CN105300949B - 一种荧光寿命测量方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用简单配置进行荧光寿命测试的方法和装置。所述装置包括载样装置、激发装置、成像装置和数据处理装置，将荧光样品放置在样品装置上，利用激发装置的光源来激发样品的荧光，然后关掉光源利用测量和成像装置实时对样品所发荧光进行成像，得到系列荧光强度随时间变化图像，利用该系列图像即可以计算出荧光寿命。相比较其他的方法和装置，本发明装置简单，成本低，易操作，可以实现快速和高通量实时在线测量。

Description

一种荧光寿命测量方法及装置
技术领域
发明涉及一种荧光寿命测量方法及装置，用于检测有激发光的照射引起的发射光的寿命测量和成像的技术领域。
背景技术
目前，荧光寿命的测量和成像主要有两种方法：一是使用时间相关单光子计数(TCSPC)技术对荧光寿命进行测量，这种方法采用光电倍增管或雪崩光电二极管作为探测器，再配合点扫描方法，进行荧光寿命成像。二是使用时间门(Time-gated)技术，用增强型电荷耦合器件(ICCD)相机作为探测器，每个光脉冲激发后延迟一定时间收集荧光信号，多次反复此过程延迟不同的时间，对荧光寿命进行测量，再配合宽场成像方法，进行荧光寿命成像。
然而，这两种技术均必须使用脉冲激光作为光源，搭配光电倍增管(或雪崩光电二极管)和增强型电荷耦合器件相机作为探测器，价格十分昂贵。另外采用这两种方法还需根据激发光源的照射来定时驱动探测器件，光路复杂，调整及处理耗时。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种荧光寿命测量方法及装置。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种荧光寿命测量方法，该方法包括以下步骤：
(1)用激发光源激发待测荧光样品；
(2)荧光样品受激发光源激发后，开始发光；成像装置采集荧光图像，并记录采集时间；获得一系列荧光图像；
(3)数据处理，将荧光图像转换成灰度图后，读取灰度值；根据灰度值以及对应的采集时间，输出荧光衰减曲线，得到荧光寿命。
进一步地，所述激发光源为脉冲光源或由开关控制的连续光源；所述由开关控制的连续光源在激发荧光样品后，通过开关关闭。
进一步地，待测荧光样品由多种荧光材料组成，样品受到激发后，不同种荧光材料分别形成荧光图像。
一种荧光寿命测量装置，所述装置包括：
载样装置，用于放置或者移动要待测荧光样品；
激发装置，设置有激发光源，用于产生激发光以激发待测样品；
成像装置，用于对待测样品所发荧光进行图像采集并存储；
数据处理装置，用于根据成像装置中所采集的图像计算荧光寿命。
进一步地，所述装置还包括调整装置，用于调整激发装置与样品装置的相对位置，以及成像装置与样品装置的相对位置，以使得在成像装置上获得荧光图像。
根据本发明，荧光寿命测量和成像设备以一定的速度存储荧光信号照片，这允许以普通高速相机而不是光电倍增管或者增强型电荷耦合器件相机获得短时段内发生的光的强度变化，从而得到样品的荧光寿命。整个装置简单，成本低，易操作，可以实现快速和高通量实时在线测量。
附图说明
图1为1号待测荧光物质的荧光衰减图；
图2为1号待测荧光物质的衰减拟合图；
图3为2号待测荧光物质的荧光衰减图；
图4为2号待测荧光物质的衰减拟合图；
图5为3号待测荧光物质的荧光衰减图；
图6为3号待测荧光物质的衰减拟合图；
图7为4号待测荧光物质的荧光衰减图；
图8为4号待测荧光物质的衰减拟合图；
图9为5号待测荧光物质的荧光衰减图；
图10为5号待测荧光物质的衰减拟合图。
具体实施方式
实施例1
把带有1号待测荧光物质的基片固定在样品架上，用一脉冲光源照射样品，脉冲重复频率为1kHz。高速相机对荧光信号进行连续拍摄，每帧曝光时间为50us。所拍摄的系列照片中，即出现与激发脉冲重频相对应的荧光信号，荧光信号从强到弱的周期变化。从其中任意选取从强到弱的荧光信号连续变化的照片共20张。截取照片中荧光物质相应的位置，如图1所示。再把每帧中所有像素的灰度值的总和对时间作图，即得到荧光衰减曲线图，如图2所示。
然后用单指数衰减函数I(t)＝Ibg+A·exp(-t/τ)对数据点进行拟合，其中，Ibg为背景光强，τ为待测物质的荧光寿命。拟合得到1号待测物质的荧光寿命值为149μs。
实施例2
把带有2号待测荧光物质的基片固定在样品架上，用一脉冲光源照射样品，脉冲重复频率为1kHz。高速相机对荧光信号进行连续拍摄，每帧曝光时间为50us。所拍摄的系列照片中，即出现与激发脉冲重频相对应的荧光信号，荧光信号从强到弱的周期变化。从其中任意选取从强到弱的荧光信号连续变化的照片共20张。截取照片中荧光物质相应的位置，如图3所示。再把每帧中所有像素的灰度值的总和对时间作图，即得到荧光衰减曲线图，如图4所示。
首先用单指数衰减函数I(t)＝Ibg+A·exp(-t/τ)对数据点进行拟合，其中，Ibg为背景光强，τ为待测物质的荧光寿命。发现该样品不能用单指数衰减函数拟合，用多(双)指数衰减函数对数据点进行拟合。τi为第i个荧光衰减通道的寿命。平均荧光寿命可通过计算得。具体见图4，2号待测物质的第1个荧光衰减通道的寿命为136μs；第2个荧光衰减通道的寿命为1046μs；平均荧光寿命为839μs。
实施例3
把带有3号待测荧光物质的基片固定在样品架上，用一脉冲光源照射样品，按照实施例1的方法进行操作(每帧曝光时间为100μs，连续拍摄脉冲光源激发，重频为500μs)，得到如图5所示的荧光衰减图像。由于激发光源的脉冲重复频率较高，致使待测物质荧光信号未衰减到较低值，下一激发脉冲已到达。
这种情况下，可以用多段荧光衰减时间序列进行拟合，拟合结果如图6所示，采用实施例2中的计算公式，得到的荧光寿命取平均值为200μs。
实施例4
把带有4号待测荧光物质的基片固定在样品架上，用一脉冲光源照射样品，按照实施例1的方法进行操作(每帧曝光时间为50μs，连续拍摄脉冲光源激发，重频为250μs)，得到如图7所示的荧光衰减图像。由于激发光源的脉冲重复频率较高，致使待测物质荧光信号未衰减到较低值，下一激发脉冲已到达。
这种情况下，可以用多段荧光衰减时间序列进行拟合，拟合结果如图8所示，采用实施例2中的计算公式，得到的荧光寿命取平均值为147μs。
＃
实施例5
本实施例同时测试多种待测荧光样品的荧光寿命，按照实施例1所述的方法，对5号样品进行激发脉冲照射后，拍摄到的时间序列荧光图片，如图9所示，三种不同荧光物质的荧光强度衰减速度不同。对三种物质对应的照片的区域的灰度值选取出来，分别用它们的灰度值对时间作图，即得到荧光衰减曲线。然后分别对它们用单指数或者多指数衰减函数进行拟合，如图10所示，得到A、B、C三种待测样品的荧光寿命分别为36.6μs,69.0μs,281.8μs。
对拍摄区域的每一个像素位置的灰度值随时间的变化曲线都画出来，并用单指数或者多指数衰减函数拟合，即得到拍摄区域每一个像素位置的荧光寿命。再用灰度值或者伪彩色，表示每一个像素位置的荧光寿命，重构出该区域的荧光寿命成像图。该技术可以扩展到防伪应用。

Claims (4)

1.一种荧光寿命测量方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）用脉冲光源激发待测荧光样品；
（2）荧光样品受激发光源激发后，开始发光；成像装置采集荧光图像，并记录采集时间；获得一系列荧光图像；
（3）数据处理，将荧光图像转换成灰度图后，读取灰度值；根据灰度值以及对应的采集时间，输出荧光衰减曲线，得到荧光寿命。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，待测荧光样品由多种荧光材料组成，样品受到激发后，不同种荧光材料分别形成荧光图像。
3.一种实现权利要求1所述方法的装置，其特征在于，所述装置一般包括：
载样装置，用于放置或者移动待测荧光样品；
激发装置，设置有脉冲光源，用于产生激发光以激发待测样品；
成像装置，用于对待测样品所发荧光进行图像采集并存储；
数据处理装置，用于根据成像装置中所采集的图像计算荧光寿命。
4.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，所述装置还包括调整装置，用于调整激发装置与样品装置的相对位置，以及成像装置与样品装置的相对位置，以使得在成像装置上获得荧光图像。
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