CN105316362A - 一种Dual-RMCE介导的TCR基因置换***及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种逆转录病毒基因转移联合双重组酶介导的盒式交换(Dual-RMCE)技术介导的T细胞受体(TCR)基因置换***及其方法,包括含有置换组件Loxp-EGFP-FRT逆转录病毒整合载体pMP71-LGFPF和含有TCR目标基因的置换载体pDRAV-3-LTCRF。该***能够在基因组单一位点中快速进行TCR基因置换,利用体内外细胞分化技术产生大量的肿瘤抗原特异性T细胞,从而表达某一肿瘤抗原特异性的TCR分子。该技术克服了传统TCR基因治疗的问题:逆转录病毒随机整合带来的副作用和外源性与内源性TCR组合形成的自身反应性TCR,将为临床抗肿瘤T细胞免疫治疗提供一个安全可靠的新技术。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,更具体地,涉及一种Dual-RMCE介导的TCR基因置换***及其方法。
背景技术
肿瘤免疫治疗是通过增强抗肿瘤免疫力来治疗恶性肿瘤的,近年来的临床试验取得了令人瞩目的成果。其中,用针对特异性靶标的T细胞受体(TCR)开展的抗肿瘤T细胞免疫治疗获得了长足进展,已开始进入临床试验,获得了客观疗效。早期T细胞治疗的临床试验,多采用抗肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating
lymphocytes,TIL)的方式,结果显示只在一些肿瘤如黑色素瘤里存在比较多量的TIL,在体外扩增回输到患者体内有明显的肿瘤消除作用。由于免疫耐受和肿瘤微环境抑制作用,在多数肿瘤组织中TIL的数量是有限的,而且多数是耗竭的T细胞(exhausted T cell)。
能引起抗肿瘤T细胞反应的抗原种类包括:(1)机体外源性抗原或体细胞基因突变产生的新抗原;(2)没有基因突变免疫耐受不完全的自身抗原,在肿瘤细胞异常表达。T细胞在胸腺发育成熟的过程中,会对***表达和呈递的自身抗原不产生免疫应答,这种机制称为中央耐受。在中央耐受机制的作用下,T细胞经历阴性筛选,即一些对自身抗原有高亲和力的T细胞克隆被清除,产生的正常T细胞库不会对自身组织产生免疫反应。而多数肿瘤相关抗原(TAA)本身就是未发生基因突变的在肿瘤细胞异常表达的自身抗原,由于免疫耐受机理,所以T细胞对这些TAA不能够发生有效的免疫反应。
为了克服免疫耐受,并得到高亲和力的抗肿瘤TCR基因,李亮平等在德国分子医学中心(Max Delbrueck Center for
Molecular Medicine,MDC),构建了人TCR-HLA人源化小鼠(ABabDII),利用该小鼠模型分离到了一系列高亲和力肿瘤抗原特异性的TCR基因。这些TCR基因可以用于抗肿瘤T细胞免疫治疗:通过TCR基因转移的方法改造原代T细胞,将普通的淋巴细胞转变为特异识别肿瘤抗原的T淋巴细胞,然后在体外大量扩增回输至病人体内,用于临床治疗。基因工程化的T细胞免疫治疗最大的好处在于,可以修饰和增强T淋巴细胞的功能短期内产生打量抗肿瘤T细胞,以达到治疗目的。用肿瘤抗原特异性TCR基因修饰的T细胞,不但在转移性恶性黑色瘤病人身上取得良好的效果,而且在滑膜肉瘤,B-细胞淋巴瘤(B-CLL),肾癌和结直肠癌等的过继免疫治疗也获得肿瘤消退。
TCR基因治疗存在着一些问题:目前抗肿瘤TCR基因通常用逆转录病毒载体转导至T细胞,由于病毒转导是多拷贝且随机整合的过程,有可能会灭活抑癌基因、活化原癌基因而诱发白血病,同时转导进去的TCR链可能会与内源性的TCR链随机组合可能形成自身反应性的TCR分子,从而诱发自身免疫性疾病,如:移植物抗宿主疾病(GVHD)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷,提供一种Dual-RMCE介导的单拷贝TCR基因置换***,避免逆转录病毒基因随机***带来副作用,同时结合胚胎干细胞(ES)或诱导多潜能干细胞(iPS)体内外分化技术,获得肿瘤抗原特异性的T细胞。
本发明的第二个目的是提供利用上述***进行TCR基因置换的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的:
一种Dual-RMCE介导的TCR基因置换***,包括含有置换组件Loxp-GFP-FRT逆转录病毒整合载体pMP71-LGFPF、含有目标TCR基因的置换载体pDRAV-3-LTCRF和Cre/Flp酶载体pDIRE-iCre/Flpo。
传统基因置换方式是基因敲入,主要是通过同源重组载体DNA转染,在细胞同源重组的机制作用下在基因原位进行基因置换。但同源重组的效率太低,大约10-7~10-4。Dual-RMCE是重组酶介导的基因组定点高效基因置换技术,利用目的基因片段两侧DNA交换组件(Loxp、FRT等)能够特异性地被重组酶(Cre、Flp酶等)识别,并导致交换组件间整个DNA片段的置换。交换组件在自然界只存在于噬菌体中,在原核生物和真核生物基因组中不存在。因此,在真核生物基因组中首先引入交换组件,进行RMCE介导的基因置换时,只在置换组件处发生基因交换。具体过程为:将重组酶编码的质粒载体和含有交换组件的感兴趣基因供体质粒,转入含有预先植入交换组件的细胞中;重组酶识别基因组和供体质粒中含有相同方向的特异性位点(如:Cre酶识别Loxp序列,Flp酶识别FRT序列等),使交换组件和被置换的基因DNA片段发生交换(图1)。
为了实现TCR基因交换,我们结合逆转录病毒转导TCR基因技术和Dual-RMCE技术。首先构建稳定的TCR逆转录病毒转导***。将该***转导靶细胞通过筛选即可获得含有置换组件的单细胞克隆,该单细胞克隆可直接用于TCR基因置换。
本发明还提供利用上述置换***进行基因置换的方法,包括以下步骤:
S1. 构建含有置换组件Loxp-GFP-FRT逆转录病毒整合载体pMP71-LGFPF;
S2. 构建含有目标TCR基因的置换载体pDRAV-3-LTCRF;
S3. 将逆转录病毒整合载体pMP71-LGFPF转导入哺乳动物细胞中,筛选并获得单克隆细胞,再将含有TCR基因置换载体和Cre/Flp重组酶载体pDIRE-iCre/Flpo共转入所述单克隆细胞中。
优选地,S1的操作为:用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所述引物从pSR-GFP/Neo扩增NotI-Loxp-EFGPneo-FRT-EcoRI片段,酶切后连接于pMP71载体上。
优选地,S2的操作为:用SEQ ID NO:3和SEQ ID
NO:4所述引物扩增MAGEA1-TCR-1367基因,酶切后连接于pDRAv-3上。
优选地,S3所述哺乳动物细胞选自人T细胞系、人胚胎干细胞系或多能干细胞系。
优选地,S3所述单克隆细胞的筛选过程为:将逆转录病毒载体pMP71-LGFPF导入293T细胞中进行病毒包装,待病毒滴度为5×107时,按照病毒数:细胞数为1:10的比例转导入哺乳动物细胞系(如T细胞)或胚胎干细胞系(如ES细胞)中,通过G418抗性和绿色荧光蛋白筛选获得单克隆。
本发明还提供利用上述置换方法获得的肿瘤抗原特异性T细胞。
本发明还提供上述TCR基因置换方法在肿瘤免疫治疗中的应用;所述TCR基因(指任何2A元件连接的TCR基因)可以是针对任何肿瘤抗原的TCR。
近年来的临床研究显示,TCR基因治疗存在一些困难。T细胞基因修饰需要比较多的原代T细胞,获取大量的肿瘤病人T细胞有一定难度;TCR基因修饰后的T细胞体外扩增能力有限。为了解决这一难题,一些研究人员开展干细胞TCR基因修饰的研究。造血干细胞(HSC)在体内外有比较大的增殖潜能,能够分化为T细胞。由HSC分化的淋巴祖细胞在分化成T细胞的过程中,存在TCR等位基因的排斥效应(Allelic Exclusion)。当用逆转录病毒技术将TCR基因转导进入HSC后,已重排的TCRαβ基因可以抑制未重排的内源性TCRαβ链基因位点的重排。实验表明外源性已重排的TCR基因几乎可以完全抑制内源性TCR基因重排,内源性TCR基因不能表达,结果大部分的T细胞只表达转入的外源性TCR,这样能够得到大量单一抗原特异性的T细胞,以排除内外源性TCR错配带来的副作用。
现有技术已经表明造血干细胞可以在实验室产生抗原特异性的T细胞。但干细胞基因修饰存在致癌的风险,由于该方法利用高滴度的逆转录病毒上清,转导至造血干细胞,导致TCR基因多拷贝且随机整合入基因组中,有可能导致***突变。之前干细胞基因治疗的临床试验研究表明,临床治疗需要大量输入逆转录病毒基因修饰的干细胞,大约需要108~109个HSC。这些细胞中,有极少数细胞转入的基因***会导致灭活抑癌基因或激活原癌基因,经过体内长期筛选,极少数突变的细胞大量增殖形成白血病。鉴于此,我们提出分离基因修饰后的多能干细胞单细胞克隆,再分化为T细胞可以明显降低***突变的风险。单/低拷贝的逆转录病毒随机整合结合挑出单细胞克隆进行扩增,得到的细胞转基因***灭活抑癌基因(***突变)的几率很低,大约为1/109,这样既能够满足单一表达肿瘤抗原特异性的TCR,又不会带来白血病和GVHD。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明率先提出采用TCR逆转录病毒表达技术结合重组酶介导的基因盒式交换技术(recombinase
mediated cassette exchange,RMCE),通过细胞单克隆的挑选,获得能够在基因组定点置换基因的T细胞系,以表达肿瘤抗原特异性TCR。在小鼠胚胎干细胞已成功建立这一***,未来将这一技术用于人的干细胞,利用定点TCR基因置换和干细胞分化成T细胞技术,产生表达单一TCR基因的定制人T细胞。后续的研究将此***结合人的胚胎干细胞(ES)或诱导性多潜能干细胞(iPS)无限增殖的特性,并且能定向分化为T细胞的潜能,在实验室生产出足够量的抗肿瘤T细胞,为肿瘤T细胞免疫治疗带来新思路。
附图说明
图1为逆转录病毒基因置换载体***的构建和实验流程图。
图2为单/低拷贝Loxp-EGFPneo-FRT的细胞单克隆获取检测图;对于ES细胞,我们用电转的方式,将Loxp-EGFPneo-FRT整合到基因组中;Jukat76未转导(Day0,图2A)、转导后48小时(Day2,图2B),16.113转导当天(Day0见图2C)、转导后48小时(Day2,图2D)。经过有限稀释或者流式分选得到的单个细胞克隆Jurkat76细胞(明场见图2E,荧光见图2F)和16.113细胞(明场见图2G,荧光见图2H)。ES细胞的低拷贝克隆(图2I和J)(放大倍数图A、B和图E-J为100×;图C、D为200×);流式细胞检测Jurkat76细胞转导前(图2K),和转导后的(图2L)。Jurkat76细胞转导后,在G418作用下,用记录从第0天到第12天GFP表达的情况,每两天检测一次(图2M)。
图3为TCR置换实验。
图4 为TCR基因置换实验的PCR验证。
图5为体内ES分化结果。
图6为小鼠畸胎瘤中T细胞的数量。
图7为流式细胞术检测NOD-Scid小鼠外周血中的T细胞。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换,均属于本发明的范围;若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明具体实施例方式中,逆转录病毒TCR表达载体pMP71-TCR1367含有从TCR-HLA人源化小鼠(ABabDII)分离得到的MAGE A1特异性TCR基因(Identification of human T-cell
receptors with optimal affinity to cancer antigens using antigen-negative
humanized mice. Nature Biotechnology, 2015)。编码Cre和Flpo重组酶的质粒pDIRE (#26745)以及RMCE***置换质粒pDRAV-3(#26748)购自Add gene;逆转录病毒表达和包装载体(pMP71EGFP、pLAF-10A1、pCDNA3.1-gag/pol)由德国柏林洪堡大学细胞生物学系Uckert Wolfgang教授馈赠。
LB培养基(胰蛋白胨、酵母粉)、琼脂粉、氯化钠、琼脂糖、PCR引物、MAGE A1(KVLEYVIKV)抗原多肽合成和质粒测序服务,购自上海生工生物工程技术服务有限公司。NotI、EcoRI、BamHI限制性内切酶,购自Fermentas。T4连接酶(货号:M0202L)购自New England Biolabs公司。去内毒素质粒提取试剂盒购自Qiagen公司。电转试剂盒,应用Lonza Amaxa® Cell Line Nucleofector® KitV(购自Lonza公司)。Primer Star Max(Takara公司)购自广州瑞真生物公司。G418(货号:11811023)和潮霉素(货号:10687-010)均购置Gibco(Life Technologies)。抗体:抗人CD3-PE(货号:347347)、抗人TCRαβ-FITC(货号:561674)、细胞内染色试剂盒(货号:555028)、抗小鼠CD3抗体蛋白(货号:562163)、抗小鼠CD28抗体蛋白(货号:553294)、抗小鼠CD3-FITC(561798)、抗小鼠CD4-APC(561091)、抗小鼠CD8a-PE(562315)和抗小鼠IFN-γ-APC(562018)购自BD Bioscience公司。HLA-A*02:01 MAGE A1四聚体-KVLEYVIKV-APC(购自MBL公司)。氯化钠、氯化钾等无机盐(广州化学试剂厂)、凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒,购自鼎国生物技术有限公司。细胞培养试剂:胎牛血清(货号:10099-141)、青链霉素(货号:15140-122)、DMEM(货号:C11995500BT)、RPMI1640(货号:C11875500BT)购自Life Technologies。细胞培养耗材(培养瓶、培养皿、离心管、移液管)购置Nunc公司(Thermo Scientific)。
小鼠胃肠肿瘤细胞系16.113从Thomas Blankenstein教授获得,TCR缺陷的人白血病细胞系Jurkat76细胞株从Uckert Wolfgang教授获得,用RPMI1640+10%FCS+ 100U/mL青链霉素培养基培养。小鼠胚胎干细胞ES14.1细胞系本实验室保存,培养在MEF细胞上面,培养基成分:DMEM+15%FCS+0.1mM NEAA+0.1mM丙酮酸钠+100U/mL青链霉素+0.1mM 2-巯基醇+1000U/mL LIF+0.2mM L-谷氨酰胺。OP9和OP9-DL1细胞(从Juan Carlos Zúniga-Pflücker教授)获得,由alpha-MEM+20%FCS培养基培养。MAGE A1抗原阳性的SK-MEL37和U266细胞从Thomas Blankenstein教授获得,分别培养在DMEM+10%FCS和RPMI1640+10%FCS的培养基中。病毒包装细胞293T细胞(CRL-3216,ATCC细胞库)则在DMEM+10%FCS+100U/mL青链霉素培养基中培养。T2细胞培养在10%FCS的RPMI1640培养基中。所有细胞均在湿度、37℃、5%CO2恒温细胞培养箱培养(Thermo Scientific)。所有细胞定期检测支原体污染情况。
本发明整个实验流程如图1所示,为了建立逆转录病毒TCR置换***,首先构建含有DNA重组Loxp和FRT组件的逆转录病毒整合载体pMP71-LGFPF和RMCE-TCR置换载体pDRAV-3-LTCRF(图1A和B)。逆转录病毒整合载体通过病毒转导方式在靶细胞基因组导入低或单拷贝的置换组件Loxp-GFP-FRT,然后将TCR置换载体pDRAV-3-LTCRF和Cre/Flp酶载体pDIRE-iCre/Flpo通过共转染法转入含有置换组件的细胞,利用Cre/Flp酶识别分别位于整合载体和置换载体上的Loxp和FRT位点,在Loxp和FRT位点间发生重组,将EGFP基因置换成TCR基因(图1C)。
所获数据用均数±标准差表示,显著性检验采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。数据与图像处理应用Microsoft Excel 2013和Prism 5.0软件。
实施例1 TCR-RMCE置换实验
一、载体的构建
1、逆转录病毒整合载体pMP71-LGFPF的构建,该载体含有Loxp-EGFPneo-FRT基因置换组件,构建方法为:用NotI-Loxp-F引物(5’-AATGCGGCCGCataacttcgtatagcatacattatacgaagttattcTACCGGGTAGGGGAGGCG-3’)和FRT-EcoRI-R引物(5’-TGAATTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCTCAGAAGAACTCGTCAAG-3’)。通过PCR从pSR-GFP/Neo质粒(VEC-PRT-0005/0006,购自Oligoengine公司)扩增2.0kb的NotI-Loxp-EFGPneo-FRT-EcoRI片段。使用Primer Star Max PCR反应体系,反应条件为:95℃,2min;95℃,15s;60℃,30s;72℃,2min,35个循环;72℃,5min。PCR反应后,用NotI和EcoRI酶切,并采用胶回收PCR产物,连接于pMP71载体上。
2、TCR置换载体pDRAV-3-LTCRF的构建:通过NotI-TCR1367引物(5’-ttacaggcggccgccacc-3’),TCR-BamHI引物(5’-cggatccGA ATTCAGCTGGACCACA-3’),扩增MAGEA1-TCR-1367基因, TCR-1367基因的大小为1.8kb,应用NotI和BamHI对PCR产物酶切后,用NEB T4连接酶16℃过夜连接,克隆至pDRAv-3置换载体上。
二、MLV逆转录病毒包装、浓缩、滴度测定和感染
病毒包装参考文献(Sommermeyer, D. & Uckert, W.,2010),简言之,是将293T细胞培养至6孔板中,待细胞铺满70~80%培养板时,应用Lipofactamine2000将兼嗜性小鼠白血病逆转录病毒(Ampho MLV)表达和包装的总共三个载体(2μg pMP71-LGFPF、2μg
PLAF-10A1-env、2μg
pCDNA3.1-gag/pol)转至293T细胞中进行病毒包装,48h后收集病毒上清,并用0.45μm的滤器(PALL公司)过滤。
病毒滴度测定:用6孔板培养293T细胞,每孔4×105个细胞,每孔加入2mL的培养液;准备5个0.6mL的Eppendorf管,每管加入45μL的完全培养液,取5μL病毒液,10倍稀释病毒液,最后从每管中取5μL加至培养板中,并加入终浓度为4μg/mL的硫酸鱼精蛋白(protamine sulfate,Sigma-Aldrich)。48h后,用胰酶消化下来,用流式细胞仪检测GFP表达情况。
病毒滴度TU/mL=[(初始细胞数)×(稀释倍数)×(GFP阳性率)]/(病毒原液体积,毫升)。
实验所用的病毒滴度为5×107UI/mL,取10 μL的病毒液加入到3mL含有5×106个Jurkat76细胞中。
转导靶细胞(16.113细胞、Jurkat76细胞)是按照病毒数:细胞数=1:10,加入病毒上清液和加入终浓度为4μg/mL的硫酸鱼精蛋白,混匀后32℃,800g条件下离心90min,转入T25培养瓶培养。而对于小鼠ES细胞(ES14.1细胞),用5mg用NdeI线性化的pMP71-LGFPF质粒载体与5×106个ES14.1细胞进行电击转化。
三、药物筛选及单细胞克隆的获取
转导Jurkat76细胞48h后,第二天开始加入400μg/mL G418筛选,10天后得到G418抗性和绿色荧光蛋白阳性的细胞,EGFP的表达接近100%阳性(图2 K)。药物筛选10天后,计数细胞,将细胞浓度调整到5个每毫升,向96孔板中加入100μL/孔稀释的细胞悬浮液(即0.5个细胞/孔)。每4天换一次液,让细胞自然生长30天,获得单克隆的细胞。
四、TCR-RMCE置换实验
选取步骤三获得的1×106单克隆细胞1200 rpm离心3min后,用预冷的PBS(pH=7.4)清洗细胞两遍,使用Lonza Amaxa® Cell
Line Nucleofector® Kit V电转试剂盒,迅速加入5 μg置换载体和15 μg编码Cre和Flpo重组酶的质粒pDIRE-iCre/Flp,混匀细胞和质粒后,加入2 mm电击杯(Lonza)中。选用Lonza
Amaxa真核细胞电转仪,程序为X1,电击一次,迅速转移至37℃预热的完全培养基中,转至培养箱培养。电极转化48h后,加入200 μg/mL的潮霉素筛选细胞。
置换载体pDRAV-3-LTCRF中,TCR基因前无启动子,随机整合不能表达TCR基因。如果发生了RMCE介导的基因置换,TCR基因置于逆转录病毒载体启动子的控制下,能够表达成TCR蛋白分子。表达的TCR分子与细胞内CD3分子结合形成复合物,然后被转运到细胞表面,从而能被特异性的四聚体染色(染色方法为本领域常规技术)。
多拷贝的置换底物可能会降低置换效率。为得到低/单拷贝逆转录病毒细胞系,以提高Dual-RMCE的效率,我们先将neo抗性和绿色荧光蛋白阳性的细胞经过有限稀释法得到单克隆细胞株,挑取7个16.113克隆(图2 E和F)和48个Jurkat76克隆(图2 G和H),进行TCR基因置换实验。利用电转法将pDRAV-3-LTCRF置换载体和pDIRE-iCre/Flp重组酶双质粒共转染到EGFP+G418R Jurkat76细胞克隆(图3A)内,用流式细胞术检测RMCE介导的TCR基因置换结果。Jurkat76单克隆在RMCE5天后经过潮霉素的筛选(图3B),可以见到约5%的细胞表达CD3分子,还未见筛选效果。筛选6~10天后,EGFP+的细胞逐步减少;潮霉素药物筛选10天后,Jurlat76细胞完全表达CD3,不表达EGFP(图3C),这表明存活的细胞EGFP基因完全被TCR基因置换。
为检测Jurkat76细胞株TCR的表达情况,用TCR抗体染色细胞,表达CD3的Jurkat76细胞完全表达目的TCR基因,图3D为同型对照。
为检测TCR分子的特异性,用MAGE A1四聚体(HLA-A*02:01-MAGE A1
Tetramer-KVLEYVIKV-APC)染色细胞,发现TCR阳性的细胞均为MAGE A1阳性的细胞(图3E)。
为了检测RMCE介导的基因置换特异性,我们设计了三组电转实验,分别为只加置换载体(pDRAV-3-LTCRF)组、只加重组酶(pDIRE-iCre/Flp)组和同时添加置换载体+重组酶组。通过多次验证,结果显示置换载体和重组酶质粒两者同时存在才能发生RMCE置换事件(图3F),置换效率约为5%。Jurkat76单克隆细胞置换实验用流式细胞术动态监测GFP消退情况,见图3G。
本研究利用逆转录病毒随机整合的机制,在挑取了48个Jurkat76细胞单克隆,以得到低/单拷贝交换组件。我们发现只有6个细胞克隆能进行有效进行Dual-RMCE。这个结果表明这些6个克隆与剩下的42个克隆可能存在着差异。本次实验中,Dual-RMCE的效率为4.5%,这与Anderson等 37 人在CHO细胞系中,同样应用pDIRE这一重组酶***的结果比较一致。在种基因置换效率的情况下,这6个能成功置换的克隆,可能是低/单拷贝的整合,而不是多拷贝的。
实施例2 应用PCR检测RMCE介导的基因置换
一、PCR过程如下:
收集1×10 6个细胞,加500μL消化液(NaCl 100 mM,Tris-HCl 50 mM,EDTA 25 mM,SDS 0.9%),加5μL,20 mg/mL蛋白酶K,55℃消化3h后,弹匀,加500μL酚氯仿,上下颠倒20次,13000rpm条件下离心10min;取上清入新管,1:1加入异丙醇(约450μL),颠倒,静置5min(可看到白色絮状DNA)。13000rpm 条件下离心15min,弃上清,并用枪将液体吸取干净。加500μL 75%乙醇,13000rpm条件下离心5min;倒上清,并用枪将液体吸取干净(注意别把白色沉淀倒掉或吸掉),重复酒精洗一遍。干燥,加100μL ddH2O(或TE),55度,20min溶解。
选取逆转录病毒的LTR区域,选取P1和P2以及TCR受体基因的P3作为鉴定引物,序列分别为P1:5’-GTTCCACCGAGATTTGGAGA-3’;P2:5’-CACACAGCGTAAAAGGAGCA-3’;P3:5’-CGGCCTTGCTAGGCTCG-3’(见图1)。选用Primer Star Max(Takara公司)作为PCR聚合酶。反应条件为:95℃,2min;95℃,15s;62℃,30s;72℃,1kb/min,35循环;72℃,5min。用1%的琼脂糖胶进行电泳分析。
二、PCR结果
应用PCR方法验证RMCE是否能在16.113和Jurkat76细胞中发生了DNA片段的置换。在不挑选克隆的情况下,直接加入G418对感染后的细胞株进行筛选,得到的是多克隆的GFP+G418R
Jurkat76细胞(图4A,泳道分布为:左边为GFP阳性,中间为Jurkat76,右边为16.113)。因为含有多拷贝的逆转录病毒基因整合,在基因置换时,可能只发生部分拷贝基因置换,因此,PCR检测得到置换和未置换的两条带(图4B,泳道分布为:左边为GFP阳性,中间为Jurkat76,右边为16.113)。为得到单拷贝置换组件的单克隆细胞系,经过有限稀释法分离得到48个单克隆细胞株,这48个Jurkat76克隆株中,有6个细胞株经过GFP检测,能完全发生了RMCE导致EGFP表达消失(结果未显示),选用P1和P2作为引物,Jukat76细胞在RMCE置换前基因组PCR(图4C)和置换后基因组PCR(图4D),从图4D看出这6株Jurkat76细胞把TCR-Hygro
B基因整合到基因组上,PCR检测发现只有一条4.2kb大小的置换DNA带,而7个16.113细胞克隆株中,只见到1个克隆有完全基因置换的事件发生(结果未显示)。在成功置换的克隆株中,应用P1和P3作为引物,如果发生了RMCE的会有0.7kb的条带出现,而且随机整合的TCR片段不能出现特异性条带,进一步证明了RMCE的准确性 (图4 E),有3个ES细胞克隆也成功发生了Dual-RMCE(图4F-H)。
实施例3畸胎瘤的形成和ES细胞的体内分化
小鼠TCR-ES细胞5×106,皮下注射于NOD-Scid免疫缺陷小鼠,并分为四组:(1)TCR-ES细胞组;(2)TCR-ES+OP9细胞组;(3)TCR-ES+OP9-DL1组;(4)TCR-ES+OP9+OP9-DL1组;(5)ES细胞组。所有组别均在注射时,同时注射SCF(200 ng)和 TPO(200 ng)(Pepro-Tech),在分化3周后,在畸胎瘤周围皮下注射hFLT3(200ng)和IL-7(200ng)。7周后,处死小鼠检测畸胎瘤、脾脏、骨髓、外周血的细胞表型,同时对T细胞进行四聚体染色和细胞因子分泌情况检测。
从畸胎瘤收集105个细胞(从TCR-ES细胞分化而来的),加入已载KVLEYVIKV-MAGEA1多肽的105个T2细胞(10-5M),选用anti-CD3(0.2 mg/L)+anti-CD28(1
mg/L)作为阳性对照,刺激16小时后,加入10 mg/L
Brefeldin A(BFA)再刺激6h。收集细胞进行细胞内染色。首先用磷酸盐缓冲液(PBS,PH7.4)洗涤细胞2次,100μL PBS缓冲液重悬细胞,之后加入表面染色抗体(抗小CD3-FITC),置4℃避光染色25min,PBS缓冲液洗涤1次,吸弃上清,100μL固定/通透缓冲液(细胞内染色试剂盒自带)重悬细胞,室温避光反应20min,通透/洗涤液洗涤细胞1次。加入100μL加强通透液4℃避光反应20min,通透/洗涤液洗涤细胞1次,之后再加入IFN-γ的染色抗体。
结果显示:7周后,能在畸胎瘤中见到MAGE A1特异性的T细胞,其中以CD4T细胞多见,能够对MAGE A1多肽产生细胞因子IFN-γ。在8周后,各组ES14.1分化成的T细胞释放到NOD-Scid小鼠外周血中,检测外周血中各组的T细胞(在畸胎瘤中的T细胞进行四聚体染色),我们发现这些T细胞大部分为MAGE-A1肿瘤抗原特异性的T细胞,ES14.1在有OP9和OP9-DL1细胞同时存在的时候分化出来的T细胞约为8%(图6)。同时,从注射ES细胞第21天开始每周用流式细胞术检测NOD-Scid小鼠外周血中的T细胞,结果显示,mES在OP-9细胞和OP9-DL1细胞的辅助下,能够大量分化为T细胞和B细胞等免疫细胞,另外,发现并不是所有的TCR-ES细胞在转入有TCR基因时,就能够分化为MAGE A1特异性的T细胞,但是未转入有TCR基因的ES一定不能够分化为MAGE A1特异性的T细胞(图7)。
综上所述,逆转病毒结合Dual-RMCE技术,在Jurkat76实验模型中能够快速表达抗原特异性的TCR分子,结合小鼠体内分化技术,我们获得了大量MAGE A1肿瘤抗原特异性的T细胞。未来这一***可用于修饰人ES/iPS细胞系,产生TCR-ES/iPS细胞,利用体外或者体内分化技术产生大量的肿瘤抗原特异性的T细胞,克服了传统的体外活化+细胞因子扩增肿瘤浸润T细胞治疗细胞数量少的问题;同时降低了逆转录病毒随机整合带来的副作用。这个***可实现逆转录病毒TCR基因治疗的安全应用,为临床抗肿瘤T细胞免疫治疗提供一个可靠的新技术。
SEQUENCE LISTING
<110>
暨南大学
<120>
一种Dual-RMCE介导的TCR基因置换***及其方法
<130>
<160>
4
<170>
PatentIn version 3.3
<210>
1
<211>
65
<212>
DNA
<213>
Not I-Loxp-F
<400>
1
aatgcggccg
cataacttcg tatagcatac attatacgaa gttattctac cgggtagggg
60
aggcg
65
<210>
2
<211>
59
<212>
DNA
<213>
FRT-EcoRI-R
<400>
2
tgaattcgaa
gttcctatac tttctagaga ataggaactt ctcagaagaa
ctcgtcaag 59
<210>
3
<211>
18
<212>
DNA
<213>
NotI-TCR1367
<400>
3
ttacaggcgg
ccgccacc
18
<210>
4
<211>
25
<212>
DNA
<213>
TCR-BamHI
<400>
4
cggatccgaa
ttcagctgga
ccaca
25
Claims (6)
1.一种Dual-RMCE介导的TCR基因置换***,其特征在于,包括含有置换组件Loxp-GFP-FRT逆转录病毒整合载体pMP71-LGFPF、含有目标TCR基因的置换载体pDRAV-3-LTCRF和Cre/Flp酶载体pDIRE-iCre/Flpo。
2.利用权利要求1所述基因置换***进行基因置换方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1. 构建含有置换组件Loxp-GFP-FRT逆转录病毒整合载体pMP71-LGFPF;
S2. 构建含有目标TCR基因的置换载体pDRAV-3-LTCRF;
S3. 将逆转录病毒整合载体pMP71-LGFPF转导入哺乳动物细胞中,筛选并获得单克隆细胞,再将含有TCR基因置换载体和Cre/Flp重组酶载体pDIRE-iCre/Flpo共转入所述单克隆细胞中。
3.根据权利要求2所述的TCR基因置换方法,其特征在于,S1的操作为:用SEQ ID
NO:1和SEQ ID NO:2所述引物从pSR-GFP/Neo扩增NotI-Loxp-EFGPneo-FRT-EcoRI片段,酶切后连接于pMP71载体上。
4.根据权利要求2所述的TCR基因置换方法,其特征在于,S2的操作为:用SEQ ID
NO:3和SEQ ID NO:4所述引物扩增MAGE A1-TCR-1367基因,酶切后连接于pDRAv-3上。
5.根据权利要求2所述的TCR基因置换方法,其特征在于,S3所述哺乳动物细胞选自人T细胞系、人胚胎干细胞系或多能干细胞系。
6.利用权利要求2至5任一项所述置换方法获得的肿瘤抗原特异性T细胞。
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