CN105319369A - 一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。所述试剂盒包括：包被氯霉素抗原的酶标板、氯霉素标准品、氯霉素抗体工作液、氯霉素酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩复溶液和浓缩洗涤液。检测氯霉素的酶联免疫试剂盒的原理是固相间接竞争酶联免疫反应，把提取的样品、抗体工作液加入对应的酶标板微孔中，孵育一段时间后，洗板加入酶标二抗工作液，孵育一段时间后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下显色剂呈现蓝色，加入终止液，颜色由蓝色变为黄色。显色的深浅与标准品或样品中氯霉素的含量成反比例关系。该方法可直接用于检测待测样品中氯霉素的残留量。

Description

一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术领域，特别是检测氯霉素的酶联免疫试剂盒。

背景技术

氯霉素(chloroamphenicol)是一种广谱抑菌抗生素，对革兰阳性、阴性细菌均有抑制作用。因其抗菌效果好而长期广泛应用于养殖业。其抑菌机理为通过可逆地与50S亚基结合,阻断转肽酰酶的作用，干扰带有氨基酸的胺基酰-tRNA终端与50S亚基结合，从而使新肽链的形成受阻，抑制蛋白质合成。但由于氯霉素还可与人体线粒体的70S结合,因而也可抑制人体线粒体的蛋白合成，对人体产生毒性，严重者能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血症和粒细胞性白血病等疾病，因此动物源食品中的氯霉素残留将对人类的健康构成巨大的潜在危害。世界粮农组织和卫生组织对食品中氯霉素的残留量的规定由原来的10μg/kg降为0.1μg/kg。我国农业部于2002年发布的《食品动物禁用兽药及其化合物清单》中亦正式将氯霉素及其盐酯等制剂列为禁用药物。但是，由于个别养殖户不顾国家禁令继续使用该抗生素，使得动物源食品的食用安全存在隐患。

目前，因检测结果准确可靠，氯霉素的测定多采用色谱法，但色谱法对仪器设备的要求较高，且样本前处理过程比较复杂，为了节省成本，快速高效的检测样本中的氯霉素残留，本发明建立了一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。

本发明一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒，内含酶标板、氯霉素标准品、氯霉素抗体工作液、氯霉素酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩复溶液和浓缩洗涤液。

本发明一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒的制备，包括酶标板的制备、氯霉素标准品的制备、氯霉素抗体工作液的制备、氯霉素酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩复溶液的制备和浓缩洗涤液的制备。

其进一步特征在于：所述的酶标板经由氯霉素抗原包被制备，具体步骤是将氯霉素半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到包被抗原，用0.05mol/LpH7.2的磷酸盐(PBS)缓冲液作为包被液，将氯霉素包被抗原稀释成1：60000比例，100μL/孔，37℃避光孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入经稀释的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，150μL/孔，37℃放置1.5h，甩掉封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。

氯霉素标准品浓度分别为0ng/mL、0.01ng/mL、0.03ng/mL、0.09ng/mL、0.81ng/mL、2.43ng/mL。

所述氯霉素抗体工作液是采用氯霉素人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：80000比例制备。

所述氯霉素酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：4000比例，所述底物液A为含有0.5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，所述终止液为2mol/L的硫酸，所述浓缩复溶液是10倍浓缩复溶液，为0.1mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，为含0.5%吐温-20，0.1mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理，该方法检测步骤如下：

取包被有氯霉素抗原的酶标板，按序分别加入标准品/样本、氯霉素酶标二抗工作液、氯霉素抗体工作液各50μL/孔到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min，将孔内液体甩干，用洗涤工作液充分洗涤4~5次，每次间隔10s，拍干后加入底物液A50μL/孔，底物液B50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15～20min，加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值（请在5min内读完数据），以的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中氯霉素的含量。

其中，所述待测样品用以下方法进行预处理：

(1)牛奶0.25ng/ml将牛奶离心去除上层脂肪，取2mL已去除脂肪的牛奶样本加入4mL乙酸乙酯，涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于50~60℃水浴氮气吹干，加入1mL正已烷溶解残留物，并加入1mL样品复溶液，充分振荡混匀后离心，去除上层正己烷相以及两相之间的泡沫或者胶状物，余下层水相待测；

(2)组织1.5ng/g准确称取2g均值后的样品于离心管中，先加入2mL去离子水充分混匀再加入4mL乙酸乙酯，涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于50~60℃水浴氮气吹干，加入1mL正已烷溶解残留物，并加入1mL样品复溶液，充分振荡混匀后离心，去除上层正己烷相以及两相之间的泡沫或者胶状物，余下层水相待测；

(3)血清0.5ng/ml取2mL血清加入4mL乙酸乙酯涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于50~60℃水浴氮气吹干，加入1mL样品复溶液混匀待测；

(4)蜂蜜(快检)1.5ng/g准确称取2g样品于离心管中，加人2mL去离子水，涡旋混合至试样完全溶解后加人4mL乙酸乙醋，涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于50~60℃水浴氮气吹干，加入1mL正已烷溶解残留物，并加入1mL样品复溶液，充分振荡混匀后离心，去除上层正己烷相以及两相之间的泡沫或者胶状物，余下层水相待测。

本发明一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法的测定原理：样品中的氯霉素与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标二抗，与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中氯霉素的含量。如果样品中的氯霉素含量少，显色深；反之，则显色浅。本发明的试剂盒检测方法操作简便，检测灵敏、准确、快速，适用于大批量样品的快速检测。

具体实施方式

氯霉素蛋白质偶联物采用琥珀酸酐法将氯霉素半抗原与载体蛋白BSA偶联制备。

氯霉素抗体的制备：

选用健康成年纯种BALA/C小鼠，取与蛋白质偶联制备的免疫抗原50μg与等量完全弗氏佐剂混合采用腹腔注射进行初次免疫，之后每隔3周用相同剂量免疫抗原加等量不完全弗氏佐剂采用腹腔注射进行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾静脉采血测定抗血清效价至一定滴度后，用相同剂量不加佐剂进行末次免疫，3天后取脾制备脾细胞悬浮液与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选出所需要的杂交瘤细胞系进行克隆化，选择处于对数生长期的杂交瘤细胞进行冻存，用于腹水制备，先腹腔注射0.5ml液体石蜡于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，接种细胞7-10天后可产生腹水，待腹水尽可能多时用注射器抽取腹水，反复收集数次，4000rpm离心15min，收集上清，采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水对单克隆抗体进行纯化，冷冻干燥得冻干粉后于-20℃保存备用。

制备包被有氯霉素包被抗原的酶标板：

包被抗原是将氯霉素半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到的，用0.05mol/LpH7.2的磷酸盐(PBS)缓冲液作为包被液，将氯霉素抗原稀释成1:60000比例，100μL/孔，37℃放置2h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150μL/孔，37℃放置1.5h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。

氯霉素标准品配制浓度分别为0ng/mL、0.01ng/mL、0.03ng/mL、0.09ng/mL、0.81ng/mL、2.43ng/mL。

氯霉素抗体工作液的制备：采用氯霉素人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：80000比例制备。

氯霉素酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：4000比例，底物液A为含有0.5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，终止液为2mol/L的硫酸，浓缩复溶液是10倍浓缩复溶液，为0.1mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，为含0.5%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

基于上述制备的试剂，本发明用于检测氯霉素的酶联免疫试剂盒包括如下材料：

(1)96孔酶标板×1块；

(2)标准液×6瓶：(1mL/瓶)0ppm、0.01ng/mL、0.03ng/mL、0.09ng/mL、0.81ng/mL、2.43ng/mL；

(3)抗体工作液7mL；

(4)酶标二抗工作液7mL；

(5)底物液A7mL；

(6)底物液B7mL；

(7)终止液7mL；

(8)10×浓缩复溶液40mL；

(9)10×浓缩洗涤液40mL；

本发明的试剂盒用于检测样品中氯霉素残留量时，通过以下步骤实施：样品预处理、用本发明试剂盒进行检测、分析结果。

(1)样品预处理

牛奶：将牛奶离心去除上层脂肪，取2mL已去除脂肪的牛奶样本加入4mL乙酸乙酯，涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于50~60℃水浴氮气吹干，加入1mL正已烷溶解残留物，并加入1mL样品复溶液，充分振荡混匀后离心，去除上层正己烷相以及两相之间的泡沫或者胶状物，余下层水相待测；

组织：准确称取2g均值后的样品于离心管中，先加入2mL去离子水充分混匀再加入4mL乙酸乙酯，涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于50~60℃水浴氮气吹干，加入1mL正已烷溶解残留物，并加入1mL样品复溶液，充分振荡混匀后离心，去除上层正己烷相以及两相之间的泡沫或者胶状物，余下层水相待测；

血清：取2mL血清加入4mL乙酸乙酯涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于50~60℃水浴氮气吹干，加入1mL样品复溶液混匀待测；

蜂蜜：准确称取2g样品于离心管中，加人2mL去离子水，涡旋混合至试样完全溶解后加人4mL乙酸乙醋，涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于50~60℃水浴氮气吹干，加入1mL正已烷溶解残留物，并加入1mL样品复溶液，充分振荡混匀后离心，去除上层正己烷相以及两相之间的泡沫或者胶状物，余下层水相待测。

(2)用本发明试剂盒检测待测样品中氯霉素残留量

预处理待测样品，取包被有氯霉素抗原的酶标板，按序分别加入标准品/样本、氯霉素抗体工作液各50μL/孔到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min，将孔内液体甩干，用洗涤工作液充分洗涤4~5次，每次间隔10s，拍干后加入氯霉素酶标二抗工作液100μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min，将孔内液体甩干，相同方法洗涤，拍干后加入底物液A50μL/孔，底物液B50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min，加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值（请在5min内读完数据），以的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中氯霉素的含量。

(3)分析结果

百分吸光度值的计算，标准品或样本的百分吸光度值等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值(%)＝B/B₀×100%

其中B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B₀—0ppb标准溶液的平均吸光度值。

以氯霉素的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，求出直线方程。将样本的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氯霉素的实际浓度。

Claims (8)

1.一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，包括酶标板、氯霉素标准品、氯霉素抗体工作液、氯霉素酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩复溶液和浓缩洗涤液。

2.一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，包括以下步骤：酶标板的制备、氯霉素标准品的制备、氯霉素抗体工作液的制备、氯霉素酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩复溶液的制备和浓缩洗涤液的制备。

3.根据权利要求2所述的一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述的酶标板制备方法为将氯霉素半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到氯霉素包被抗原，用0.05mol/LpH7.2的磷酸盐(PBS)缓冲液作为包被液，将包被抗原稀释成1：60000比例，100μL/孔，37℃孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入稀释后的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150μL/孔，37℃放置1.5h，弃去封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。

4.根据权利要求2所述的一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：氯霉素标准品的浓度分别为0ng/mL、0.01ng/mL、0.03ng/mL、0.09ng/mL、0.81ng/mL、2.43ng/mL。

5.根据权利要求2所述的一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述的氯霉素抗体工作液是采用氯霉素人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：80000比例制备。

6.根据权利要求2所述的一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述的氯霉素酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：4000比例，所述底物液A为含有0.5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，所述终止液为2mol/L的硫酸，所述浓缩复溶液是10倍浓缩复溶液，其为0.1mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其为含0.5%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

7.权利要求2所述的一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法，基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理，该方法的特征在于：预处理待测样品，取包被有氯霉素抗原的酶标板，按序分别加入标准品/样本、氯霉素抗体工作液各50μL/孔到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min，将孔内液体甩干，用洗涤工作液充分洗涤4~5次，每次间隔10s，拍干后加入氯霉素酶标二抗工作液100μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min，将孔内液体甩干，相同方法洗涤，拍干后加入底物液A50μL/孔，底物液B50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min，加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值（请在5min内读完数据），以的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中氯霉素的含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述待测样品用以下方法进行预处理：

牛奶：将牛奶离心去除上层脂肪，取2mL已去除脂肪的牛奶样本加入4mL乙酸乙酯，涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于50~60℃水浴氮气吹干，加入1mL正已烷溶解残留物，并加入1mL样品复溶液，充分振荡混匀后离心，去除上层正己烷相以及两相之间的泡沫或者胶状物，余下层水相待测；

组织：准确称取2g均值后的样品于离心管中，先加入2mL去离子水充分混匀再加入4mL乙酸乙酯，涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于50~60℃水浴氮气吹干，加入1mL正已烷溶解残留物，并加入1mL样品复溶液，充分振荡混匀后离心，去除上层正己烷相以及两相之间的泡沫或者胶状物，余下层水相待测；

血清：取2mL血清加入4mL乙酸乙酯涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于50~60℃水浴氮气吹干，加入1mL样品复溶液混匀待测；

蜂蜜：准确称取2g样品于离心管中，加人2mL去离子水，涡旋混合至试样完全溶解后加人4mL乙酸乙醋，涡旋混匀后离心，取上层有机相2mL于50~60℃水浴氮气吹干，加入1mL正已烷溶解残留物，并加入1mL样品复溶液，充分振荡混匀后离心，去除上层正己烷相以及两相之间的泡沫或者胶状物，余下层水相待测。