CN105331548A - 一种紫丁香蘑菌株及其液体菌种与制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫丁香蘑菌株及其液体菌种与制备方法，所述的紫丁香蘑菌株为紫丁香蘑M-012^#菌株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2015年8月21日，保藏编号：CGMCC？No.11206；所述的紫丁香蘑M-012^#的液体菌种是以所述紫丁香蘑菌株M-012^#经斜面培养、种子培养、发酵后制成的液体菌种。所述的紫丁香蘑M-012^#的液体菌种的制备方法包括斜面培养、种子培养、发酵步骤。本发明的有益效果是：一是菌丝体生物量高，可达28g/Kg，而固体菌包菌丝体生物量大约在6-13g/Kg；二是菌丝生长速度快，在直径10cm的平板上菌丝只要7d就可以长满平板；三是培养污染率低，≤2%。同时采用液体发酵法时间短，大约72~96h，而普通的固体包培养需要15d以上。

Description

一种紫丁香蘑菌株及其液体菌种与制备方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种紫丁香蘑菌株及其液体菌种与制备方法。

背景技术

紫丁香蘑[Lepistanuda(Bull.)Cooke]是一种香味浓郁，色泽艳丽，营养丰富的食用菌，在发过被公认为上等食物。不仅如此，紫丁香蘑在抗癌试验中还表现出对小白鼠肿瘤的抑制高达90%，对艾氏癌的抑制率更是高达100%。但是目前市场上的菌种都是出于垄断地位的法国的紫丁香蘑的菌种，而我国自己的紫丁香蘑菌种还是稀缺的，这主要是由于我们的菌种性状不稳定，菌种的独特性导致培养方法与法国菌种培养方法不尽相同，因此我们迫切需要研究出我国自己的菌株，打破法国在紫丁香蘑菌种的垄断地位，并研究出相应的培养方法，进行配套的生产栽培技术，有效的提高我们的紫丁香蘑的产量等。

在紫丁香蘑的优良菌种的获得是关键技术环节。目前国内大多采用固体制种技术，而很少使用液体发酵。对于固体制种技术而言，液体发酵技术具有具有菌丝生长良好、菌球均匀、性状稳定，较少污染、培养基利用充分的优点。本专利采用液体发酵技术制作品质优良、性状稳定的液体菌种，对后期人工栽培和医学研究提供保障。

发明内容

本发明第一目的在于提供一种紫丁香蘑菌株，第二目的在于提供一种紫丁香蘑M-012^#的液体菌种，第三目的在于提供所述紫丁香蘑M-012^#的液体菌种的制备方法。

本发明第一目的是这样实现的，所述的紫丁香蘑菌株为紫丁香蘑M-012^#菌株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2015年8月21日，保藏编号：CGMCCNo.11206；所述紫丁香蘑M-012^#菌株属于真菌界，担子菌门，伞菌纲，伞菌目，口蘑科，香蘑属。

紫丁香蘑M-012^#菌株的获得与鉴定

1、将采集的紫丁香蘑子实体内壁组织块接种到试管琼脂培养基斜面上，于18~24℃下培养5~10d，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好且菌核生成能力强的菌株，获得紫丁香蘑分离试管种，所述的试管琼脂培养基的配方：马铃薯16g，葡萄糖1.6g，KH₂PO₄0.03g，琼脂1.6g，MgSO₄0.02g，蒸馏水100ml，pH7.0；培养温度20~28℃。

2、将紫丁香蘑分离试管种菌丝体接种到平板培养皿上进行菌种纯化，培养条件为18~24℃下避光，所述的琼脂培养基的配方：马铃薯16g，葡萄糖1.6g，KH₂PO₄0.03g，琼脂1.6g，MgSO₄0.02g，蒸馏水100ml，pH7.0；培养温度20~28℃；2d后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，所述的培养基配方：马铃薯16g，葡萄糖1.6g，KH₂PO₄0.03g，琼脂1.6g，MgSO₄0.02g，蒸馏水100ml，pH7.0；于18~24℃下培养5~7d，获得紫丁香蘑纯化试管种。

3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按CTAB方法提取紫丁香蘑总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，将所测得试验样品的ITS序列提交NCBI数据库进行BLAST序列比对分析，与NCBI中的紫丁香蘑(L.nuda)序列Identities=606/606(100%)，Gaps=0/606(0%)，分析确定分离得到的纯培养物为本发明所述的紫丁香蘑（L.nuda）菌丝体。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：一是菌丝体生物量高，可达28g/Kg，而固体菌包菌丝体生物量大约在6~13g/Kg；二是菌丝生长速度快，在直径10cm的平板上菌丝只要7d就可以长满平板；三是培养污染率低，≤2%。同时采用液体发酵法时间短，大约72~96h，而普通的固体包培养需要15d以上。

本发明利用云南原产地紫丁香蘑子实体筛选出优良菌株，为紫丁香蘑人工栽培提供优良菌种。

本发明所提供的紫丁香蘑M-012^#菌株保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2015年08月21日；保藏登记入册的编号CGMCCNO.11206。

本发明第二目的是这样实现的，是以所述紫丁香蘑菌株M-012^#经斜面培养、种子培养、发酵后制成的液体菌种。

本发明的第三目的是这样实现的，包括斜面培养、种子培养、发酵步骤，具体包括：

A、斜面培养：将紫丁香蘑菌株M-012^#的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，在温度为18~24℃下培养5~7d，得试管菌种；

B、种子培养：将试管菌种接种到液体培养基中，在温度为20~26℃下摇床培养5~11d，得液体发酵种子；

C、发酵：将液体发酵种子按发酵培养基质量分数5~9%的量接种入发酵罐，在罐压0.03~0.05MPa，温度21~23℃，pH值7.0~8.0，搅拌速度130~150r/min，通气量70~90%下培养80~90h，得到紫丁香蘑M-012^#的液体菌种。

本发明解决的技术问题是：一是从紫丁香蘑(L.nuda)发生地——云南省昆明市双龙乡野鸭湖野生附近生长的该菌的子实体进行组织分离培养得到，具有明显的地域性特征；二是克服现有技术菌丝生长不均匀、污染率高、培养基利用不充分等不足。其目的是提供一种具有产量高、菌丝生长快速、抗污染的新的优良紫丁香蘑菌株及其培养方法。

本发明的有益效果是：一是菌丝体生物量高，可达28g/Kg，而固体菌包菌丝体生物量大约在6-13g/Kg；二是菌丝生长速度快，在直径10cm的平板上菌丝只要7d就可以长满平板；三是培养污染率低，≤2%。同时采用液体发酵法时间短，大约72~96h，而普通的固体包培养需要15d以上。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。

本发明所述的紫丁香蘑菌株为紫丁香蘑M-012^#菌株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2015年8月21日，保藏编号：CGMCCNo.11206；所述紫丁香蘑M-012^#菌株属于真菌界，担子菌门，伞菌纲，伞菌目，口蘑科，香蘑属。

本发明所述的紫丁香蘑M-012^#的液体菌种，是以所述紫丁香蘑菌株M-012^#经斜面培养、种子培养、发酵后制成的液体菌种。

本发明所述的紫丁香蘑M-012^#的液体菌种的制备方法，包括斜面培养、种子培养、发酵步骤，具体包括：

A、斜面培养：将紫丁香蘑菌株M-012^#的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，在温度为18~24℃下培养5~7d，得试管菌种；

B、种子培养：将试管菌种接种到液体培养基中，在温度为20~26℃下摇床培养5~11d，得液体发酵种子；

C、发酵：将液体发酵种子按发酵培养基质量分数5~9%的量接种入发酵罐，在罐压0.03~0.05MPa，温度21~23℃，pH值7.0~8.0，搅拌速度130~150r/min，通气量70~90%下培养80~90h，得到紫丁香蘑M-012^#的液体菌种。

A步骤中所述的试管琼脂培养基为改良PDA培养基，其成分为：马铃薯15~17g，葡萄糖1.5~1.7g，KH₂PO₄0.02~0.04g，琼脂1.5~1.7g，MgSO₄0.01~0.03g，其余为水，pH值为7.0。

B步骤中所述的液体培养基的成分为：麸皮5~10g，黄豆粉0.5~1g，麦芽糖0.5~1g，可溶性淀粉1~2g，其余为水，pH值为7.0。

C步骤中所述的发酵培养基的成分为：麸皮5~10g，黄豆粉0.5~1g，麦芽糖0.5~1g，可溶性淀粉1~2g，其余为水，pH值为7.0~8.0。

下面通过实施例加以说明：

下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例野生紫丁香蘑在云南省昆明市双龙乡野鸭湖边采集；采集方法为徒手采集，采集时候注意保持子实体完整、无霉变、无病虫害。

实施例1

1.1紫丁香蘑M-012^#的获得

⑴将采集的野生紫丁香蘑子实体切成块即组织块，将组织块接种到菌种分离纯化培养基斜面上，于18℃下培养10d，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得紫丁香蘑分离试管种；所述的菌种分离纯化培养基的配方为：

⑵将紫丁香蘑分离试管种菌丝块接种到琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，培养条件为18~24℃避光，所述的琼脂培养基的配方：马铃薯30g，葡萄糖2g，K₂HPO₄0.5g，琼脂2g，蒸馏水100ml，pH7.0，培养温度20~25℃；2d后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于18℃下培养7d，获得紫丁香蘑纯化试管种即为获得的新的紫丁香蘑菌株，所述的培养基配方法：马铃薯30g，葡萄糖2g，K₂HPO₄0.5g，琼脂2g，蒸馏水100ml，pH7.0，培养温度20~25℃。

通过菌丝体产量、菌核生成能力、抗污染力等性状比对，挑选出菌丝体产量高、菌核生成能力强、抗污染的紫丁香蘑液体菌种专用菌株M-012^#。

1.2鉴定及其特征、命名、保藏

⑴子实体特征

M-012^#

分离用子实体特征为：菌盖直径3.5~10cm，半球形至平展，有时中部下凹，亮紫色或丁香紫色变至褐紫色，光滑，湿润，边缘内卷，无条纹。菌肉淡紫色，较厚。菌褶紫色，密，直生至稍延生，不等长，往生边缘呈小锯齿状。菌柄长4~9cm，粗0.5~2cm，圆柱形，同菌盖色，初期上部有絮状粉末，下部光滑或具纵条纹，内实，基部稍膨大。孢子印肉粉色。孢子无色，椭圆形，近光滑，具有小麻点，5.0~7.5μm×3.0~5.0μm。形态鉴定参考《中国大型真菌》(卯晓岚.郑州：河南科学技术出版社，2000.)。

⑵紫丁香蘑M-012^#菌株纯化试管种特征

接种后，在培养温度为22℃的条件下，15h就开始萌发，生长初期菌丝紧贴培养基，无色，有光泽，一般为较粗的不分支或分支较少的菌丝；第一天长速最快为1.1cm，最慢为0.3cm，而后随菌落的增大，有叉状或树枝状分支，一般较细，前两天无菌核与色素产生，第三天生长最快，平均长速为0.70cm/d，并开始有色素产生，第九天到第十天长满整个培养皿。

⑶ITS序列分析

采用供试野生紫丁香蘑子实体与实施例1获得的对应的紫丁香蘑纯化试管种菌丝，分别按CTAB法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与NCBI中的紫丁香蘑(L.nuda)序列Identities=606/606(100%)，Gaps=0/606(0%)，分析确定实施例1分离得到的紫丁香蘑纯化试管种即新的紫丁香蘑菌株为紫丁香蘑菌丝体。其具体方法如下：

改良CTAB法流程

ⅰ称取0.12g左右的干燥样品，加入液氮并迅速研磨至粉状后，迅速加入-CTAB500μl、β-巯基乙醇20μl，再加+CTAB（65℃预热）700μl，混匀后置65℃水浴振荡抽提60min；

ⅱ冷却，12000r离心10min，取上清液，加入700μl等体积的苯酚/氯仿（1:1），混匀后12000r离心10min；

ⅲ取上清，加入700μl氯仿/异戊醇，混匀，12000r离心10min；

ⅳ取上清，先加入80μl10%CTAB+4%NaCl溶液（65℃预热），再加入700μl氯仿/异戊醇，混匀，12000r离心10min；

ⅴ取上清，加入600μl异丙醇，-18℃下放置过夜；

ⅵ取出，12000r离心10min，弃上清液，沉淀依次用600μl76%乙醇、0.2mol/L乙酸钠及300μl70%乙醇进行洗涤；

ⅶ8000r离心5min，用滤纸滤干离心管，45℃下真空干燥5min，加入100μlTE缓冲液溶解，4℃冰箱保存。

DNA纯度及浓度检测

取2μlDNA样品，用TE缓冲液定容至50μl，用紫外分光光度计测定波长在230nm、260nm、280nm处的OD值，根据260nm处的OD值计算DNA浓度，根据260/280、260/230值确定DNA的纯度。

DNA分子量检测

取DNA样品5μl，上样缓冲液（含0.25%溴酚蓝，40%蔗糖）2μl，混匀，点入含0.75μl核酸染料的0.8%琼脂糖凝胶中，同时点入λ-Lambdamixmarker作为标记，用1×TAE缓冲液，在80V电压下电泳80min，最后在凝胶成像仪下观察并照相。

ITS-PCR扩增

ITS序列扩增引物

采用White设计的ITS通用引物ITS4/ITS5对供试材料的rDNAITS序列进行PCR扩增。其ITS引物如下：

ITS4:5'—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3'

ITS5:5'—GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG—3'

ITS-PCR扩增体系

ITS-PCR扩增体系为50μL，含rTaq(5U/μL)0.5μL，10×PCRBuffer6.25μL，Mgcl₂(25mmol/L)5.0μL，dNTP混合物(各2.5mmol/L)0.75μL，ITS4/ITS5引物(10μmol/L)各2.5μL，模板DNA(50ng/μL)2.5μL，ddH₂O补足至总体积50μL。

PCR扩增在GE9700PCR仪上进行。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s；52℃退火45s；72℃延伸1min；共40个循环；最后于72℃补平10min，终止温度为4℃。采用1.8%的琼脂糖凝胶电泳检测ITS-PCR扩增产物，用凝胶成像***拍照记录电泳谱带。

ITS扩增产物的序列测定

PCR扩增产物经电泳检测后，用胶回收试剂盒进行回收和纯化，样品送测序公司测序。

ITS序列分析

将扩增得到的各试验样品的ITS序列，采用ContigExpress软件进行正反链序列拼接，将拼接好的序列保存为FASTA格式，然后在NCBI网站上进行序列同源性比较。将拼接好的ITS序列采用ClustalX1.83软件和BioEdit软件进行序列比对。比对结果采用Mega3.0软件进行序列组成分析，采用非加权配对算数平均法（UPGMA）构建***树，并用Bootstrap1000次检验分子***树各分支的置信度。

⑷保藏

保藏：该紫丁香蘑（Lepistanuda）M-012^#的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2015年08月21日；保藏登记入册的编号CGMCCNO.11206。

1.3培养方法

（1）将紫丁香蘑M-012^#的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，于18~24℃下培养5~7d，获得试管菌种，所述的试管琼脂培养基的配方为改良PDA培养基，配方为马铃薯16g，葡萄糖1.6g，KH₂PO₄0.03g，琼脂1.6g，MgSO₄0.02g，蒸馏水100ml，pH7.0。

（2）将试管菌种接种到盛有200mL液体培养基的500mL三角瓶中，于20~26℃下摇床培养，转速为120~160r/min，培养时间5~7d，获得一级液体菌种，所述的液体培养基配方为：5~10g麸皮、0.5~1g黄豆粉、0.5~1g麦芽糖、1~2g可溶性淀粉，，蒸馏水100ml，pH7.0。

（3）将获得一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气比为1：0.8，搅拌转速为120r/min，接种量为5%（质量分数），罐压：0.04Mpa，pH为7.2，温度为22℃，通气培养72h，即获得所述的紫丁香蘑M-012^#液体菌种。

实施例2

菌株获得、鉴定、保藏方法与实施例1等同。

2.1培养方法

（1）将紫丁香蘑M-012^#的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，于18~24℃下培养5~7d，获得试管菌种，所述的试管琼脂培养基的配方为改良PDA培养基，配方为马铃薯16g，葡萄糖1.6g，KH₂PO₄0.03g，琼脂1.6g，MgSO₄0.02g，蒸馏水100ml，pH7.0。

（2）将试管菌种接种到盛有200mL液体培养基的500mL三角瓶中，于20℃下摇床培养，转速为130r/min，培养时间9d，获得一级液体菌种，所述的液体培养基配方为：7g麸皮、0.5g黄豆粉、0.5g麦芽糖、1g可溶性淀粉，蒸馏水100ml，pH7.0。

（3）将获得一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气比为1：0.8，搅拌转速为140r/min，接种量为7%（质量分数），罐压：0.04Mpa，pH为7.4，温度为22℃，通气培养84h，即获得所述的紫丁香蘑M-012^#液体菌种。

实施例3

菌株获得、鉴定、保藏方法与实施例1等同。

3.1培养方法

（1）将紫丁香蘑M-012^#的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，于18~24℃下培养5~7d，获得试管菌种，所述的试管琼脂培养基的配方为改良PDA培养基，配方为马铃薯16g，葡萄糖1.6g，KH₂PO₄0.03g，琼脂1.6g，MgSO₄0.02g，蒸馏水100ml，pH7.0。

（2）将试管菌种接种到盛有200mL液体培养基的500mL三角瓶中，于22℃下摇床培养，转速为140r/min，培养时间11d，获得一级液体菌种，所述的液体培养基配方为：5g麸皮、0.5g黄豆粉、0.5g麦芽糖、1g可溶性淀粉，蒸馏水100ml，pH7.0。

（3）将获得一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气比为1：0.8，搅拌转速为160r/min，接种量为9%（质量分数），罐压：0.04Mpa，pH为7.6，温度为22℃，通气培养96h，即获得所述的紫丁香蘑M-012#液体菌种。

实施例4——形状对比试验

使用M-012^#与原有3个菌株M-221^#、M1740^#、M-184^#，所有供试菌株品种均为紫丁香蘑(L.nuda)。

⑴试验方法

将4个紫丁香蘑菌株接种于18mm×18mm平板上，每个菌株重复10次，平板培养基为改良PDA：马铃薯16%，葡萄糖1.6%，KH₂PO₄0.03%，琼脂1.6%，MgSO₄0.02%，所述的百分数是质量分数。接种后放在20℃的培养箱中避光培养。

每8h进行观察记录。

⑵结果分析

紫丁香蘑各菌株在改良PDA培养基上的生长情况

注：+表示菌丝长势较差；++表示菌丝长势一般；+++表示菌丝长势较浓；++++表示菌丝长势浓密；+++++表示菌丝长势很浓密。

从上表可以看出，在相同的培养条件下，各个菌株的生长情况有所差异。从长势和满板时间来看，M-012^#菌株生长速度快，长势良好，且菌丝铺满平板的时间较其他三个菌株缩短了1~3d；从污染情况的来看，M-012^#菌株没有污染，抗污染率明显优于其他三个菌株。

SEQUENCELISTING

<110>中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所

<120>一种紫丁香蘑菌株及其液体菌种与制备方法

<130>2015

<160>2

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>ITS4

<400>1

tcctccgcttattgatatgc20

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>ITS5

<400>2

ggaagtaaaagtcgtaacaagg22

Claims (6)

1.一种紫丁香蘑菌株，其特征在于所述的紫丁香蘑菌株为紫丁香蘑M-012^#菌株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2015年8月21日，保藏编号：CGMCCNo.11206；所述紫丁香蘑M-012^#菌株属于真菌界、担子菌门、伞菌纲、伞菌目、口蘑科、香蘑属。

2.一种权利要求1所述的紫丁香蘑M-012^#的液体菌种，其特征在于是以所述紫丁香蘑菌株M-012^#经斜面培养、种子培养、发酵后制成的液体菌种。

3.一种权利要求2所述的紫丁香蘑M-012^#的液体菌种的制备方法，其特征在于包括斜面培养、种子培养、发酵步骤，具体包括：

A、斜面培养：将紫丁香蘑菌株M-012^#的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，在温度为18~24℃下培养5~7d，得试管菌种；

B、种子培养：将试管菌种接种到液体培养基中，在温度为20~26℃下摇床培养5~11d，得液体发酵种子；

C、发酵：将液体发酵种子按发酵培养基质量分数5~9%的量接种入发酵罐，在罐压0.03~0.05MPa，温度21~23℃，pH值7.0~8.0，搅拌速度130~150r/min，通气量70~90%下培养80~90h，得到紫丁香蘑M-012^#的液体菌种。

4.根据权利要求3所述的紫丁香蘑M-012^#的液体菌种的制备方法，其特征在于A步骤中所述的试管琼脂培养基为改良PDA培养基，其成分为：马铃薯15~17g，葡萄糖1.5~1.7g，KH₂PO₄0.02~0.04g，琼脂1.5~1.7g，MgSO₄0.01~0.03g，其余为水，pH值为7.0。

5.根据权利要求3所述的紫丁香蘑M-012^#的液体菌种的制备方法，其特征在于B步骤中所述的液体培养基的成分为：麸皮5~10g，黄豆粉0.5~1g，麦芽糖0.5~1g，可溶性淀粉1~2g，其余为水，pH值为7.0。

6.根据权利要求3所述的紫丁香蘑M-012^#的液体菌种的制备方法，其特征在于C步骤中所述的发酵培养基的成分为麸皮5~10g，黄豆粉0.5~1g，麦芽糖0.5~1g，可溶性淀粉1~2g，其余为水，pH值为7.0~8.0。