元细胞，优选地，所述鉴定神经元的方法为免疫组化法。
优选地，所述步骤1)是通过包括以下步骤的方法实现的：
a.腺病毒载体构建：将Ascl1基因通过BamHI+EcoRI双酶切构建到腺病毒pAD载体；
b.小鼠成纤维细胞细胞的制备：选取14.5天的小鼠胚胎，取皮肤组织，用0.5％胰酶消化，使用DMEM加10％胎牛血清培养消化后的皮肤成纤维细胞，2天后传代一次，得到成纤维细胞；
c.病毒感染：使用步骤a构建的Ascl1腺病毒颗粒，感染成纤维细胞，从而将Ascl1基因导入成纤维细胞；
优选地，所述步骤1)是通过包括以下步骤的方法实现的：将Ascl1基因导入成纤维细胞6小时后。使用本发明所述的培养基培养，之后每两天更换一次培养基，诱导10后，得到神经元细胞。
优选地，所述鉴定神经元细胞是通过包括以下步骤的方法实现的：
将神经元细胞通过4％多聚甲醛固定，之后用5％BSA封闭，之后用兔的Tuj1一抗孵育过夜，第二天用PBS洗3遍，然后用cy3链接的驴抗兔的二抗孵育1小时，在荧光显微镜下观测细胞形态和染色结果。
再一方面，本发明还提供了根据本发明的方法制备的神经元细胞。
本发明提供了上述组合物在制备用于治疗神经***疾病的药物中的应用。
本发明还提供了根据本发明的方法制备的神经元细胞在制备用于治疗神经***疾病的药物中的应用。
优选地，所述神经***疾病为癫痫病。
本发明通过试验证明，所述转分化技术可以高效获得PV神经元，移植后很好的治疗癫痫疾病，通过癫痫发作次数的降低，提高记忆力，从而为治疗癫痫及相关疾病的治疗开辟了新的途径。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明获得的神经细胞；
其中，A图为感染的GFP细胞；
B图为神经元特异抗体Tuj1免疫组化染色；
C图为感染GFP细胞与Tuj1染色共标；
“GFP”代表感染的成纤维细胞，“Tuj1”代表转分化神经元的Tuj1抗体染色，“GFP/Tuj1”绿色的感染细胞有多少转分化为神经元；
图2表明转分化神经细胞是PV神经元；
其中，A图为PV神经元特异抗体PV免疫组化染色；
B图为神经元特异抗体Tuj1免疫组合染色；
C图为PV与Tuj1抗体染色共标；
其中：“PV”代表PV神经元特异标记PV抗体染色，“Tuj1”代表转分化神经元的Tuj1抗体染色；
图3为移植神经细胞的示意图，其中1处为移植细胞，2处为海马区DAPI染色；
图4表明的是制作癫痫小鼠的模型，其中左边是正常小鼠对照组，右边是癫痫小鼠模型组；
图5表明癫痫小鼠移植抑制性PV神经元后，旷场实验表明小鼠癫痫症状得到恢复其中：“Control”代表正常对照组，“Epilepsy”代表癫痫小鼠组，“PV-HC”代表移植组；
具体实施方式
除非特别指明，以下实施例中所用的C57BL/6J小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
除非特别指明，以下实施例中所用的组合物均为分析纯级别的组合物，且可从Sigma购获得。
实施例1诱导成纤维细胞转分化为PV神经元
具体实验流程：
1)腺病毒载体构建：将Ascl1基因通过BamHI+EcoRI双酶切构建到腺病毒pAD载体，分别进行病毒的包装和病毒滴度的测定；
2)小鼠成纤维细胞细胞的制备：选取14.5天的小鼠胚胎，去头、尾、脊柱、内脏和生殖腺后，取皮肤组织，用0.5％胰酶消化5分钟后，把消化后的皮肤成纤维细胞铺到10厘米培养皿中用DMEM加10％胎牛血清，进行培养，2天后传代一次，最终获得成纤维细胞；
3)病毒感染：将6万成纤维细胞铺到24孔板的一个孔，将包装好的Ascl1腺病毒颗粒，感染成纤维细胞，6小时后，更换为神经元培养基(DMEM,1×B-27,10μg/mlBDNF)，在神经元培养基中添加小化合物FSK(10μM)，之后两天更换一次培养基，诱导10后，检测成纤维细胞是否转分化神经元；
4)10天培养后，将转分化细胞通过4％多聚甲醛固定，之后用5％BSA封闭，之后用兔的Tuj1一抗孵育过夜，第二天用PBS洗3遍，然后用cy3链接的驴抗兔的二抗孵育1小时，之后在荧光显微镜下观测细胞形态和染色结果。
实验结果：
确定转分化形成的神经元的数目和形态。如Tuji1、PV等神经元标记的检测，结果见图1和图2，其中图1为本发明获得的神经细胞；A图为感染的GFP细胞；B图为神经元特异抗体Tuj1免疫组化染色；C图为感染GFP细胞与Tuj1染色共标；“GFP”代表感染的成纤维细胞，“Tuj1”代表转分化神经元的Tuj1抗体染色，“GFP/Tuj1”绿色的感染细胞有多少转分化为神经元，表明本发明获得到神经元细胞表达神经元特异的标记Tuj1。
图2表明转分化神经细胞是PV神经元；其中，A图为PV神经元特异抗体PV免疫组化染色；B图为神经元特异抗体Tuj1免疫组合染色；C图为PV与Tuj1抗体染色共标；其中：“PV”代表PV神经元特异标记PV抗体染色，“Tuj1”代表转分化神经元的Tuj1抗体染色；表明本发明获得到神经元细胞表达PV神经元特异的标记PV(图2)。
实施例2移植PV神经细胞治疗癫痫疾病
具体实验流程：
1)癫痫小鼠模型的建立。通过腹腔注射匹鲁卡品药物(280mg/kg)到6周大的成年C57小鼠中，注射药物2周后，诱导建立癫痫小鼠模型。本试验的小鼠一共分为3组，包括10只正常小鼠组，10只癫痫小鼠组，10只移植神经细胞到癫痫小鼠组。
2)移植神经细胞。通过立体定位及微量注射***，移植5万神经细胞到小鼠脑中的海马区域。
具体小鼠海马定位：用定位针在前囟后2mm,矢状缝旁开2.5mm处定位一点，即为海马的平面位置，然后在此点上用钻孔针在颅骨上钻一小圆孔。
移植细胞：小鼠海马则位于该圆孔下2mm，操作仪器使注射器针头由小鼠脑钻孔处下降2mm时完成注射到小鼠脑海马处。结果如图3所示，其中1处为移植细胞，2处为海马区DAPI染色；
3)行为学范式检测小鼠疾病恢复程度。通过旷场实验行为学范式检测小鼠的行为学改变。抓住小鼠尾根部三分之一处提起，轻轻放入旷场实验箱(50厘米×50厘米×50厘米)正中格，记录5分钟内小鼠在旷场盒内的运动轨迹。
实验结果：
通过将神经元移植到癫痫小鼠海马区域，2个月后检测小鼠的行为学指标。通过旷场实验，我们观察到正常小鼠组，癫痫小鼠组，移植组分别在5分钟内运动距离为11,000，15,000，14000厘米；分别待在中心区域时间的比例为3.7％，9.1％，4.2％；分别待在中心区域距离的比例为8.2％，20.3％，10.4％，结果如图5所示，表明癫痫小鼠移植抑制性PV神经元后，旷场实验表明小鼠癫痫症状得到恢复其中：“Control”代表正常对照组，“Epilepsy”代表癫痫小鼠组，“PV-HC”代表移植组。
旷场实验显示癫痫组运动时间多，运动距离长，在检测盒子中间待的时间明显多，显示癫痫鼠具有高频的活动。但神经元移植后，移植组运动距离有一定程度减少，呆在中心区时间和距离，移植组得到明显的改善。
Claims (10)
1.一种组合物，所述组合物用于将成纤维细胞转分化为神经元细胞，所述组合物包括Ascl1基因和FSK；
优选地，所述神经元细胞为PV神经元细胞。
2.如权利要求1所述的组合物的用途，所述组合物用于制备将成纤维细胞转分化为神经元细胞的试剂，优选地，所述神经元细胞为PV神经元细胞。
3.一种用于将成纤维细胞转分化为神经元细胞的培养基，其中，所述培养基含有FSK，所述FSK的浓度为5-130μM，优选10μM；
优选地，将FSK溶于水，制备为一定浓度的储液，然后用于制备所述培养基，优选地，所述FSK储液的浓度为0.5M-1M；
优选地，所述培养基由DMEM培养基、B-27添加剂、脑源性神经营养因子(BDNF)和FSK组成；
其中，所述DMEM培养基、B-27添加剂、脑源性神经营养因子(BDNF)和FSK的比例为每1升培养基中含有980毫升的DMEM培养基，20毫升50×B-27添加剂,10微升10μg/mlBDNF以及5-30微升1M的FSK储液。
4.一种将成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将Ascl1基因导入成纤维细胞；
优选地，所述成纤维细胞为小鼠成纤维细胞；
优选地，所述成纤维细胞使用DMEM培养基加10％胎牛血清培养基培养；
优选地，所述Ascl1基因使用腺病毒pAD载体导入成纤维细胞；
2)将已导入Ascl1基因的成纤维细胞，使用如权利要求3所述的神经元培养基培养，得到神经元细胞；
优选地，所述方法还包括鉴定神经元细胞的步骤，优选地，所述鉴定神经元细胞的步骤通过免疫组化法来进行。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤1)是通过包括以下步骤的方法来实现的：
a.腺病毒载体构建：将Ascl1基因通过BamHI+EcoRI双酶切构建到腺病毒pAD载体；
b.小鼠成纤维细胞细胞的制备：选取14.5天的小鼠胚胎，取皮肤组织，用0.5％胰酶消化，使用DMEM加10％胎牛血清培养消化后的皮肤成纤维细胞，2天后传代一次，得到成纤维细胞；
c.病毒感染：使用步骤a构建的Ascl1腺病毒颗粒，感染成纤维细胞，从而将Ascl1基因导入成纤维细胞。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤2)是通过包括以下步骤的方法来实现的：
在将Ascl1基因导入成纤维细胞6小时后，使用如权利要求3所述的神经元培养基培养，之后每两天更换一次培养基，诱导10天后，得到神经元细胞。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述鉴定神经元细胞的步骤是通过包括下述步骤的方法来实现的：
将得到的神经元细胞通过4％多聚甲醛固定，之后用5％BSA封闭，之后用兔的Tuj1一抗孵育过夜，第二天用PBS洗3遍，然后用cy3链接的驴抗兔的二抗孵育1小时，在荧光显微镜下观测细胞形态和染色结果。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法制备的神经元细胞。
9.一种组合物，所述组合物包括如权利要求8所述的神经元细胞。
10.如权利要求8所述的神经元细胞或如权利要求9所述的组合物在制备用于治疗神经***疾病的药物中的应用；
优选地，所述神经***疾病为癫痫病。
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018206798A1 (en) * | 2017-05-12 | 2018-11-15 | Parmar Malin | Systems |
| CN110305846A (zh) * | 2018-03-20 | 2019-10-08 | 中山大学中山眼科中心 | 视网膜节细胞的制备方法 |
| CN110665059A (zh) * | 2019-10-17 | 2020-01-10 | 苏州大学 | 一种组织工程化神经移植体及其制备方法 |
| CN110872576A (zh) * | 2019-06-06 | 2020-03-10 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种将小鼠成纤维细胞转分化为多巴胺能神经元的方法 |
| CN111073855A (zh) * | 2018-10-19 | 2020-04-28 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法及应用 |
| CN113278585A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-08-20 | 广西大学 | 一种高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法 |
| CN114231494A (zh) * | 2021-11-29 | 2022-03-25 | 中国科学院动物研究所 | USP10基因和/或Ascl1基因在诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的应用及方法 |
| CN114958747A (zh) * | 2022-06-08 | 2022-08-30 | 中国科学院动物研究所 | 一种多能干细胞诱导产生兴奋性和抑制性神经元的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140051085A1 (en) * | 2011-03-01 | 2014-02-20 | The Scripps Research Institute | Direct reprogramming of human fibroblasts to functional neurons under defined conditions |
| CN103849601A (zh) * | 2012-12-05 | 2014-06-11 | 上海生物制品研究所有限责任公司 | 一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法及其应用 |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140051085A1 (en) * | 2011-03-01 | 2014-02-20 | The Scripps Research Institute | Direct reprogramming of human fibroblasts to functional neurons under defined conditions |
| CN103849601A (zh) * | 2012-12-05 | 2014-06-11 | 上海生物制品研究所有限责任公司 | 一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MENG-LU LIU ET AL.: "Small molecules enable neurogenin 2 to efficiently convert human fibroblasts into cholinergic neurons", 《NATURE COMMUNICATIONS》 * |
| 赵娟娟等: "PDGFR-β基因敲除小鼠上丘内Otx2 和PV 免疫反应阳性神经元的分布", 《神经解剖学杂志》 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018206798A1 (en) * | 2017-05-12 | 2018-11-15 | Parmar Malin | Systems |
| CN110305846A (zh) * | 2018-03-20 | 2019-10-08 | 中山大学中山眼科中心 | 视网膜节细胞的制备方法 |
| CN111073855A (zh) * | 2018-10-19 | 2020-04-28 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 诱导星形胶质细胞转分化为五羟色胺能神经元的方法及应用 |
| CN110872576A (zh) * | 2019-06-06 | 2020-03-10 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种将小鼠成纤维细胞转分化为多巴胺能神经元的方法 |
| CN110665059A (zh) * | 2019-10-17 | 2020-01-10 | 苏州大学 | 一种组织工程化神经移植体及其制备方法 |
| CN110665059B (zh) * | 2019-10-17 | 2021-09-28 | 苏州大学 | 一种组织工程化神经移植体及其制备方法 |
| CN113278585A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-08-20 | 广西大学 | 一种高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法 |
| CN113278585B (zh) * | 2021-03-26 | 2023-09-15 | 广西大学 | 一种体外诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法 |
| CN114231494A (zh) * | 2021-11-29 | 2022-03-25 | 中国科学院动物研究所 | USP10基因和/或Ascl1基因在诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的应用及方法 |
| CN114231494B (zh) * | 2021-11-29 | 2023-09-05 | 中国科学院动物研究所 | USP10基因和/或Ascl1基因在诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的应用及方法 |
| CN114958747A (zh) * | 2022-06-08 | 2022-08-30 | 中国科学院动物研究所 | 一种多能干细胞诱导产生兴奋性和抑制性神经元的方法 |
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