CN105311676B

CN105311676B - 一种具有生物活性的硬组织工程支架材料及其制备方法

Info

Publication number: CN105311676B
Application number: CN201510764839.7A
Authority: CN
Inventors: 代金明; 马淑金; 丁力; 李湘杰; 牛睿; 李次会
Original assignee: Beijing Daqing Biotechnology Ltd By Share Ltd
Current assignee: Beijing Daqing Biotechnology Ltd By Share Ltd
Priority date: 2015-11-10
Filing date: 2015-11-10
Publication date: 2018-09-11
Anticipated expiration: 2035-11-10
Also published as: CN105311676A

Abstract

本发明提供一种具有生物活性的硬组织工程支架材料及其制备方法。所述制备方法包括步骤：(1)将经去抗原处理后的ECM在Tris或PBS缓冲液中充分溶胀，溶胀后冲洗，后进行冷冻干燥，得胶原支架；(2)将胶原支架在含有Ca²⁺的溶液和含有(PO4)^3‑的溶液中反复轮流浸泡进行矿化反应，后冲洗，然后进行冷冻干燥，得复合支架材料；(3)将复合支架材料在壳聚糖溶液、硫酸软骨素溶液、透明质酸钠溶液和骨骼生长因子溶液中的一种或一种以上的复合溶液中浸泡，后进行冷冻干燥，即得具有生物活性的支架材料。本发明的硬组织工程支架材料更加接近人骨结构，且具有良好的生物活性，制备工艺简单，成本较低，具有良好的应用前景。

Description

一种具有生物活性的硬组织工程支架材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及医用材料技术领域，具体涉及一种具有生物活性的硬组织工程支架材料及其制备方法。

背景技术

生物医用材料是用于和生物***结合、治疗或替换生物机体中的组织、器官或增进其功能的材料。作为一类人工或天然材料，它可以单独或与药品一起制成成品，用于组织或器官的治疗或替代，其最终目的是能够替代或修复人体器官和组织，并实现其生理功能。生物医用材料按材料组成和性质分为医用金属材料、医用高分子材料、生物陶瓷材料和生物医学复合材料。按用途可分为骨、牙、关节、肌键等硬组织修复和替换材料以及皮肤、***等软组织修复材料等。

硬组织材料是生物医用材料的重要组成部分，在人体硬组织(骨、牙等)的缺损修复及重建已丧失的生理功能方面起着重要的作用。1999年，全球生物材料及其制品销售额已达到1000亿美元，其中硬组织生物材料占1/5。根据民政部门报告，我国骨缺损患者近300万，牙缺损患者人数达总人数的1/5到1/3。

目前，对硬组织替代材料的研究已经受到广泛关注，发展了金属、高分子和陶瓷等三类硬组织替代材料，并将仿生、纳米、复合材料以及组织工程等先进的技术应用于硬组织替代材料领域的研究。

生物陶瓷是生物医用材料的重要组成部分，在人体硬组织的缺损修复及重建已丧失的生理功能方面起着重要的作用。几十年来，生物陶瓷的研究和应用取得了很大的进展，已从短期替换和填充，发展为永久性牢固填入，从生物惰性材料发展到生物活性材料、生物可降解材料及多相复合材料。生物陶瓷材料已广泛用于人工牙齿(根)、人工骨、人工关节和人工眼等。但其不足之处也是明显的。首先，其细胞粘附性差，不具有骨诱导特性；其次,其脆性大，柔韧性不够；最后，其在体内降解较慢。

就根本而言，替代材料的各方面性能应该尽量接近人体本身固有硬组织的性能指标，才能更好地满足人体的需要。人体硬组织材料(特别是骨、牙齿)，基本上是结构复杂的的陶瓷-有机物复合体。

胶原(Collagen)是细胞外最重要的水不溶性纤维蛋白，是构成细胞外基质的骨架。胶原不仅为细胞提供支持保护作用，而且与细胞的粘附、生长、表型表达均有密切关系。目前研究较多的无机物与胶原复合材料中，所用的胶原支架大部分从牛、马肌腱中提取出来，提取工艺中首先将动物组织中的胶原溶解，然后通过戊二醛等交联剂交联的办法重建胶原支架结构。

综上所述，目前虽然有一些生产硬组织材料的方法及其产品，但它们大多有一定的弊端或局限性，主要表现在：

1、单纯的陶瓷类替代材料脆性大、韧性低，不能用于负重部位骨缺损的修复。

2、目前研究主要集中在提取胶原后再交联的方式制备胶原支架，价格昂贵，且破坏了胶原的天然三维结构，很难达到骨替代材料的力学和生物学性能。同时，溶解胶原过程中，末端肽很可能受到破坏，从而使胶原产生抗原性，影响组织细胞生长。

3、无机物与有机物物理混合的方式在体内并不稳定，与人体硬组织结构差距大。

鉴于此，有必要研究开发性能更好、生物安全性更高且同时便于生产、成本较低的硬组织材料。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的上述各种缺陷，而提供一种具有生物活性的硬组织工程支架材料及其制备方法。本发明的硬组织工程支架材料更加接近人骨结构，且具有良好的生物活性，制备工艺简单，成本较低，具有良好的应用前景。

本发明提供的技术方案之一是：一种具有生物活性的硬组织工程支架材料的制备方法，其包括如下步骤：

(1)将经去抗原处理后的ECM在Tris或PBS缓冲液中充分溶胀，溶胀后将ECM取出以去离子水、生理盐水或PBS缓冲液冲洗，去除表面残留液体后进行冷冻干燥处理，得到充分膨胀的胶原支架；

(2)将充分膨胀的胶原支架分别在含有Ca²⁺的溶液和含有(PO4)^3-的溶液中反复轮流浸泡进行矿化反应，矿化反应完成后用去离子水、生理盐水或PBS缓冲液冲洗，后进行冷冻干燥处理，得到天然细胞外基质-生物活性磷酸钙硬组织工程用复合支架材料；

(3)将得到的天然细胞外基质-生物活性磷酸钙硬组织工程用复合支架材料在壳聚糖溶液、硫酸软骨素溶液、透明质酸钠溶液和骨骼生长因子溶液中的一种或一种以上的复合溶液中浸泡，后进行冷冻干燥处理，即得具有生物活性的支架材料。

步骤(1)中，所述的ECM为本领域常规的含义，其是指细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)，是由动物细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要是一些多糖和蛋白，或蛋白聚糖。这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。在本发明中，所述的ECM优选牛真皮基质、牛心包基质、牛跟腱基质、牛腹膜基质、猪腹膜基质、猪膀胱粘膜下层基质、猪小肠粘膜下层基质等保持天然结构和性能的主要由胶原蛋白组成的材料。

步骤(1)中，所述的去抗原处理为本领域常规的操作，如可以将牛真皮基质、牛心包基质、牛跟腱基质、牛腹膜基质、猪腹膜基质、猪膀胱粘膜下层基质、猪小肠粘膜下层基质等ECM基质进行脱脂、脱细胞等处理即可，使其免疫原性降到最低。

步骤(1)中，所述的溶胀优选溶胀的时间为12～36小时。

步骤(1)中，所述的冲洗优选以去离子水、生理盐水或PBS缓冲液冲洗3～10次。

步骤(2)中，所述的含有Ca²⁺的溶液为常规的可溶性钙盐溶液，优选0.1M～0.3M的CaCl₂溶液或Ca(NO₃)₂溶液，最优选0.2M的CaCl₂溶液。所述的含有(PO4)^3-的溶液为常规的含有(PO4)^3-的可溶性盐溶液，优选0.1M～0.5M的(NH₄)₂HPO₄溶液、K₂HPO₄溶液或Na₂HPO₄溶液，最优选0.25M的(NH₄)₂HPO₄溶液。

步骤(2)中，所述的反复轮流浸泡是指在含有Ca²⁺的溶液和含有(PO4)^3-的溶液中轮流浸泡多次，对于先在哪一种溶液中浸泡并没有特别限制。其具体操作优选如下：(a)将充分膨胀的胶原支架浸泡在含有Ca²⁺的溶液中，并在25～37℃摇床中摇动1～4小时，取出用去离子水、生理盐水或PBS缓冲液清洗3～10次，每次5～20分钟；(b)将胶原支架浸泡在含有(PO4)^3-的溶液中，并在20～37℃摇床中摇动1～4小时，取出用去离子水、生理盐水或PBS缓冲液清洗3～10次，每次5～20分钟；轮流进行(a)和(b)的操作重复4～12次。在(a)和(b)的操作中，优选每次在37℃摇床中摇动2小时，所述摇床的转速优选120转/分。所述清洗优选使用PBS缓冲液清洗3次，每次20分钟。所述轮流进行(a)和(b)的操作重复的次数优选10次。

在步骤(1)、(2)和(3)中，所述冷冻干燥优选真空冷冻干燥，所述真空冷冻干燥的过程为：将上一步得到的材料进行2～12小时的预冻，而后对产品进行真空低温干燥，所述预冻的温度为-80℃～-40℃，在所述真空低温干燥的过程中温度由预冻温度上升到4℃以上，所述真空低温干燥的时间优选8小时。所述预冻的时间优选4小时，所述预冻的温度优选-80℃。

步骤(3)中，所述壳聚糖溶液、硫酸软骨素溶液、透明质酸钠溶液和骨骼生长因子溶液中的一种或一种以上的复合溶液的浓度优选0.01％～1％，所述百分比为质量体积百分比，如1％的壳聚糖溶液，即指100mL溶液中溶解有1g壳聚糖；所述浸泡的时间优选0.5～2h。步骤(3)更优选在0.01％的骨骼生长因子溶液中浸泡1h。

较佳地，本发明的制备方法还包括步骤(4)：将具有生物活性的支架材料进行灭菌处理，以方便包装保存。所述灭菌处理较佳地为使用Co60辐照灭菌或使用环氧乙烷进行灭菌。

本发明提供的技术方案之二是：由前述制备方法制得的具有生物活性的硬组织工程支架材料。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的硬组织工程支架材料具有很高的生物安全性，其保持了细胞外基质的天然三维结构，有利于细胞的生长、增殖和分化，因细胞外基质的胶原分子与沉积的磷酸钙盐为化学键合，使得产品更加接近人骨结构。本发明的材料复合了硫酸软骨素、透明质酸钠、骨骼细胞生长因子等生物活性物质，能够促进组织再生。该材料保留了原有天然胶原三维网络结构，沉积有生物活性的以羟基磷灰石(HA)为主的弱结晶类磷酸钙盐类，两者的结合使得材料具有一定的生物力学特性，很好的生物相容性及降解性，同时保留了大部分细胞外基质中的生长因子，可应用于硬组织替代材料。本发明的制备工艺相较于传统方法成本较低，可操作性强，应用前景良好。

附图说明

图1为实施例1制得的支架材料的SEM图。

图2为实施例1制得的支架材料与单纯去抗原后的ECM植入兔下颌骨缺损部位后的效果对比图，其中，左边为实施例1的支架材料，右侧为单纯去抗原后的ECM。

图3为实施例7制得的支架材料的EDS图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但并不用来限制本发明的范围。下述各实施例中，所使用的各类设备、试剂和材料若无特别说明，均为常规市售可得。

实施例1支架材料的制备

制备猪小肠粘膜下层：将新鲜的猪小肠粘膜下层用过氧乙酸或酒精消毒，消毒处理后将猪小肠粘膜下层依次浸入氢氧化钠和EDTA后反复用去离子水清洗，得到ECM材料。

将制得的ECM材料浸泡在PH＝8.8的Tris缓冲液中，放在37℃摇床中使其充分溶胀12小时，取出用去离子水冲洗3次，每次10分钟；然后用滤纸擦干表面水分，放入液氮中迅速冷冻2小时，-80℃进行真空冷冻干燥8小时，得到充分膨胀后的胶原支架。将胶原支架：a)浸泡在25ml 0.2M CaCl₂溶液中，并在20℃摇床中以120转/分的速度摇动1小时，取出用去离子水清洗3次，每次20分钟；b)再将其浸泡在25ml0.25M(NH₄)₂HPO₄溶液中，并在37℃摇床中以120转/分的速度摇动1小时，取出用去离子水清洗3次，每次20分钟；轮流重复a)和b)步骤10次。再将材料浸泡在0.1％硫酸软骨素溶液中2h，最后冷冻干燥，得到的产品以Co60辐照灭菌、包装待用，得到具有生物活性的硬组织工程支架材料，其电镜SEM图如图1所示。经实验测定，本发明制得的支架材料的钙磷比在1.58～1.80之间；其无机物含量经灼烧实验测定约为70～80％，与人骨无机物含量相近，可作为骨替代材料。

将所制备的硬组织工程支架材料植入有缺损的兔下颌骨，并与简单去抗原后的ECM材料做对比，植入一个月后用X射线进行对比，参见图2。图2中，左侧(标有R侧)为本实施例制得的支架材料植入有缺损的兔下颌骨一个月后的情形，右侧为简单去抗原后的ECM材料植入一个月后的情形，从图2可以看出，试验兔植入本实施例制得的硬组织工程支架材料对于兔下颌骨缺损处的修复，明显强于单独去抗原材料的左侧下颌骨缺损的修复。可见，本发明制备的硬组织工程支架材料较简单去抗原后的ECM有更好的成骨性能。

实施例2支架材料的制备

制备牛心包基质：将新鲜的牛心包用过氧乙酸或酒精消毒，消毒处理后将牛心包依次浸入氢氧化钠和EDTA后反复用去离子水清洗。得到ECM材料。

将制得的ECM材料浸泡在PH＝8.8的Tris缓冲液(制备方法为在800ml纯化水中加入121.1g Tris，加入浓HCL调节PH值至8.8，继续加水至1升)中，放在37℃摇床中使其充分溶胀24小时，取出用去离子水冲洗3次，每次10分钟；然后用滤纸擦干表面水分，放入液氮中迅速冷冻2小时，-80℃进行真空冷冻干燥8小时，得到充分膨胀后的胶原支架。将胶原支架：a)浸泡在25ml 0.1M CaCl₂溶液中，并在37℃摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用去离子水清洗3次，每次20分钟；b)将其浸泡在25ml 0.1M(NH₄)₂HPO₄溶液中，并在37℃摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用去离子水清洗3次，每次20分钟；轮流重复a)和b)步骤4次。再将材料浸泡在0.1％硫酸软骨素溶液中1h，最后冷冻干燥，得到的产品以Co60辐照灭菌、包装待用，得到牛心包-生物活性磷酸钙复合材料，其无机物含量经灼烧实验测定约为2～5％，与人软骨无机物含量相近，可作为软骨替代材料。

实施例3支架材料的制备

制备牛真皮基质：将新鲜的牛真皮用过氧乙酸或酒精消毒，消毒处理后将牛真皮依次浸入石油醚和氢氧化钠后反复用去离子水清洗。得到ECM材料。

将制得的ECM材料浸泡在PH＝8.8的PBS缓冲液，放在37℃摇床中使其充分溶胀36小时，取出用生理盐水冲洗10次，每次10分钟；然后用滤纸擦干表面水分，放入-40℃中迅速冷冻12小时，-80℃进行真空冷冻干燥8小时，得到充分膨胀后的胶原支架。将胶原支架：a)浸泡在25ml 0.3M CaCl₂溶液中，并在25℃摇床中以120转/分的速度摇动4小时，取出用生理盐水清洗5次，每次5分钟；b)再将其浸泡在25ml0.5M(NH₄)₂HPO₄溶液中，并在37℃摇床中以120转/分的速度摇动4小时，取出用生理盐水清洗5次，每次5分钟；轮流重复a)和b)步骤10次。再将材料浸泡在1％壳聚糖溶液中0.5h，最后冷冻干燥，得到的产品以Co60辐照灭菌、包装待用，得到牛真皮基质-生物活性磷酸钙复合材料。

实施例4支架材料的制备

制备牛跟腱基质：将新鲜的牛跟腱用过氧乙酸或酒精消毒，消毒处理后将牛心包依次浸入氢氧化钠和蛋白酶后反复用去离子水清洗。得到ECM材料。

将制得的ECM材料浸泡在PH＝8.8的Tris缓冲液，放在37℃摇床中使其充分溶胀36小时，取出用PBS冲洗10次，每次10分钟；然后用滤纸擦干表面水分，放入-40℃中迅速冷冻12小时，-80℃进行真空冷冻干燥8小时，得到充分膨胀后的胶原支架。将胶原支架：a)浸泡在25ml0.3M Ca(NO₃)₂溶液中，并在25℃摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用PBS清洗10次，每次5分钟；b)再将其浸泡在25ml 0.3M K₂HPO₄溶液中，并在37℃摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用PBS清洗10次，每次5分钟；轮流重复a)和b)步骤10次。再将材料浸泡在0.01％骨骼生长因子溶液中0.5h，最后冷冻干燥后得到牛跟腱基质-生物活性磷酸钙复合材料。

实施例5支架材料的制备

制备牛腹膜基质：将新鲜的牛腹膜用过氧乙酸或酒精消毒，消毒处理后将牛腹膜依次浸入氢氧化钠和EDTA后反复用去离子水清洗。得到ECM材料。

将制得的ECM材料浸泡在PH＝8.8的Tris缓冲液，放在37℃摇床中使其充分溶胀24小时，取出用PBS冲洗3次，每次10分钟；然后用滤纸擦干表面水分，放入-80℃中迅速冷冻2小时，-80℃进行真空冷冻干燥8小时，得到充分膨胀后的胶原支架。将胶原支架：a)浸泡在25ml0.2M Ca(NO₃)₂溶液中，并在37℃摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用PBS清洗10次，每次5分钟；b)再将其浸泡在25ml 0.2M Na₂HPO₄溶液中，并在37℃摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用PBS清洗10次，每次5分钟；轮流重复a)和b)步骤12次。再将材料浸泡在0.01％骨骼生长因子溶液中0.5h，最后冷冻干燥，得到的产品以Co60辐照灭菌、包装待用，得到牛腹膜基质-生物活性磷酸钙复合材料。

实施例6支架材料的制备

制备猪腹膜基质：将新鲜的猪腹膜用过氧乙酸或酒精消毒，消毒处理后将猪腹膜依次浸入氢氧化钠和EDTA后反复用去离子水清洗。得到ECM材料。

将制得的ECM材料浸泡在PH＝8.8的Tris缓冲液，放在37℃摇床中使其充分溶胀24小时，取出用PBS冲洗3次，每次10分钟；然后用滤纸擦干表面水分，放入-80℃中迅速冷冻2小时，-80℃进行真空冷冻干燥8小时，得到充分膨胀后的胶原支架。将胶原支架：a)浸泡在25ml0.2M Ca(NO₃)₂溶液中，并在30℃摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用PBS清洗10次，每次5分钟；b)再将其浸泡在25ml 0.2M Na₂HPO₄溶液中，并在37℃摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用PBS清洗10次，每次5分钟；轮流重复a)和b)步骤10次。再将材料浸泡在0.01％透明质酸钠溶液中1h，最后冷冻干燥，得到的产品以Co60辐照灭菌、包装待用，得到猪腹膜基质-生物活性磷酸钙复合材料。

实施例7支架材料的制备

制备猪膀胱粘膜下层基质：将新鲜的猪膀胱粘膜下层用过氧乙酸或酒精消毒，消毒处理后将猪膀胱粘膜下层依次浸入氢氧化钠和EDTA后反复用去离子水清洗。得到ECM材料。

将制备得到的ECM材料浸泡在PH＝8.8的Tris缓冲液，放在37℃摇床中使其充分溶胀24小时，取出用PBS冲洗5次，每次10分钟；然后用滤纸擦干表面水分，放入-80℃中迅速冷冻2小时，-80℃进行真空冷冻干燥8小时，得到充分膨胀后的胶原支架。将胶原支架：a)浸泡在25ml 0.2M CaCl₂溶液中，并在37℃摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用PBS清洗5次，每次5分钟；b)再将其浸泡在25ml 0.2M Na₂HPO₄溶液中，并在37℃摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用PBS清洗5次，每次5分钟；轮流重复a)和b)步骤12次。再将材料浸泡在0.01％硫酸软骨素溶液中1h，最后冷冻干燥，得到的产品以Co60辐照灭菌、包装待用，得到猪膀胱粘膜下层基质-生物活性磷酸钙复合材料，其电镜EDS图如图3所示，从图3中可以看出，在基质材料的表面明显有很多的富含P元素和Ca元素的物质沉积，由于本发明应用无机盐反复沉积可以确定是一种或几种磷酸钙的无机盐类在材料表面上沉积。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种具有生物活性的硬组织工程支架材料的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(2)将充分膨胀的胶原支架分别在含有Ca²⁺的溶液和含有(PO₄)^3-的溶液中反复轮流浸泡进行矿化反应，矿化反应完成后用去离子水、生理盐水或PBS缓冲液冲洗，后进行冷冻干燥处理，得到天然细胞外基质-生物活性磷酸钙硬组织工程用复合支架材料；

(3)将得到的天然细胞外基质-生物活性磷酸钙硬组织工程用复合支架材料在0.01％的骨骼生长因子溶液中浸泡1h，后进行冷冻干燥处理，即得具有生物活性的支架材料。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的ECM为牛真皮基质、牛心包基质、牛跟腱基质、牛腹膜基质、猪腹膜基质、猪膀胱粘膜下层基质或猪小肠粘膜下层基质；和/或，

所述溶胀的时间为12～36小时；和/或，

所述的冲洗是以去离子水、生理盐水或PBS缓冲液冲洗3～10次。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的含有Ca²⁺的溶液为0.1M～0.3M的CaCl₂溶液或Ca(NO₃)₂溶液；所述的含有(PO₄)^3-的溶液为0.1M～0.5M的(NH₄)₂HPO₄溶液、K₂HPO₄溶液或Na₂HPO₄溶液。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的含有Ca²⁺的溶液为0.2M的CaCl₂溶液；所述的含有(PO₄)^3-的溶液为0.25M的(NH₄)₂HPO₄溶液。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的反复轮流浸泡的具体操作如下：(a)将充分膨胀的胶原支架浸泡在含有Ca²⁺的溶液中，并在25～37℃摇床中摇动1～4小时，取出用去离子水、生理盐水或PBS缓冲液清洗3～10次，每次5～20分钟；(b)将胶原支架浸泡在含有(PO₄)^3-的溶液中，并在20～37℃摇床中摇动1～4小时，取出用去离子水、生理盐水或PBS缓冲液清洗3～10次，每次5～20分钟；轮流进行(a)和(b)的操作重复4～12次。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在(a)和(b)的操作中，每次在37℃摇床中摇动2小时；和/或，

所述清洗为使用PBS缓冲液清洗3次，每次20分钟；和/或，

所述轮流进行(a)和(b)的操作重复的次数为10次。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)、(2)和(3)中，所述冷冻干燥为真空冷冻干燥，所述真空冷冻干燥的过程为：将上一步得到的材料进行2～12小时的预冻，而后对产品进行真空低温干燥，所述预冻的温度为-80℃～-40℃，在所述真空低温干燥的过程中温度由预冻温度上升到4℃以上。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述真空低温干燥的时间为8小时；所述预冻的时间为4小时，所述预冻的温度为-80℃。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括步骤(4)：将具有生物活性的支架材料进行灭菌处理；所述灭菌处理较佳地为使用Co60辐照灭菌或使用环氧乙烷进行灭菌。

10.由权利要求1～9任一项所述的制备方法制得的具有生物活性的硬组织工程支架材料。