CN105316312B - 一种提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法及其应用，所述方法为：（1）将类芽孢杆菌出发菌株接种到普通液体培养基中活化；（2）稀释成一定浓度菌悬液；（3）制成菌膜后进行诱变；（4）涂布于普通固体培养基中培养；（5）初步筛选；（6）将初筛菌株接种于普通液体培养基中培养得到产糖量较高的菌株；（7）确定步骤（6）得到的为产糖量较高的类芽孢杆菌菌株；（8）确定产糖量较高菌株的产糖量遗传稳定性。所述选育方法应用于粉煤灰废水、水体中微藻的沉降处理。本发明方法利用等离子体诱变技术对高产微生物絮凝剂的类芽孢杆菌进行诱变育种，有效提高了类芽孢杆菌的絮凝效率和絮凝剂产量，应用于粉煤灰废水、水体中微藻的沉降处理。
Description
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法及其应用。
背景技术
微生物絮凝剂是利用生物技术，从微生物体或其分泌物中富集、筛选、纯化而获得的一种安全、易生物降解的新型水处理絮凝剂，微生物絮凝剂作为一种天然的絮凝剂，它在确保应用安全性的前提下还具有光谱絮凝活性，这为其在与人体健康密切关系的给水排水处理、食品加工和发酵工业等方而提供了广阔的应用前景。
随着工业废水的大量排放，水体污染日益加重，水环境问题引起了广泛的关注。絮凝沉淀是目前国内外普遍采用的一种水处理方法。而絮凝剂是沉降水处理过程的核心，在其中起着至关重要的作用。由于微生物絮凝剂具有絮凝范围广泛、高效、无毒、无二次污染等优点，使得近年来对微生物絮凝剂的研究取得了很大的进步。但是于此同时，仍有缺乏理论指导、制备成本高、难于大规模生产等问题迫切需要解决。
发明内容
针对现有技术存在的一些问题，本发明提供一种提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法及其应用，所述选育方法是利用等离子体诱变技术对高产微生物絮凝剂的类芽孢杆菌进行诱变育种，提高了其絮凝效率和絮凝剂产量。本发明采用的类芽孢杆菌型号为A9，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，建议分类命名为：类芽孢杆菌Paenibacillus sp.，保藏编号为：CGMCC2040，保藏日期为：2007年5月11日，地址：中国.北京.朝阳区北辰西路1号院3号；本发明的技术方案如下：
一种提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法，按照以下工艺步骤进行：
（1）将类芽孢杆菌出发菌株接种到普通液体培养基中，活化20~32h；
（2）将活化的菌液离心，弃去上清液，沉淀菌体用无菌生理盐水稀释成浓度为100000~150000cfu/ml的菌悬液；
（3）取步骤（2）的菌悬液15~20uL制成菌膜，利用多功能等离子体诱变***对其进行诱变；
（4）取诱变后的菌体加入无菌生理盐水稀释至1mL，取0.1mL均匀涂布于普通固体培养基中，培养36~48h；
（5）根据菌落形态大小，初步筛选出等离子体诱变平板上与出发菌株形态相似、菌落半径较大的初筛菌株；
（6）将类芽孢杆菌初筛菌株接种于普通液体培养基中，培养20~32h，得到产糖量较高的类芽孢杆菌菌株；
（7）将步骤（6）的菌悬液以1%的接种量转接到发酵液体培养基中，培养24~72h；离心，分离，保留上清液，利用醇沉-冷冻干燥法得到的粗多糖即为絮凝剂，称量粗多糖重量，确定步骤（6）得到的为产糖量较高的类芽孢杆菌菌株；
（8）将步骤（6）的产糖量较高的类芽孢杆菌菌株接种于普通液体培养基中，重复步骤（6）和（7）的过程5~8次，确定其产糖量的遗传稳定性。
所述类芽孢杆菌出发菌株由从果树根系土壤分离筛选纯化获得。
所述普通液体培养基的化学成分及浓度为：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，蒸馏水1L/L。
所述普通固体培养基的化学成分及浓度为：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，琼脂15.0~20.0 g/L，蒸馏水1L/L。
所述发酵培养基的化学成分及浓度为：葡萄糖20.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，磷酸氢二钾5.0g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钠0.1g/L，脲0.5g/L，酵母膏0.5g/L，蒸馏水1L/L。
所述活化过程的条件为：温度25~30℃，pH6.5~7.5，摇床转速130~160r/min。
所述培养过程的条件为：温度25~30℃，pH6.5~7.5。
所述离心过程的条件为：转速8000~10000 r/min，时间10~30min。
所述诱变过程的条件为：电源功率为300W，工作气流为12L/min，等离子体发射源与样品之间的高度为5mm，工作气体为氮气，照射时间为105~110s。
所述发酵过程的条件为：温度25~30℃，pH 7~8，摇床转速130~160r/min。
所述一种提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法应用于粉煤灰废水、水体中微藻的沉降处理；所述应用较佳地为对浓度为1~10 g/L、粉煤灰粒径大小为0.050~0.150mm的粉煤灰废水、富营养化水体和高效藻类塘中微藻的沉降处理，絮凝率达到85%以上；所述应用最佳地为对水中纯培养的念珠藻或颤藻的沉降处理，絮凝率达到96%以上。
本发明的有益效果如下：
本发明方法利用等离子体诱变技术对高产微生物絮凝剂的类芽孢杆菌进行诱变育种，有效提高了类芽孢杆菌的絮凝效率和絮凝剂产量，不但能为微生物絮凝剂的理论研究提供参考，拓宽对生物絮凝剂组成及合成、纯化等方面的认识领域，还能为微生物絮凝剂的产业化提供技术保证。此外，将本发明方法获得的产糖量较高的类芽孢杆菌菌株应用于粉煤灰废水、水体中微藻的沉降处理，对浓度为1~10 g/L，粉煤灰粒径大小为0.050~0.150mm的粉煤灰废水、富营养化水体和高效藻类塘中微藻的沉降处理效果较佳，絮凝率达到85%以上；对水中纯培养的念珠藻或颤藻的沉降处理最佳，絮凝率达到96%以上。
具体实施方式
本发明实施采用的类芽孢杆菌型号为A9，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，建议分类命名为：类芽孢杆菌Paenibacillus sp.，保藏编号为：CGMCC2040，保藏日期为：2007年5月11日，地址：中国.北京.朝阳区北辰西路1号院3号。该类芽孢杆菌由从果树根系土壤分离筛选纯化获得。
本发明实施诱变过程采用的多功能等离子体诱变器型号为：MPMS-MANDELA。
本发明实施稀释过程采用的震荡器型号为：K133。
本发明实施离心过程采用的高速台式离心机型号为：LG16-A。
本发明实施醇沉-冷冻干燥法采用的真空干燥箱型号为：D2F-6050。
本发明实施采用的高效藻类塘水来自沈阳市多家污水处理厂经二级处理后的生活污水。
本发明实施采用的富营养化水来自沈阳市不同区域的景观水体。
实施例1
提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法及其应用于浓度为4g/L，粉煤灰粒径为0.050~0.074mm的粉煤灰废水的沉降处理，按照以下工艺步骤进行：
（1）将类芽孢杆菌出发菌株接种到普通液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为7.0，摇床转速为140r/min的条件下活化20h；
（2）将活化的菌液在转速为8000r/min的条件下离心15min，弃去上清液，沉淀菌体用无菌生理盐水稀释成浓度为100000cfu/ml的菌悬液；
（3）取步骤（2）的菌悬液15uL制成菌膜，利用多功能等离子体诱变***对其进行诱变，诱变条件为：电源功率为300W，工作气流为12L/min，等离子体发射源与样品之间的高度为5mm，工作气体为氮气，照射时间为108s；
（4）取诱变后的菌体加入无菌生理盐水稀释至1mL，取0.1mL均匀涂布于普通固体培养基中，在温度为25~30℃，pH为7.0的条件下培养48h；
（5）根据菌落形态大小，初步筛选出等离子体诱变平板上与出发菌株形态相似、菌落半径较大的初筛菌株；
（6）将类芽孢杆菌初筛菌株接种于普通液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为7.0的条件下培养24h，得到产糖量较高的类芽孢杆菌菌株；
（7）将步骤（6）的菌悬液以1%的接种量转接到发酵液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为7.0的条件下培养48h；在转速为8000r/min的条件下离心15min，分离，保留上清液，利用醇沉-冷冻干燥法得到的粗多糖即为絮凝剂，称量产糖量较高菌株的粗多糖重量为1.79mg/mL，比出发菌株高出14.7%；
（8）将步骤（6）的产糖量较高的菌株接种于普通液体培养基中，重复步骤（6）和（7）的过程5次，最终所得菌株的粗多糖产量为1.79±0.02mg/mL，遗传稳定性较好；
（9）将步骤（6）的产糖量较高的菌株用于4g/L 粉煤灰废水的沉降处理，絮凝率为86.19%，效果较佳。
实施例2
提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法及其应用于浓度为10g/L，粉煤灰粒径为0.074~0.150mm的粉煤灰废水的沉降处理，按照以下工艺步骤进行：
（1）将类芽孢杆菌出发菌株接种到普通液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为6.55，摇床转速为130r/min的条件下活化30h；
（2）将活化的菌液在转速为9000r/min的条件下离心10min，弃去上清液，沉淀菌体用无菌生理盐水稀释成浓度为100000cfu/ml的菌悬液；
（3）取步骤（2）的菌悬液20uL制成菌膜，利用多功能等离子体诱变***对其进行诱变，诱变条件为：电源功率为300W，工作气流为12L/min，等离子体发射源与样品之间的高度为5mm，工作气体为氮气，照射时间为108s；
（4）取诱变后的菌体加入无菌生理盐水稀释至1mL，取0.1mL均匀涂布于普通固体培养基中，在温度为25~30℃，pH为6.5的条件下培养48h；
（5）根据菌落形态大小，初步筛选出等离子体诱变平板上与出发菌株形态相似、菌落半径较大的初筛菌株；
（6）将类芽孢杆菌初筛菌株接种于普通液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为6.5的条件下培养24h，得到产糖量较高的类芽孢杆菌菌株；
（7）将步骤（6）的菌悬液以1%的接种量转接到发酵液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为6.5的条件下培养32h；在转速为8000r/min的条件下离心15min，分离，保留上清液，利用醇沉-冷冻干燥法得到的粗多糖即为絮凝剂，称量产糖量较高菌株的粗多糖重量为1.79mg/mL，比出发菌株高出14.7%；
（8）将步骤（6）的产糖量较高的菌株接种于普通液体培养基中，重复步骤（6）和（7）的过程6次，最终所得菌株的粗多糖产量为1.79±0.02mg/mL，遗传稳定性较好；
（9）将步骤（6）的产糖量较高的菌株用于4g/L 粉煤灰废水的沉降处理，絮凝率为85.31%，效果较佳。
实施例3
提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法及其应用于水中纯培养念珠藻的沉降处理，按照以下工艺步骤进行：
（1）将类芽孢杆菌出发菌株接种到普通液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为7.5，摇床转速为160r/min的条件下活化24h；
（2）将活化的菌液在转速为8000r/min的条件下离心15min，弃去上清液，沉淀菌体用无菌生理盐水稀释成浓度为100000cfu/ml的菌悬液；
（3）取步骤（2）的菌悬液15uL制成菌膜，利用多功能等离子体诱变***对其进行诱变，诱变条件为：电源功率为300W，工作气流为12L/min，等离子体发射源与样品之间的高度为5mm，工作气体为氮气，照射时间为108s；
（4）取诱变后的菌体加入无菌生理盐水稀释至1mL，取0.1mL均匀涂布于普通固体培养基中，在温度为25~30℃，pH为7.5的条件下培养45h；
（5）根据菌落形态大小，初步筛选出等离子体诱变平板上与出发菌株形态相似、菌落半径较大的初筛菌株；
（6）将类芽孢杆菌初筛菌株接种于普通液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为7.5的条件下培养24h，得到产糖量较高的类芽孢杆菌菌株；
（7）将步骤（6）的菌悬液以1%的接种量转接到发酵液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为7.5的条件下培养54h；在转速为9000r/min的条件下离心10min，分离，保留上清液，利用醇沉-冷冻干燥法得到的粗多糖即为絮凝剂，称量粗多糖重量产量为1.79mg/mL，比出发菌株高出14.7%；
（8）将步骤（6）的产糖量较高的菌株接种于普通液体培养基中，重复步骤（6）和（7）的过程6次，最终所得菌株的粗多糖产量为1.79±0.02mg/mL，遗传稳定性较好；
（9）将步骤（6）的产糖量较高的菌株用于水中纯培养念珠藻的沉降处理，絮凝率为96.98%，效果较佳。
实施例4
提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法及其应用于水中纯培养颤藻的沉降处理，按照以下工艺步骤进行：
（1）将类芽孢杆菌出发菌株接种到普通液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为7.0，摇床转速为150r/min的条件下活化24h；
（2）将活化的菌液在转速为10000r/min的条件下离心10min，弃去上清液，沉淀菌体用无菌生理盐水稀释成浓度为100000cfu/ml的菌悬液；
（3）取步骤（2）的菌悬液15uL制成菌膜，利用多功能等离子体诱变***对其进行诱变，诱变条件为：电源功率为300W，工作气流为12L/min，等离子体发射源与样品之间的高度为5mm，工作气体为氮气，照射时间为108s；
（4）取诱变后的菌体加入无菌生理盐水稀释至1mL，取0.1mL均匀涂布于普通固体培养基中，在温度为25~30℃，pH为7.0的条件下培养36h；
（5）根据菌落形态大小，初步筛选出等离子体诱变平板上与出发菌株形态相似、菌落半径较大的初筛菌株；
（6）将类芽孢杆菌初筛菌株接种于普通液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为7.0的条件下培养24h，得到产糖量较高的类芽孢杆菌菌株；
（7）将步骤（6）的菌悬液以1%的接种量转接到发酵液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为7.0的条件下培养72h；在转速为8000r/min的条件下离心15min，分离，保留上清液，利用醇沉-冷冻干燥法得到的粗多糖即为絮凝剂，称量粗多糖重量产量为1.79mg/mL，比出发菌株高出14.7%；
（8）将步骤（6）的产糖量较高的菌株接种于普通液体培养基中，重复步骤（6）和（7）的过程8次，最终所得菌株的粗多糖产量为1.79±0.02mg/mL，遗传稳定性较好；
（9）将步骤（6）的产糖量较高的菌株用于水中纯培养颤藻的沉降处理，絮凝率为98.23%，效果较佳。
实施例5
提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法及其应用于高效藻类塘水中微藻的沉降处理，按照以下工艺步骤进行：
（1）将类芽孢杆菌出发菌株接种到普通液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为7.5，摇床转速为130r/min的条件下活化32h；
（2）将活化的菌液在转速为9000r/min的条件下离心15min，弃去上清液，沉淀菌体用无菌生理盐水稀释成浓度为150000cfu/ml的菌悬液；
（3）取步骤（2）的菌悬液15uL制成菌膜，利用多功能等离子体诱变***对其进行诱变，诱变条件为：电源功率为300W，工作气流为12L/min，等离子体发射源与样品之间的高度为5mm，工作气体为氮气，照射时间为110s；
（4）取诱变后的菌体加入无菌生理盐水稀释至1mL，取0.1mL均匀涂布于普通固体培养基中，在温度为25~30℃，pH为7.5的条件下培养40h；
（5）根据菌落形态大小，初步筛选出等离子体诱变平板上与出发菌株形态相似、菌落半径较大的初筛菌株；
（6）将类芽孢杆菌初筛菌株接种于普通液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为7.5的条件下培养26h，得到产糖量较高的类芽孢杆菌菌株；
（7）将步骤（6）的菌悬液以1%的接种量转接到发酵液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为7.5的条件下培养50h；在转速为8000r/min的条件下离心10min，分离，保留上清液，利用醇沉-冷冻干燥法得到的粗多糖即为絮凝剂，称量粗多糖重量产量为1.79mg/mL，比出发菌株高出14.7%；
（8）将步骤（6）的产糖量较高的菌株接种于普通液体培养基中，重复步骤（6）和（7）的过程8次，最终所得菌株的粗多糖产量为1.79±0.02mg/mL，遗传稳定性较好；
（9）将步骤（6）的产糖量较高的菌株用于高效藻类塘中微藻的沉降处理，絮凝率为88.05%，效果较佳。
所述步骤（9）中高效藻类塘水中微藻包括小球藻属、栅藻属、衣藻属、裸藻属、针杆藻属、脆杆藻属、颤藻属、念珠藻属等藻类。
实施例6
提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法及其应用于富营养化水中微藻的沉降处理，按照以下工艺步骤进行：
（1）将类芽孢杆菌出发菌株接种到普通液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为6.5，摇床转速为130r/min的条件下活化30h；
（2）将活化的菌液在转速为9000r/min的条件下离心10min，弃去上清液，沉淀菌体用无菌生理盐水稀释成浓度为150000cfu/ml的菌悬液；
（3）取步骤（2）的菌悬液15uL制成菌膜，利用多功能等离子体诱变***对其进行诱变，诱变条件为：电源功率为300W，工作气流为12L/min，等离子体发射源与样品之间的高度为5mm，工作气体为氮气，照射时间为110s；
（4）取诱变后的菌体加入无菌生理盐水稀释至1mL，取0.1mL均匀涂布于普通固体培养基中，在温度为25~30℃，pH为6.5的条件下培养42h；
（5）根据菌落形态大小，初步筛选出等离子体诱变平板上与出发菌株形态相似、菌落半径较大的初筛菌株；
（6）将类芽孢杆菌初筛菌株接种于普通液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为6.5的条件下培养28h，得到产糖量较高的类芽孢杆菌菌株；
（7）将步骤（6）的菌悬液以1%的接种量转接到发酵液体培养基中，在温度为25~30℃，pH为6.5的条件下培养52h；在转速为8000r/min的条件下离心15min，分离，保留上清液，利用醇沉-冷冻干燥法得到的粗多糖即为絮凝剂，称量粗多糖重量产量为1.79mg/mL，比出发菌株高出14.7%；
（8）将步骤（6）的产糖量较高的菌株接种于普通液体培养基中，重复步骤（6）和（7）的过程8次，最终所得菌株的粗多糖产量为1.79±0.02mg/mL，遗传稳定性较好；
（9）将步骤（6）的产糖量较高的菌株用于富营养化水中微藻的沉降处理，絮凝率为86.23%，效果较佳。
所述步骤（9）中富营养化水中微藻包括小球藻属、栅藻属、衣藻属、裸藻属、针杆藻属、脆杆藻属、颤藻属、念珠藻属等藻类。
Claims (7)
1.一种提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法，其特征在于按照以下工艺步骤进行：
(1)将类芽孢杆菌出发菌株接种到普通液体培养基中，活化20～32h；
(2)将活化的菌液离心，弃去上清液，沉淀菌体用无菌生理盐水稀释成浓度为100000～150000cfu/ml的菌悬液；
(3)取步骤(2)的菌悬液15～20uL制成菌膜，利用多功能等离子体诱变***对其进行诱变；所述诱变过程的条件为：电源功率为300W，工作气流为12L/min，等离子体发射源与样品之间的高度为5mm，工作气体为氮气，照射时间为105～110s；
(4)取诱变后的菌体加入无菌生理盐水稀释至1mL，取0.1mL均匀涂布于普通固体培养基中，培养36～48h；
(5)根据菌落形态大小，初步筛选出等离子体诱变平板上与出发菌株形态相似、菌落半径较大的初筛菌株；
(6)将类芽孢杆菌初筛菌株接种于普通液体培养基中，培养20～32h，得到产糖量较高的类芽孢杆菌菌株；
(7)将步骤(6)的菌悬液以1％的接种量转接到发酵液体培养基中，于温度25～30℃，pH7～8，摇床转速130～160r/min的条件下培养24～72h；离心，分离，保留上清液，利用醇沉-冷冻干燥法得到的粗多糖即为絮凝剂，称量粗多糖重量，确定步骤(6)得到的为产糖量较高的类芽孢杆菌菌株；所述发酵培养基的化学成分及浓度为：葡萄糖20.0g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，磷酸氢二钾5.0g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钠0.1g/L，脲0.5g/L，酵母膏0.5g/L，蒸馏水1L/L；
(8)将步骤(6)的产糖量较高的类芽孢杆菌菌株接种于普通液体培养基中，重复步骤(6)和(7)的过程5～8次，确定其产糖量的遗传稳定性。
2.根据权利要求1所述的一种提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法，其特征在于所述普通液体培养基的化学成分及浓度为：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，氯化钠5.0g/L，蒸馏水1L/L。
3.根据权利要求1所述的一种提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法，其特征在于所述普通固体培养基的化学成分及浓度为：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0～20.0g/L，蒸馏水1L/L。
4.根据权利要求1所述的一种提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法，其特征在于所述活化过程的条件为：温度25～30℃，pH6.5～7.5，摇床转速130～160r/min。
5.根据权利要求1所述的一种提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法，其特征在于所述培养过程的条件为：温度25～30℃，pH6.5～7.5。
6.根据权利要求1所述的一种提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法，其特征在于所述离心过程的条件为：转速8000～10000r/min，时间10～30min。
7.权利要求1所述的一种提高类芽孢杆菌产糖量的选育方法应用于粉煤灰废水、水体中微藻的沉降处理。
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