CN105301118B - 一种枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，该方法包括，通过高效液相色谱法，采用梯度洗脱方法，对药物组合物中的相关物质进行检测，该检测方法检出杂质个数最多，分离度较好，且响应值高，灵敏度好。
Description
技术领域
本发明涉及药物检测领域，具体涉及一种枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法。
背景技术
枸橼酸莫沙必利(Mosapride Citrate，商品名为Gasmotin)是由大日本制药株式会社开发的新型胃动力药物，它是强效选择性5-HT4受体激动剂，临床用于治疗慢性胃炎、功能性消化不良、反流性食管炎及手术伴随的一系列胃肠道症状的缓解。其于1998年12月首次在日本上市，中文化学名称：4-氨基-5-氯-2-乙氧基-N-{[4-(4-氟苄基)-2-吗啉基]甲基}苯甲酰胺枸橼酸盐；分子式：C21H25ClFN3O3·C6H8O7·2H2O，分子量：650.05，其结构式为：
莫沙必利是强效选择性5-HT4受体激动剂，通过兴奋肌间神经丛的5-HT4受体，刺激神经末梢乙酰胆碱释放，从而增强胃肠运动，但不影响胃酸分泌。其与类似结构的胃动力药物相比，副作用大大减少，其与中枢神经原突触膜上的多巴胺D2，α1，5-HT1，和5-HT2受体无亲和力，因而没有这些受体阻滞所引起的锥体外系综合征。与其同为苯甲酰胺类胃动力药物的西沙必利(cisapride)在高敏病人中可出现Q-T间期延长或导致尖端扭转性室性心动过速，但莫沙必利没有与西沙必利相似的导致尖端扭转性室性心动过速的电生理特性。同时，其选择性作用于上消化道，对结肠运动无影响，可减少由于结肠运动亢进导致的腹痛、排便次数增加、腹泻和软便等副作用，另外，电生理研究表明，其无延长离体心室肌和蒲氏纤维动作电位时程的作用，安全性更好。目前，国内已有多家企业申报和生产该药品。
药物的杂质是指药物中存在的无治疗作用或者影响药物的稳定性、疗效，甚至对人体的健康有害的物质，在药物生产过程中，杂质的主要来源包括两个方面：1、由于所用原料不纯或者原料反应过程中反应未完全，以及反应的中间产物、反应的副产物等造成药品原料中杂质的存在；2、由于原料生产过程中反应的溶媒、催化剂等溶剂的残留所造成的药物的杂质。而药物的杂质与药品安全性的关系是一个受很多因素影响的复杂的关系，通常药物中的杂质大多具有潜在的生物活性，有的甚至与药物相互作用从而影响药物的效能和安全性，严重的可能产生毒性作用。药物中的所有杂质都会不同程度地影响药物的稳定性和安全性，因此在药物的研究、生产、贮存和临床应用等方面，必须保持药物的纯度，降低药物的杂质，这样才能保证药物的有效性和安全性，药物中的杂质是影响药物纯度的主要因素，如药物中含有超过限量的杂质，就有可能使理化常数变动，外观性状产生变异，并影响药物的稳定性；杂质增多也必然使药物的含量偏低或活性降低，毒副作用显著增加。因此，药物的有关物质检查是控制药物纯度，保证药物质量的一项重要指标。
因为不同药物的性质、生产方式和工艺条件不同，引入杂质也随着药物的不同而不同，由于特殊杂质多种多样，所以检查方法和检测条件也千差万别，目前常用的有关物质检查方法有：①物理分析法：根据药物与杂质在嗅、味、挥发性、颜色、溶解性及旋光性等方面的差异，利用灰度检查、旋光度检查等方法检测有关物质是否符合杂质限量规定。②化学反应法：一般包括容量分析法、重量分析法、比色法和比浊法等方法。③化学分析法：常用的有紫外分光光度法、毛细管区带电泳法(CzE)、高效毛细管电泳法(HPCE)等。④色谱法：包括薄层色谱层析法(TLC)、液相色谱法(PLC)、高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UPLC)、气相色谱法(GC)等。其中色谱法是目前最常用也是最有效的药物有关分析方法，具有灵敏度高、准确性好、简单、易行、快速高效等特点，越来越多的被各国药典用于控制药物的有关物质，而色谱法中TLC通常只能作为一种半定量方法，同时由于灵敏度受操作条件影响较大，所以有时难以满足快速、准确分析的需要。而高效液相色谱法(HPLC)作为一种比较成熟的方法因其分离效能高、专属性强和检测灵敏等特点已被广泛应用于药物的杂质检查中。
目前对于枸橼酸莫沙必利的高效液相色谱检测方法有一定报道，但是其仅能检测出部分杂质，存在杂质检测不全的现象，且部分杂质分离度不高，无法实现准确检测。因此寻求一种能够有效分离且尽可能多的检出莫沙必利中有关物质，对于枸橼酸莫沙必利的进一步质量控制具有十分重要的意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种分离度好、检出有关物质多、检测效率高的枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其包含以下步骤：
取枸橼酸莫沙必利供试品溶液进样，按照液相色谱条件进行检测，其中所述高效液相色谱测定条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为体积比为75：25的磷酸二氢钠溶液/乙腈的混合溶液，流动相B为体积比为20:80磷酸二氢钠溶液/乙腈的混合溶液，采用梯度洗脱。
本发明所提供枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其中所述梯度洗脱程序为：
| T(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 30 | 100 | 0 |
| 100 | 20 | 80 |
本发明所提供枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱测定条件中，磷酸二氢钠溶液的浓度为0.001-0.1mol/L，优选为0.01-0.05mol/L，进一步优选为0.01mol/L。
本发明所提供枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱测定条件中，磷酸二氢钠溶液的pH值为2.0-6.0，优选为3.5；磷酸二氢钠溶液的pH调节试剂优选为H3PO4；
本发明所提供枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱测定条件中，检测波长为210～360nm，优选为220nm；柱温：15-40℃，优选为35℃；流速：0.5-1.5ml/min，优选为1ml/min。
本发明所提供枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱测定条件中，流动相A、B中还含有三乙胺，所述三乙胺的体积浓度为0.01％-1％，优选为0.1％-0.3％，进一步优选为0.1％。
本发明所提供枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其中所述供试品溶液的制备方法为，取适量枸橼酸莫沙必利，精密称定，加流动相B溶解并稀释制成每1ml约含1mg的溶液即得。
本发明进一步提供一种枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其包含以下步骤：
(a)供试品溶液的制备：
取适量枸橼酸莫沙必利，精密称定，加流动相B溶解并稀释制成每1ml约含1mg的溶液即得；(b)色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为体积比为75：25的磷酸二氢钠溶液/乙腈的混合溶液，流动相B为体积比为20:80的磷酸二氢钠溶液/乙腈的混合溶液，柱温为350℃，流速为1ml/min，检测波长为220nm，所述梯度洗脱程序为：
| T(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 30 | 100 | 0 |
| 100 | 20 | 80 |
其中，所述流动相A和流动相B中的磷酸二氢钠溶液中含有体积浓度为0.1％的三乙胺，并用磷酸调PH值至3.5。
(c)测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定。
本发明中述梯度洗脱程序为：
0-30min时，流动相A为100％，流动相B为0％；
30-100min时，流动相A从100％到20％，流动相B从0％到80％。
本申请发明人详细考察了枸橼酸莫沙必利有关物质检测时的高效液相色谱检测条件，当采用磷酸二氢钠溶液：乙腈体积比为75：25的混合溶液为流动相A，磷酸二氢钠溶液：乙腈体积比为20:80的混合溶液为流动相B，且采用上述梯度洗脱条件时，磷酸二氢钠溶液浓度大于0.1M或小于0.001M时，梯度洗脱基线波动较大，当磷酸二氢钠溶液为0.001-0.1M时，基线较为平稳，当磷酸二氢钠溶液为0.01-0.03M时，基线较更加平稳，且峰形较好，当磷酸二氢钠溶液浓度为0.01M时，峰形优异，分离度最好；对磷酸二氢钠溶液的pH值进行考察发现，当PH大于6.0时,峰形不对称，当PH小于2.0时，色谱柱耐受性差、柱效下降，峰形不对称PH为2.0-6.0时，峰形较好，PH为3.5时，峰形最为对称；当向流动相中加入三乙胺0.01％～1％时，能够有效改善检测拖尾的现象，其中当三乙胺浓度为0.1％-0.3％时，效果较优，当三乙胺浓度为0.1％时，改善拖尾效果最好。通过考察二极管阵列检测器(DAD检测器检测)检测枸橼酸莫沙必利有关物质的吸收波长，得知其在210nm、274nm和360nm附近均出现吸收峰值，峰强递减，当检测波长是210-360nm时，背景干扰较小，且杂质峰的吸收较好，其中当检测波长为220-274nm时背景以及其它杂峰干扰小，且出峰结果稳定，故优选220-274nm为检测波长，且当检测波长220nm时，检测效果最佳。
本发明所提供的枸橼酸莫沙必利有关物质检测方法与现有技术相比，存在以下优势：
1、本发明提供的枸橼酸莫沙必利有关物质检测方法分离度好，并且基线波动不大，背景干扰小，能准确检测供试品中有关物质；
2、本发明提供的枸橼酸莫沙必利有关物质检测方法与现有技术相比能够检出更多杂质，能更有效的对供试品中的有关物质进行控制。
附图说明
图1为实施例1中高效液相色谱图
图2为实施例2中高效液相色谱图
图3为实施例3中高效液相色谱图
图4为实施例4中高效液相色谱图
图5为实施例5中高效液相色谱图
图6为实施例6中高效液相色谱图
图7为实施例7中高效液相色谱图
图8为实施例8中高效液相色谱图
图9为实施例9中高效液相色谱图
图10为实施例10中高效液相色谱图
图11为实施例11中总粒子流质谱图
图12为实施例11中杂质E质谱图
图13为实施例11中杂质F质谱图
具体实施方式
本发明通过以下实施例对本发明的内容作进一步的详细说明，并不能用于限制本发明的保护范围。
以下具体实施方式中，所使用的药品、试剂及仪器如下：
枸橼酸莫沙必利(自制，批号：JMB111002,111001)，莫沙必利对照品(来源：自制，批号MBD131101)，枸橼酸对照品(杂质A来源：中检院，批号100396200301)，枸橼酸酰化莫沙必利对照品(杂质B来源：TCR，15-THT-139-2)，452苯甲酸(杂质C来源：重庆英斯凯化工有限公司)，脱氟莫沙必利对照品(杂质D来源：自制，批号JMBI110506)，452苯甲酸乙酯对照品(杂质E来源：自制，702-462-5-1)，452苯甲酸异丁酯对照品(杂质F来源：自制，702-462-8-1)；乙腈(色谱纯，Fisher，Honeywell)，磷酸氢二钠(分析纯，成都科龙化工有限公司)，磷酸氢二钠(色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司)，磷酸氢二钾(分析纯，成都科龙化工有限公司)，三乙胺(分析纯，成都科龙化工有限公司)，三乙胺(色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司)，磷酸(分析纯，成都科龙化工有限公司)，枸橼酸(分析纯，成都科龙化工有限公司)，氢氧化钠(分析纯，成都科龙化工有限公司)，甲醇(Honeywell)，液相色谱仪(岛津LC-2010C)、二极管阵列检测器(岛津SPD-M20A)、液相色谱仪(Agilent1200)、色谱柱(Waters、Waters sunfire C18，4.6×250mm)、电子天平(Sartorius BP211D)、pH计(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)
实施例一 枸橼酸莫沙必利的有关物质的检测
供试品溶液制备：取适量枸橼酸莫沙必利，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含0.25mg的溶液。
高效液相色谱检测条件：流动相：0.05mol/L枸橼酸溶液(氢氧化钠试液调pH值至3.0)－甲醇(60:40)，流速：1ml/min；检测波长：275nm；柱温:35℃，进样体积为20μl。
按照上述方法制备供试品溶液，进行高效液相色谱检测，结果如图1所示，其检测到的杂质个数较少，且色谱峰响应值低，检测灵敏度低。
实施例二 枸橼酸莫沙必利的有关物质的检测
供试品溶液制备：取适量枸橼酸莫沙必利，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含0.5mg的溶液。
高效液相色谱检测条件：流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液(三乙胺调pH值至3.0)－乙腈(72:28)，流速：1ml/min；检测波长：276nm；柱温:室温(28℃)，进样体积为10μl。
按照上述方法制备供试品溶液，进行高效液相色谱检测，结果如图2所示，其检测到的杂质个数较少，且色谱峰响应值低，检测灵敏度低。
实施例三 枸橼酸莫沙必利的有关物质的检测
供试品溶液制备：取适量枸橼酸莫沙必利，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含1.0mg的溶液。
高效液相色谱检测条件：0.1M磷酸二氢钠溶液(磷酸调节pH＝4.0)：甲醇为75：25，流速：1ml/min；检测波长：274nm；柱温:35℃，进样体积为10μl。按照上述方法制备供试品溶液，进行高效液相色谱检测，结果如图3所示，其检测结果杂质峰分离效果差，峰形不对称，且色谱峰响应值低，检测灵敏度低。
实施例四 枸橼酸莫沙必利的有关物质的检测
供试品溶液制备：取适量枸橼酸莫沙必利，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含1.0mg的溶液。
高效液相色谱检测条件：0.01M磷酸二氢钠溶液(pH＝3.5)：乙腈为75：25)，流速：1ml/min；检测波长：274nm；柱温:35℃，进样体积为10μl。按照上述方法制备供试品溶液，进行高效液相色谱检测，结果如图4所示，其检测结果杂质峰分离效果差，峰形不对称，且色谱峰响应值低，检测灵敏度低。
实施例五 枸橼酸莫沙必利的有关物质的检测
供试品溶液制备：取适量枸橼酸莫沙必利，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含1.0mg的溶液。
高效液相色谱检测条件：0.01M磷酸二氢钠溶液(0.1％三乙胺，pH＝3.5)：乙腈为75：25为流动相A，0.01M磷酸二氢钠溶液(0.1％三乙胺，pH＝3.5)：乙腈为20：80为流动相B采用梯度洗脱：
| T(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 30 | 80 | 20 |
| 100 | 50 | 50 |
流速：1ml/min；检测波长：220nm；柱温:35℃，进样体积为10μl。
按照上述方法制备供试品溶液，进行高效液相色谱检测，结果如图5所示，其基杂质峰分离效果差，有拖尾，且检出的杂质个数较少。
实施例六 枸橼酸莫沙必利的有关物质的检测
供试品溶液制备：取适量枸橼酸莫沙必利，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含1.0mg的溶液。
高效液相色谱检测条件：0.01M磷酸二氢钠溶液(0.1％三乙胺，pH＝3.5)：乙腈为75：25为流动相A，0.01M磷酸二氢钠溶液(0.1％三乙胺，pH＝4.0)：乙腈为20：80为流动相B采用梯度洗脱。
| T(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 30 | 60 | 40 |
| 70 | 30 | 70 |
流速：1ml/min；检测波长：274nm；柱温:35℃，进样体积为10μl。
按照上述方法制备供试品溶液，进行高效液相色谱检测，结果如图6所示，其杂质峰响应值低，灵敏度低，且检出的杂质个数较少。
实施例七 枸橼酸莫沙必利的有关物质的检测
供试品溶液制备：取适量枸橼酸莫沙必利，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含1.0mg的溶液。
杂质A-F对照品溶液制备：取对照品A-F适量，加流动相B稀释制成每1ml溶液约含杂质1.0mg的溶液。
莫沙必利对照品溶液制备：取莫沙必利对照品适量，加流动相B稀释制成每1ml溶液约含莫沙必利对照品1.0mg的溶液。
高效液相色谱检测条件：0.01M磷酸二氢钠溶液(0.1％三乙胺，pH＝3.5)：乙腈为75：25为流动相A，0.01M磷酸二氢钠溶液(0.1％三乙胺，pH＝3.5)：乙腈为20：80为流动相B采用梯度洗脱。
| T(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 30 | 100 | 0 |
| 100 | 20 | 80 |
流速：1ml/min；检测波长：220nm；柱温:35℃，进样体积为10μl。
按照上述方法制备供试品、对照品溶液，进行高效液相色谱检测，结果如图7所示。通过图7中的检测结果可以看出，该条件下能够有效分离出6个杂质(A-F)和莫沙必利主峰，其分离度均大于1.5，峰形对称，响应值较高，检测灵敏度好，其中通过对照品对应保留时间可以看出，A峰为枸橼酸，B峰为枸橼酸酰化莫沙必利，C峰为452苯甲酸，D峰为脱氟莫沙必利，1为莫沙必利，E为452苯甲酸乙酯，F为452苯甲酸异丁酯。
实施例八 枸橼酸莫沙必利的有关物质的检测
供试品溶液制备：取适量枸橼酸莫沙必利，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含1.0mg的溶液。
高效液相色谱检测条件：0.01M磷酸二氢钠溶液(0.1％三乙胺，pH＝6.0)：乙腈为75：25为流动相A，0.01M磷酸二氢钠溶液(0.1％三乙胺，pH＝4.0)：乙腈为20：80为流动相B采用梯度洗脱。
| T(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 30 | 100 | 0 |
| 100 | 50 | 50 |
流速：1ml/min；检测波长：220nm；柱温:35℃，进样体积为10μl。
按照上述方法制备供试品溶液，进行高效液相色谱检测，结果如图8所示，该梯度下整个出峰时间滞后，检测时间延长，杂质检出个数少，且色谱峰响应值低，检测灵敏度低。
实施例九 枸橼酸莫沙必利的有关物质的检测
供试品溶液制备：取适量枸橼酸莫沙必利，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含1.0mg的溶液。
高效液相色谱检测条件：0.05M磷酸二氢钠溶液(0.3％三乙胺，pH＝3.5)：乙腈为75：25为流动相A，0.05M磷酸二氢钠溶液(0.3％三乙胺，pH＝3.5)：乙腈为20：80为流动相B采用梯度洗脱。
| T(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 30 | 100 | 0 |
| 100 | 20 | 80 |
流速：1ml/min；检测波长：220nm；柱温:35℃，进样体积为10μl。
按照上述方法制备供试品溶液，进行高效液相色谱检测，结果如图9所示，其基线虽有一定波动，但仍然能有效分离出枸橼酸莫沙必利中的A-F共6个杂质和1个莫沙必利主峰，且响应值较高，灵敏度好。
实施例十 枸橼酸莫沙必利的有关物质的检测
供试品溶液制备：取适量枸橼酸莫沙必利，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含1.0mg的溶液。
莫沙必利对照品溶液制备：取莫沙必利对照品适量，加流动相B稀释制成每1ml溶液约含莫沙必利对照品1.0mg的溶液。
高效液相色谱检测条件：0.01M磷酸二氢钠溶液(0.1％三乙胺，pH＝3.5)：乙腈为75：25为流动相A，0.01M磷酸二氢钠溶液(0.1％三乙胺，pH＝3.5)：乙腈为20：80为流动相B采用梯度洗脱。
| T(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 30 | 100 | 0 |
| 100 | 20 | 80 |
流速：1ml/min；检测波长：220nm；柱温:35℃，进样体积为10μl。
分别精密量取6份样品10ul进行高效液相色谱检测，结果如图10所示，图中6份样品出峰时间一致，峰面积一致，表明该方法重现性良好，检测结果稳定。
实施例十一 枸橼酸莫沙必利中杂质F、G的结构确认
从实施例7中结果可以看出，本申请中检测方法能够有效检测A-F共6个杂质，其中杂质E、F目前尚未见枸橼酸莫沙必利有关物质的检测中报道。通过LC-MS分析，进一步确证其结构，确证过程如下：
测试仪器：Agilent Infinity1290(CA,USA)与Finnigan LTQ Ion Trap MassSpectrometer(San Jose,CA，USA)联用，软件分别为Agilent Chemstation和Xcalibur。
质谱条件：质谱仪流速为0.2ml/min。电喷雾电离，正离子模式检测，氮气作为鞘气、辅助气和吹扫气。喷雾电压3.6kV：鞘气为15arb，辅助气为5arb，吹扫气为0arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为10V，透镜电压为80V。全扫描质量范围：150-400amu。二级质谱用数据依赖模式采集，全扫描图谱中响应度强度最高的1个峰用于二级质谱分析，高纯氦气用作碰撞气，碰撞能量为35ev。
对实施例7中液相色谱条件得到的样品分离结果和对照品E、F分别进行质谱检测，得到的总粒子流质谱图谱见图11。
1、杂质E(452苯甲酸乙酯)的结构确证
对图10中数据进行分析，其中RT＝19.76时峰为杂质E，其质谱图见图12，数据分析结果见表1。
表1 杂质E对照品质谱测定数据
| m/z | 相对丰度(％) | 备注 | |
| 对照品 | 244 | 100 | M++1离子峰 |
| 样品 | 244 | 100 | M++1离子峰 |
样品的分子离子峰与对照品化合物结构相吻合，其结构与对照品452苯甲酸乙酯结构一致。
2、杂质F(452苯甲酸异丁酯)的结构确证
对图10中数据进行分析，其中RT＝26.27时峰为杂质F，其质谱图见图13，数据分析结果见表2。
表2 杂质F对照品质谱测定数据
| m/z | 相对丰度(％) | 备注 | |
| 对照品 | 272 | 100 | M++1离子峰 |
| 样品 | 272 | 100 | M++1离子峰 |
样品的分子离子峰与对照品化合物结构相吻合，其结构与对照品452苯甲酸异丁酯结构一致。
Claims (12)
1.一种枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其包含以下步骤：取枸橼酸莫沙必利供试品溶液进样，按照液相色谱条件进行检测，其中高效液相色谱测定条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为体积比为75：25的磷酸二氢钠溶液/乙腈的混合溶液，流动相B为体积比为20:80的磷酸二氢钠溶液/乙腈的混合溶液，磷酸二氢钠溶液浓度为0.001-0.1mol/L，磷酸二氢钠溶液的pH值为2.0-6.0，流动相A和B中还含有三乙胺，所述三乙胺的体积浓度为0.01％-1％，检测波长为210～360nm，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
2.根据权利要求1所述的枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱测定条件中，磷酸二氢钠溶液浓度为0.01-0.05mol/L。
3.根据权利要求2所述的枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱测定条件中，磷酸二氢钠溶液浓度为0.01mol/L。
4.根据权利要求1所述的枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱测定条件中，所述磷酸二氢钠溶液的pH调节试剂为H3PO4。
5.根据权利要求1所述的枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱测定条件中，磷酸二氢钠溶液的pH值为3.5。
6.根据权利要求1所述的枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱测定条件中，检测波长为220nm。
7.根据权利要求1所述的高效液相色谱测定条件中柱温为15-40℃；流速为0.5-1.5ml/min。
8.根据权利要求7所述的高效液相色谱测定条件中柱温为35℃；流速为1ml/min。
9.根据权利要求1所述的枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱测定条件中，所述三乙胺的体积浓度为0.1％-0.3％。
10.根据权利要求9所述的枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱测定条件中，所述三乙胺的体积浓度为0.1％。
11.根据权利要求1所述的枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其中所述供试品溶液的制备方法为，取适量枸橼酸莫沙必利，精密称定，加流动相B溶解并稀释制成每1ml约含1mg的溶液即得。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的枸橼酸莫沙必利有关物质的检测方法，其包含以下步骤：
(a)供试品溶液的制备：
取适量枸橼酸莫沙必利，精密称定，加流动相B溶解并稀释制成每1ml约含1mg的溶液即得；
(b)色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为体积比为75：25的磷酸二氢钠溶液/乙腈的混合溶液，流动相B为体积比为20:80的磷酸二氢钠溶液/乙腈的混合溶液，柱温为35℃，流速为1ml/min，检测波长为220nm，所述梯度洗脱程序为：
其中，所述流动相A和流动相B中的磷酸二氢钠溶液中含有体积浓度为0.1％的三乙胺，并用磷酸调PH值至3.5；
(c)测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定。
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