CN105296457B - 利用枸杞茉莉酸代谢途径重要酶基因提高植物抗逆性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用枸杞茉莉酸代谢途径重要酶基因提高植物抗逆性的方法。枸杞茉莉酸生物合成途径丙二烯氧化物合酶基因LmAOS、丙二烯氧化物环化酶基因LmAOC、和OPDA还原酶基因选自以下核苷酸序列之一：1)具有SEQ ID No.1/2/3序列所示的核苷酸序列；通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，通过3'RACE技术克隆枸杞丙二烯氧化物合酶基因LmAOS、丙二烯氧化物环化酶基因LmAOC、和OPDA还原酶基因LmOPR，得到完整的编码基因序列分别为为1533bp、744bp、1203bp。构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300‑LmAOS、pCAMBIA2300‑LmAOC、pCAMBIA2300‑LmOPR，电击法将载体转入农杆菌C58细胞，用这种细胞转化拟南芥，得到转基因拟南芥，用于后续有关抗逆性等的研究。

Description

利用枸杞茉莉酸代谢途径重要酶基因提高植物抗逆性的方法
技术领域
本发明涉及一种枸杞（Lycium chinense Miller）茉莉酸生物合成途径丙二烯氧化物合酶基因LmAOS、丙二烯氧化物环化酶基因LmAOC、和OPDA还原酶基因LmOPR的克隆。具体是利用枸杞茉莉酸代谢途径重要酶基因提高植物抗逆性的方法，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术
植物茉莉酸（jasmonicacid,JA，化学名称为3-氧-2-(2'-戊烯基)-环戊烷乙酸）生物合成途径为α-亚麻酸经脂肪氧合酶（LOX）催化形成13( S )-HPOT，13(S)-HPOT经丙二烯氧化物合成酶（Allene oxide synthase,AOS）催化形成不稳定12,13(S)-EOT，12,13(S)-EOT经丙二烯氧化物环化酶（Allene oxide cyclase，AOC）催化形成稳定(9 S,13 S)-OPDA。再经OPDA还原酶（OPDA reductase,OPR,）催化形成OPC-8:0，经过后续几部反应形成茉莉酸类化合物（jiasmonic acids，Jas）。AOS和AOC的作用部位为叶绿体，OPR的作用部位为过氧化物酶体，三种酶都是茉莉酸（jasmonicacid,JA）生物合成途径中的关键中间酶。已从番茄、马铃薯等中克隆得到AOS 、AOC基因，已从烟草、番茄等植物克隆得到OPR基因。丙二烯氧化物合酶可以认为是JA合成途径中第1个特异性的酶，它催化13-HPOT合成一种不稳定的丙二烯氧化物12，13(S)一epoxylinolenic acid。丙二烯氧化物环化酶的催化作用对于代谢流通向最后的茉莉酸产物至关重要。它可以环化在AOS催化反应下成生成的不稳定化合物——丙二烯氧化物，生成茉莉酸产物的最终前体——12．氧-植物二烯酸((9S，13S)-1 2-OXO-(1 0,15z)-phytodienoic acid)，1 2-氧-植物二烯酸是由AOC立体特异性环化生成的一个具有手性光学活性的环戊烯酮衍生物。AOC的催化特性比AOS严格，它只识别12，13(S)-epoxy-9(Z),11,15(Z)-octadecatrienoic acid作为底物，而不能催化1 2,13(S)-epoxy-9(Z),11-octadecatrienoic acid。OPDA还原酶催化OPDA 的还原反应，最终生成3-oxo-2-(2-(Z)-penteny1)-cyclopentane-1-octanoic acid(OPC．8：0)。在拟南芥中，确实OPR基因时，植物缺失合成JAs的功能。
茉莉酸类化合物(jasmonates，JAs)包括茉莉酸、茉莉酸甲酯以及其它衍生物，广泛存在于自然界，是许植物体内产生的天然化合物。大量研究表明，JAs具有广谱的生理效应，它不仅调节的生长和发育，如萌发、衰老、果实成熟、根的生花粉发育和球茎的形成、卷须的缠绕等，还参与植物对机械伤害、病害、虫害等环境的胁迫做出防御响应，和经典植物激素或植物生长调节剂相似。近年来，JAs得到了植物学家广泛的关注，并把它们作为一类新型的植物激素，关于这一类物质在植物中的生理效应及作用机理的研究也逐渐展开，尤其是JAs作为内源信号分子参与生物因子(如昆虫、真菌激发子等)防御和非生物因子(如伤害、渗透胁迫、低温等)逆境应答的信号传递研究进展很快。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枸杞丙二烯氧化物合酶、丙二烯氧化物环化酶和OPDA还原酶基因序列。
本发明的第二个目的是提供枸杞丙二烯氧化物合酶、丙二烯氧化物环化酶基因和OPDA还原酶基因编码的蛋白质。
本发明的目的还在于提供含有枸杞丙二烯氧化物合酶、丙二烯氧化物环化酶和OPDA还原酶基因重组载体和宿主细胞。
本发明的另一个目的在于提供枸杞丙二烯氧化物合酶、丙二烯氧化物环化酶基因和OPDA还原酶基因的用途即通过提高茉莉酸含量提高植物的抗逆性。
本发明提供的一种枸杞丙二烯氧化物环化酶基因LmAOC，如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构成；丙二烯氧化物合酶基因LmAOS如序列表中SEQ ID NO.2；OPDA还原酶基因LmOPR，SEQ ID NO.3所示
本发明提供了一种上述枸杞丙二烯氧化物环化酶基因LmAOC、丙二烯氧化物合酶基因、LmAOS OPDA还原酶基因LmOPR编码的蛋白质，如序列表中SEQ ID NO.4 、SEQ IDNO.5、 SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的蛋白质。
本发明提供了一种上述枸杞丙二烯氧化物合酶基因LmAOS、丙二烯氧化物环化酶基因LmAOC、OPDA还原酶基因LmOPR重组克隆载体pMD18-T-LmAOS、pMD18-T-LmAOC、pMD18-T-LmOPR。
本发明提供了一种上述枸杞丙二烯氧化物环化酶基因丙二烯氧化物合酶基因LmAOS、 LmAOC、OPDA还原酶基因LmOPR重组植物表达载体pCAMBIA2300- LmAOS、pCAMBIA2300- LmAOC、pCAMBIA2300- LmOPR。
含有上述的枸杞丙二烯氧化物合酶基因、LmAOS 、丙二烯氧化物环化酶基因LmAOC、OPDA还原酶基因LmOPR，这些重组载体包括质粒。
含有上述枸杞丙二烯氧化物合酶基因、LmAOS 、丙二烯氧化物环化酶基因LmAOC、OPDA还原酶基因LmOPR完整编码阅读框序列的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。
所述的宿主细胞选自农杆菌细胞或拟南芥细胞。
本发明提供了一种含有LmAOS、 LmAOC、LmOPR基因工程菌。
上述枸杞丙二烯氧化物合酶基因LmAOS 、丙二烯氧化物环化酶基因LmAOC、OPDA还原酶基因LmOPR的应用包括该LmAOS、LmAOC、LmOPR基因编码的蛋白在植物中的应用；
本发明的技术方案具体概述如下：
本发明提供的一种枸杞丙二烯氧化物合酶基因LmAOS 、丙二烯氧化物环化酶基因LmAOC、OPDA还原酶基因LmOPR，分别如序列表中SEQ ID NO.1 、SEQ ID NO.2 、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；还包括所示的核苷酸序列添加、取代、***或缺失一个或多个核苷酸的70%以上同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
本发明提供的一种枸杞丙二烯氧化物合酶基因LmAOS 、丙二烯氧化物环化酶基因LmAOC、OPDA还原酶基因LmOPR编码的蛋白，分别如序列表SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQID NO.6所示氨基酸序列。
本发明的克隆方法由下述步骤组成：
从枸杞叶片中提取总RNA，根据转录组的Unigene序列设计上游引物 AOS-BF、AOC-BF、OPR-BF。与3' RACE试剂盒中下游Outer引物利用RACE技术扩增得到其3’端末端全长序列；同时根据已获得的3’端序列设计下游特异性引物，通过PCR扩增获得LmAOS、LmAOC、LmOPR基因的全长序列。
本发明构建含枸杞丙二烯氧化物合酶基因LmAOS 、丙二烯氧化物环化酶基因LmAOC、OPDA还原酶基因LmOPR的植物表达载体pCAMBIA2300-LmAOS、pCAMBIA2300-LmAOC、pCAMBIA2300-LmOPR由下述步骤组成：
构建含有枸杞丙二烯氧化物合酶基因LmAOS 、丙二烯氧化物环化酶基因LmAOC、OPDA还原酶基因LmOPR的中间载体pMD18-T-LmAOS、pMD18-T-LmAOC、pMD18-T-LmOPR：
设计引物对AOSP1:、AOSP2和AOCP6、AOCP7、OPRP10、OPRP11，以cDNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物连接于pMD18-T载体，获得含有分别如序列表中SEQ ID NO.1、 SEQID NO. 2、 SEQ ID NO.3所示的LmAOS、LmAOC和LmOPR基因的中间载体pMD18-T-LmAOS、pMD18-T-LmAOC和pMD18-T-LmAOC。
构建植物表达载体：pCAMBIA2300-LmAOS/AOC/ OPR
设计引物对AOSP3、AOSP4，以质粒pMD18-T-LmAOS为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物经SalI和XhoI酶切后，将大肠杆菌表达载体pCAMBIA2300经SalI和XhoI双酶切，二者进行连接反应，得到植物表达载体pCAMBIA2300-LmAOS。
设计引物对AOCP8、AOCP9，以质粒pMD18-T-LmAOC为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物经PstI和SalI酶切后，将大肠杆菌表达载体pCAMBIA2300经PstI和SalI双酶切，二者进行连接反应，得到植物表达载体pCAMBIA2300-LmAOC。
将pMD18-T-LmOPR和 pCAMBIA2300-LmOPR载体同时经BamHI 和SalI酶切，然后将目的片段连接转化，得到植物表达载体pCAMBIA2300-LmOPR。
本发明通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，通过3' RACE技术克隆枸杞丙二烯氧化物合酶基因LmAOS、丙二烯氧化物环化酶基因LmAOC、和OPDA还原酶基因LmOPR，得到完整的编码基因序列分别为1533bp、744bp 、1203bp。构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-LmAOS、pCAMBIA2300-LmAOC、pCAMBIA2300-LmOPR，电击法将载体转入农杆菌C58细胞，用这种细胞转化拟南芥，得到转基因拟南芥，用于后续有关抗逆性等的研究，特别是通过提高茉莉酸含量可以提高植物的抗逆性。
附图说明
图1 ：LmAOS基因全长电泳图。
图2： LmAOC基因全长电泳图。
图3： LmOPR基因全长电泳图。
图4： pMD18-T-LmAOS载体示意图。
图5 ：pMD18-T-LmAOC载体示意图。
图6 ：pMD18-T-LmOPR载体示意图。
图7 ：pCAMBIA2300-LmAOS载体示意图。
图8 ：pCAMBIA2300-LmAOC载体示意图。
图9 ：pCAMBIA2300-LmOPR载体示意图。
图10：转LmAOS基因拟南芥基因组PCR验证结果。
图11：转LmAOC基因拟南芥基因组PCR验证结果。
图12：转LmOPR基因拟南芥基因组PCR验证结果。
图13：提高拟南芥抗逆性验证结果，白色代表AOS基因，虚线代表AOC基因，黑色代表OPR基因。
图14：拟南芥受伤处理后三种基因表达随时间变化；白色代表AOS基因，虚线代表AOC基因，黑色代表OPR基因。
图15：拟南芥4℃低温处理后三种基因表达随时间变化，白色代表AOS基因，虚线代表AOC基因，黑色代表OPR基因。
具体实施方式
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
枸杞丙二烯氧化物环化酶基因LmAOS的克隆：
从100mg新鲜枸杞叶片中提取Total RNA，根据转录组的Unigene序列设计上游引物
AOS-BF：5‘-C GCTAAACTGAAGAAACT-3’， 利用3'-FULL RACE Core Set Ver.2.0（TaKaRa，Japan）试剂盒扩增得到完整的基因序列。具体步骤：
①以Total RNA为模板，使用3'RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成1stStrand cDNA，反应体系如下：
RNA： 2μl
3' RACE Adaptor： 1μl
5×M-MLV Buffer： 2μl
2.5mM dNTP Mixture： 1μl
RNase Inhibitor： 0.25μl
Reverse Transcriptase M-MLV： 0.25μl
RNase Free dH2O： 3.5μl
反应条件：42℃，60min；70℃，15min。
②根据基因的上游引物与试剂盒提供的下游引物3' RACE out primer： 5’ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3’，以1st Strand cDNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下：
1st PCR产物： 1μl
2.5mM dNTP Mixture： 2μl
AOS-BF： 0.5μl
3' RACE out primer： 0.5μl
10×LA PCR Buffer： 2.5μl
TaKaRa LA Taq： 0.25μl
ddH2O： 18.25μl
Total volume 25μL
反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min；72℃，8min，30个循环。
根据已获得的3’端序列设计下游特异性引物AOSP2: 5’-ATGGCATCAACTTCTTTTGCTCT-3’
以1st Strand cDNA为模板，以5’端特异引物AOSP15’-ATGGCATCAACTTCTTTTGCTCT-3’进行PCR反应，扩增基因的全长。反应体系如下：
1st PCR产物： 1μl
2.5mM dNTP Mixture： 4μl
P1: 1μl
P2： 1μl
10×LA PCR Buffer： 5μl
TaKaRa LA Taq： 0.5μl
ddH2O： 37.5μl
Total volume 50μL
反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，8min，30个循环。扩增AOS基因全长产物电泳图如图1。
实施例2
枸杞丙二烯氧化物环化酶基因LmAOC的克隆：
从100mg新鲜枸杞叶片中提取Total RNA，根据转录组的Unigene序列设计上游引物
AOC-BF：5’ CTTCCAGATCATTTTCCTGCAAGAGCC -3’， 利用3'-FULL RACE Core SetVer.2.0 （TaKaRa，Japan）试剂盒扩增得到完整的基因序列。具体步骤：
①以Total RNA为模板，使用3'RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成1stStrand cDNA，反应体系如下：
RNA： 2μl
3' RACE Adaptor： 1μl
5×M-MLV Buffer： 2μl
2.5mM dNTP Mixture： 1μl
RNase Inhibitor： 0.25μl
Reverse Transcriptase M-MLV： 0.25μl
RNase Free dH2O： 3.5μl
反应条件：42℃，60min；70℃，15min。
②根据基因的上游引物与试剂盒提供的下游引物3' RACE out primer： 5’ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3’，以1st Strand cDNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下：
1st PCR产物： 1μl
2.5mM dNTP Mixture： 2μl
AOC-BF： 0.5μl
3' RACE out primer： 0.5μl
10×LA PCR Buffer： 2.5μl
TaKaRa LA Taq： 0.25μl
ddH2O： 18.25μl
Total volume 25μL
反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min；72℃，8min，30个循环。
根据已获得的3’端序列设计下游特异性引物AOCP7:5’-CTCAGTCAGTGAAATTA
TTGAGTG-3’。
以1st Strand cDNA为模板，以5’端特异引物AOCP6：5’-ATGGCCACTGCTTCCTCTGCCA-3’进行PCR反应，扩增基因的全长。反应体系如下：
1st PCR产物： 1μl
2.5mM dNTP Mixture： 4μl
P1: 1μl
P2： 1μl
10×LA PCR Buffer： 5μl
TaKaRa LA Taq： 0.5μl
ddH2O： 37.5μl
Total volume 50μL
反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min；72℃，8min，30个循环。扩增AOC基因全长产物电泳图如图2。
实施例3
OPDA还原酶基因LmOPR的克隆：
从100mg新鲜枸杞叶片中提取Total RNA，根据转录组的Unigene序列设计上游引物。
OPR-BF：ATTTTGTCAGCTATGGCAT， 利用3'-FULL RACE Core Set Ver.2.0（TaKaRa，Japan）试剂盒扩增得到完整的基因序列。具体步骤：
①以Total RNA为模板，使用3'RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成1stStrand cDNA，反应体系如下：
RNA： 2μl
3' RACE Adaptor： 1μl
5×M-MLV Buffer： 2μl
2.5mM dNTP Mixture： 1μl
RNase Inhibitor： 0.25μl
Reverse Transcriptase M-MLV： 0.25μl
RNase Free dH2O： 3.5μl
反应条件：42℃，60min；70℃，15min。
②根据基因的上游引物与试剂盒提供的下游引物3' RACE out primer： 5’ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3’，以1st Strand cDNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下：
1st PCR产物： 1μl
2.5mM dNTP Mixture： 2μl
OPR-BF： 0.5μl
3' RACE out primer： 0.5μl
10×LA PCR Buffer： 2.5μl
TaKaRa LA Taq： 0.25μl
ddH2O： 18.25μl
Total volume 25μL
反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min；72℃，8min，30个循环。
根据已获得的3’端序列设计下游特异性引物OPRP11:5’-TCACAGACGCGACAACGGTAC
以1st Strand cDNA为模板，以5’端特异引物OPRP10:5’-ATGGCTAACACGACATCGTCTT
进行PCR反应，扩增基因的全长。反应体系如下：
1st PCR产物： 1μl
2.5mM dNTP Mixture： 4μl
P1: 1μl
P2： 1μl
10×LA PCR Buffer： 5μl
TaKaRa LA Taq： 0.5μl
ddH2O： 37.5μl
Total volume 50μL
反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，8min，30个循环。扩增OPR基因全长产物电泳图如图3。
实验例4
克隆载体pMD18-T-LmAOS/AOC/OPR的构建过程
将序列表所示的LmAOC/AOC/OPR基因与pMD18-T载体连接，反应体系如下：
目的PCR片段： 4μl
pMD18-T载体： 1μl
SolutionI： 5μl
反应条件：16℃，30min。连接产物转化E.Coli TOP10，涂布于含Amp抗性的LB平板。以目的基因为引物进行PCR（反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min；72℃，8min，30个循环。）得到PCR产物，电泳条带正确，然后送华大基因公司测序。pMD18-T-LmAOS、pMD18-T-Lm AOC、 pMD18-T-LmOPR载体图谱如图4、5、6。
实施例5
双元植物表达载体pCAMBIA2300-LmAOS的构建
设计引物AOSP3: 5’-CCCGTCGACATGGCATCAACTTCTTTTGCTCT-3’、AOSP4: 5’-GGGCTCGAGTTAAGCTTTTTTCAAAGAAGTTA-3’，以质粒pMD18-T-LmAOS为模板，进行PCR扩增得到100ulPCR产物，切胶回收后得到的30ul PCR产物,经XhoI和SalI双酶切，酶切体系为2ulXhoI内切酶，2μl SalI内切酶，10μl 10×FastDigest Buffer，58μl ddH2O 。pCAMBIA2300空载体质粒经XhoI和SalI双酶切，酶切体系为：60μl质粒，2μl PstI内切酶，2μl SalI内切酶，20μl 10×FastDigest Buffer，116μl ddH2O。反应条件为37℃，3hours。分别切胶回收目的片段LmAOS和载体片段pCAMBIA2300，然后将二者连接，连接体系如下：
连接产物转化E.Coli.TOP10，涂布于含100mg/L 浓度Kana抗性的LB平板。阳性克隆经酶切验证正确。pCAMBIA2300-LmAOS载体图谱如图7。
实施例6
双元植物表达载体pCAMBIA2300-LmAOC的构建
设计AOCP8: 5’-GCGCTGCAGATGGCCACTGCTTCCTCTGCCA-3’、AOCP9:5’-CGCGTCGACCTCAGTCAGTGAAATTATTGAG-3’，以质粒pMD18-T-LmAOC为模板，进行PCR扩增得到100ulPCR产物，切胶回收后得到的30ul PCR产物,经PstI和SalI双酶切，酶切体系如实验例6，反应条件为37℃，3hours。分别切胶回收目的片段LmAOC和载体片段pCAMBIA2300，然后将二者连接，连接体系如实验例6，连接产物转化E.Coli.TOP10，涂布于含100mg/L 浓度Kana抗性的LB平板。阳性克隆经酶切验证正确。pCAMBIA2300-LmAOS载体图谱如图8。
实施例7
双元植物表达载体pCAMBIA2300-LmOPR的构建
扩大培养pMD18-T-LmOPR质粒的大肠杆菌，提取质粒，用BamHI和SalI双酶切该质粒，将 pCAMBIA2300空载体质粒也用BamHI和SalI双酶切，将二者的酶切产物连接，连接体系如实验例6，连接产物转化E-Coli.DH5α，涂布于含100mg/L 浓度kana抗性的LB平板上。37℃培养，12h后挑取单菌落进行菌落PCR验证，将菌落PCR验证阳性的菌，如图6，摇菌提取质粒，酶切鉴定得到目的条带。pCAMBIA2300-LmAOS载体图谱如图9。
实验例9
用于植物转基因的农杆菌工程菌种C58: pCAMBIA2300- LmAOS/AOC/OPR的构建。
农杆菌感受态细胞制备
1. 将农杆菌C58单菌落接种于5mLYEP液体培养基中，28℃，180r/min振荡培养。
2. 将上述菌液转入l00mLYEP液体培养基中，28℃，180r/min，振荡培养至(OD600值约为0.5)。
3. 冰浴30min后，4℃，4000r/min离心l0min，收集菌体，重悬于20mL预冷的H2O中。
4. 4℃，4000r/min离心10min，收集菌体，重悬于预冷的10%甘油中，每管200μL速冻，存于-80℃备用。
植物表达载体的电击转化
1. 将-80℃取出的C58感受态细胞置于冰上，使其缓慢融化;
2. 加入 4μL质粒，混匀，冰浴5min;
3. 转移至电击杯中;
4. 设置电击转化仪参数 :1500V，0.2s，电击转化;
5. 室温静置2min后加入500μLYEB液体培养基，28℃，180r/min振荡培养3h;
6. 室温4000r/min离心10min，吸出400μL上清液，将剩下的菌液混匀，涂布于含100mg/L 卡那霉素和100mg/L利福平抗性的YEB平板上，倒置平板，28℃培养，48h，直至看到清晰的单菌落。
7. 挑取单菌落，菌落PCR验证。
实验例10
农杆菌介导的拟南芥遗传转化
本实验用到的培养基
侵染培养基：MS液体培养基，pH5.8；
脱菌筛选培养基：MS+100mg/L卡那霉素，pH5.8；
拟南芥苗的无菌培养：选饱满、健康的拟南芥种子，将种子放在含有蛭石和营养土中(体积比1:1)，25℃光培养，16h/8h光周期。待拟南芥即将开花时进行遗传转化。
拟南芥的农杆菌转化
1、接种含有表达载体的农杆菌克隆与5 ml YEP培养基(含终浓度为50 μgּmL-1的Kan和Rif)中，28℃，2000rpm，振荡过夜；
2、以1:50比例转接到200 ml YEP培养基中，28℃，2000rpm培养至OD600=0.6-0.8;3、4000rpm，离心15min，收集菌体；
4、等体积渗透缓冲液(1/2 MS培养基+5%蔗糖配置后在121℃ 灭菌20 min，加终浓度0.03% SilwettL-77，振荡混匀)将农杆菌菌体重悬；
5、将已授粉、结荚的拟南芥用消毒剪去除，倒置于装有渗透缓冲液的培养皿上侵染50 S，用塑料薄膜覆盖整个托盘并适留通气孔后，在弱光下培养，24h后取下薄膜，于室温中继续培养。
6、约30日后收获种子，将收获的转基因种子用含有无水乙醇浸泡5 min，无菌水洗三遍；
7、将转基因种子置于含100mg/L Kan的MS平板上，在22℃，16h光照/8h黑夜光周期培养。
8、经Kan抗性筛选的阳性植物表现良好，长势正常，而阴性植物则不萌发或不久死亡。
转基因拟南芥基因组DNA的PCR检测
CTAB法提取拟南芥总DNA;
以基因组DNA为模板进行PCR检测，引物对分别为AOSP1/P5、AOCP6/P7、OPRP10/P11，反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，90sec；72℃，8min，30个循环。
取上述PCR产物5μl进行电泳检测，图10、11、12说明LmAOS/AOC/OPR基因已成功转入拟南芥。
实验例11
将阳性拟南芥用200uMNaCl/0.5cm打孔器/4℃/处理后，在0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、24h小时取叶片。叶片RNA 的分离 采 用 RNeasy Plant Mini Kit （QIAGEN，German）试剂盒,用分光光度计测定OD260 和OD280 值. 根 据OD260/OD280值判断RNA的质量，用琼脂糖凝胶电泳检 测的RNA的完整性。RNA提取按照该试剂盒说明书进行。具体步骤为：
1. 称取100 mg的枸杞叶片，在液氮中研磨至细粉末状，转到RNase-free、液氮预冷的2 mL离心管中，使液氮挥发，但样品不能解冻；
2. 加入450 μL含有1%（v/v）β-巯基乙醇的RLT Buffer，用力振荡，56 ℃水浴1-3min。
3. 将裂解液转移至放在2 mL收集管上的紫色QIAshredder离心柱上，12000 r/min，离心2 min，弃掉离心柱，将上清液转移至新的离心管中；。
4. 加入200 μL的100%乙醇到裂解液中，用移液器快速混匀；
5. 将混匀后的溶液转移至放在2 mL收集管上的粉色RNeasy离心柱上，12000 r/min，离心15 s，弃掉滤液；
6. 加入700 μL的RW1 buffer到粉色RNeasy离心柱中，12000 r/min，离心15 s，弃掉滤液；
7. 加入500 μL的RPE Buffer到粉色RNeasy离心柱中，12000 r/min，离心15 s，弃掉滤液；
8. 加入500 μL的RPE Buffer到粉色RNeasy离心柱中，12000 r/min，离心2 min，小心移走2 mL收集管；
9. 将粉色RNeasy离心柱转移至新的2 mL收集管（试剂盒提供）中，12000 r/min，离心1 min；
10. 再将粉色RNeasy离心柱转移至新的1.5 mL收集管（试剂盒提供）中，加入50 μL RNase-free的无菌水，12000 r/min，离心1 min； 11. 将步骤10中的洗脱液再次转移至粉色RNeasy离心柱中，12000 r/min，离心1 min；
12. 取2 μL枸杞叶片总RNA在含有2%甲醛的0.7%（w/v）的琼脂糖凝胶中检测，测定RNA浓度。
用TransScriptTM one –step gDNA Rmoval and cDNA synthesis SuperMIx(TRANS,China)合成cDNA第一链。反应体系为：TotalRNA 5ul,Random Primer(0.1ug/ul)1ul，2×TSReaction Mix 10ul,TransScriptTM 1ul，gDNA Remover 1ul，RNase-free Water2ul。反应条件为25℃10min，42 30min，85℃ 5min。
将合成的cDNA稀释10倍后作为模板。设计引物qPCRAOS15’-AGCAACCATTTCTTCTTCCT
CG-3’,qPCRAOS25’-GTCACGTTCATTGAGCTCGT-3’,qPCRAOC1:5’-GATCTTGTCCCCTTCAGCAA-3’，qPCRAOC2：5’-AGATCTTGTCCCCTTCAGCA-3’，qPCROPR1:5’-TCATCTTGACGCCATGGACT
-3’，qPCROPR2:5’-ATGTGCCTCCTCCTCTTCAC-3’用TransStartTM Top Green qPCRSuperMix(TRANS，China)做RT-qPCR。反应体系为：Forward Primer(10uM) 0.5ul，ReversePrimer(10uM) 0.5ul，2×TransStartTM Top Green qPCR SuperMix 12.5ul，passiveReference Dye 0.5ul Template 1ul 。反应条件为 94℃ 30s,94 5s ，60℃ 15s，72℃10s，40个循环。
处理数据后得到图13、14、15。说明盐、低温、受伤处理后茉莉酸代谢途径三个关键酶基因LmAOS/AOC/OPR表达量提高。而且转基因拟南芥比非转基因拟南芥的长势好。
序列表
<110> 天津大学
<120> 利用枸杞茉莉酸代谢途径重要酶基因提高植物抗逆性的方法
<130> 2013114
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1533)
<400> 1
atggcatcaa cttcttttgc tcttccttct ctaaaactac aattcccctc acataaacca 60
tcgtcttctt gtacgaactc atcgtctcat caggtcattg ttcgatccat taaagattca 120
gtgtctgaga ggccaccttt catttcatcg ccacccgtta aaccaacaaa actcccgacc 180
agaaaagtcc ctggagatta tggactacca ttggttggtc catggaaaga cagacttgat 240
tacttttaca atcaaggcaa aaatgagttt ttcaaatctc gaattcagaa acatcaatct 300
actgtttttc gaacaaacat gccacctggt cctttcattt ccttcaaccc aaacgttgtt 360
gttttgctcg atggtaaaag tttccccacc ctttttgatg tctctaaggt tgagaaaaaa 420
gatctcttca ccggtacttt tatgccttca actgagctca caggcggtta ccgtgttctc 480
tcctatcttg atccttccga accaaaccac gctaaactga agaaactcat gttttatctc 540
ctttcatcac gacgtaacga agtcatcccc gagttccaca atagctatga aaaaggtaaa 600
gctggtttaa actccggcaa tgatcaagct gcgtttaatt tcttagctag atcgttgttc 660
ggagttaacc cagttgaaac taaactcgga ggtgatggtc cgacattgat cggaaaatgg 720
gtgttgcttc agcttcatcc tgtgcttact ctcggtcttc cgaagtttct agatgactta 780
atcctccata ctttccggtt acctccgttt ctggtgaaga aagattacca gagactttac 840
gatttctttt acaccaactc cgccaattta ttcgtcgaag ctgaaaaact cggcatttca 900
aaagaagaag cttgtcataa tcttctcttc gctacttgct tcaattcctt cggcgggatg 960
aagattttct tcccgaatat gatgaaatcg atagcgaaag caggggtgga ggtccatacc 1020
cgtttagcaa acgagatccg atcggaagta aaatccgccg gcgggaagat cacgatgtcg 1080
gcgatggaga aaatgccgtt aatgaaatca gtagtatatg aagctttacg agttgatcct 1140
ccggtagctt cacaatacgg aagagccaaa caggacctta cgatcgaatc acacgacgcc 1200
gttttcgagg tgaaaaaagg tgaaatgcta ttcgggtacc aaccatttgc aacgaaggat 1260
ccgaaaattt ttgaccggcc ggaagagttc gtcgccgatc ggttcgtcgg agaagaagga 1320
gaaaagttat tgaaatacgt attatggtct aatggaccgg aaacggaaag tccgacagtg 1380
gggaataaac agtgtgctgg aaaagatttt gtagtgatgg tttcgaggtt attcgtaacg 1440
gagttttttc tccgttacga tacattcaac gtcgacgttg gtacgtcggc gttgggggct 1500
tcaattacta taacttcttt gaaaaaagct taa 1533
<210> 2
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<221> gene
<222> (1)..(744)
<400> 2
atggccactg cttcctctgc cactgctgct cttagagcaa ccatttcttc ttcctcgtat 60
aagctaccct ctacctttac tacttctgtt tctcaaaaga tccaatcttt taaactccct 120
aaccctctca tttcacaatc tcttaaactt agcacctcca ctactacttc cagatcattt 180
tcctgcaaga gccaaagcag ttcaacagat tccacaagtg gtaaagttca agaaattagc 240
atctacgagc tcaatgaacg tgaccgtggt agccctgctt atcttcgatt gagccaaaag 300
agtgtcaatt cacttggaga tcttgtcccc ttcagcaaca aactatatac cgcagaccta 360
aagaagagaa ttggaataac ggcaggaccc tgcattctaa tcaagcgcga agaggagaaa 420
aaaggagatc gctacgaagc tatttacagc ttctacttcg gcgaatatgg tcacatgacc 480
gttcagggac catacttaac ctacgaagac acttatctcg ccgttaccgg tggatccggt 540
atatttgaag gggttaccgg tcaagtgaaa ttgcaacaaa ttatctttcc gttcaagtta 600
ttctacactt tttacttgaa gggtattcca gatctgccat cggagttggt atgtacggcg 660
gttcctccgt caccgacggt ggaaccaaca cctgaagcta aagcttgtga ggagggggcc 720
gcactcaata atttcactga ctga 744
<210> 3
<211> 1203
<212> DNA
<213> 人工系列
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1203)
<400> 3
atggctaaca cgacatcgtc ttcagctaaa gatggaagca attccctttt ctctccttac 60
aagatgggaa agtttaatct ttctcacagg gttgtattgg ctccgatgac aaggtgtaga 120
gcactgaaca gtattccaca agtggcactg gttgagtatt acgggcagag agcaacagat 180
ggtggatttc tcataactga aggcaccatg atttctccta gttctgctgg gtttccacat 240
gtgccgggga ttttcacaaa ggagcaagta gaagcatgga agaaaatagt tgatgtagtg 300
catgcaaagg gttctgtcat attttgtcag ctatggcatg ttggtcgtgc atctcatgaa 360
gtgtatcaac ctggtggagc tgcaccaata tcatccactg agaagccaat atcaaagcgg 420
tggagaatac taatgccaga tggaacttat gggatttatc caaaaccaag agctcttgga 480
accaatgaga tctcacaagt ggttgaagat tatcgcaagg cagccttgaa tgctattgaa 540
gcaggtttcg atggtattga aatccatgga gctcatggtt acttgattga ccaattcttg 600
aaagatggga taaatgaccg cacagatgag tatggtggat cactaacgaa ccggtgcaaa 660
ttcattacac aggtggttca agcagtcgtc acagcaatag gtgctgatcg tgtaggcgtg 720
agggtttcac cagcaataga tcatcttgac gccatggact ctaatccact cactttaggc 780
ttagcagttg ttgaaagact aaacaaaatc cagctccaat ttgattccaa acttgcctat 840
ctccatgtga cacagccacg atatgttgcc tatgggcaaa ccgaagcagg cagacctggc 900
agtgaagagg aggaggcaca tttaatgagg actttgagaa acgcatatca ggggacgttc 960
atttgcagtg gcggatacac tagggagctt ggaattgagg ctgtggcaca gggtgatgct 1020
gatctcgtgt catacggtcg tcttttcatc tctaatcctg atttggtaac gagattgaag 1080
cttaatgcac ctctaaataa gtataatagg aagacattct atactcaaga tccgattgtg 1140
ggatacacag attacccttt ccttcaagga aatggaagca atgtaccgtt gtcgcgtctg 1200
tga 1203
<210> 4
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(247)
<400> 4
Met Ala Thr Ala Ser Ser Ala Thr Ala Ala Leu Arg Ala Thr Ile Ser
1 5 10 15
Ser Ser Ser Tyr Lys Leu Pro Ser Thr Phe Thr Thr Ser Val Ser Gln
20 25 30
Lys Ile Gln Ser Phe Lys Leu Pro Asn Pro Leu Ile Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Lys Leu Ser Thr Ser Thr Thr Thr Ser Arg Ser Phe Ser Cys Lys Ser
50 55 60
Gln Ser Ser Ser Thr Asp Ser Thr Ser Gly Lys Val Gln Glu Ile Ser
65 70 75 80
Ile Tyr Glu Leu Asn Glu Arg Asp Arg Gly Ser Pro Ala Tyr Leu Arg
85 90 95
Leu Ser Gln Lys Ser Val Asn Ser Leu Gly Asp Leu Val Pro Phe Ser
100 105 110
Asn Lys Leu Tyr Thr Ala Asp Leu Lys Lys Arg Ile Gly Ile Thr Ala
115 120 125
Gly Pro Cys Ile Leu Ile Lys Arg Glu Glu Glu Lys Lys Gly Asp Arg
130 135 140
Tyr Glu Ala Ile Tyr Ser Phe Tyr Phe Gly Glu Tyr Gly His Met Thr
145 150 155 160
Val Gln Gly Pro Tyr Leu Thr Tyr Glu Asp Thr Tyr Leu Ala Val Thr
165 170 175
Gly Gly Ser Gly Ile Phe Glu Gly Val Thr Gly Gln Val Lys Leu Gln
180 185 190
Gln Ile Ile Phe Pro Phe Lys Leu Phe Tyr Thr Phe Tyr Leu Lys Gly
195 200 205
Ile Pro Asp Leu Pro Ser Glu Leu Val Cys Thr Ala Val Pro Pro Ser
210 215 220
Pro Thr Val Glu Pro Thr Pro Glu Ala Lys Ala Cys Glu Glu Gly Ala
225 230 235 240
Ala Leu Asn Asn Phe Thr Asp
245
<210> 5
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(510)
<400> 5
Met Ala Ser Thr Ser Phe Ala Leu Pro Ser Leu Lys Leu Gln Phe Pro
1 5 10 15
Ser His Lys Pro Ser Ser Ser Cys Thr Asn Ser Ser Ser His Gln Val
20 25 30
Ile Val Arg Ser Ile Lys Asp Ser Val Ser Glu Arg Pro Pro Phe Ile
35 40 45
Ser Ser Pro Pro Val Lys Pro Thr Lys Leu Pro Thr Arg Lys Val Pro
50 55 60
Gly Asp Tyr Gly Leu Pro Leu Val Gly Pro Trp Lys Asp Arg Leu Asp
65 70 75 80
Tyr Phe Tyr Asn Gln Gly Lys Asn Glu Phe Phe Lys Ser Arg Ile Gln
85 90 95
Lys His Gln Ser Thr Val Phe Arg Thr Asn Met Pro Pro Gly Pro Phe
100 105 110
Ile Ser Phe Asn Pro Asn Val Val Val Leu Leu Asp Gly Lys Ser Phe
115 120 125
Pro Thr Leu Phe Asp Val Ser Lys Val Glu Lys Lys Asp Leu Phe Thr
130 135 140
Gly Thr Phe Met Pro Ser Thr Glu Leu Thr Gly Gly Tyr Arg Val Leu
145 150 155 160
Ser Tyr Leu Asp Pro Ser Glu Pro Asn His Ala Lys Leu Lys Lys Leu
165 170 175
Met Phe Tyr Leu Leu Ser Ser Arg Arg Asn Glu Val Ile Pro Glu Phe
180 185 190
His Asn Ser Tyr Glu Lys Gly Lys Ala Gly Leu Asn Ser Gly Asn Asp
195 200 205
Gln Ala Ala Phe Asn Phe Leu Ala Arg Ser Leu Phe Gly Val Asn Pro
210 215 220
Val Glu Thr Lys Leu Gly Gly Asp Gly Pro Thr Leu Ile Gly Lys Trp
225 230 235 240
Val Leu Leu Gln Leu His Pro Val Leu Thr Leu Gly Leu Pro Lys Phe
245 250 255
Leu Asp Asp Leu Ile Leu His Thr Phe Arg Leu Pro Pro Phe Leu Val
260 265 270
Lys Lys Asp Tyr Gln Arg Leu Tyr Asp Phe Phe Tyr Thr Asn Ser Ala
275 280 285
Asn Leu Phe Val Glu Ala Glu Lys Leu Gly Ile Ser Lys Glu Glu Ala
290 295 300
Cys His Asn Leu Leu Phe Ala Thr Cys Phe Asn Ser Phe Gly Gly Met
305 310 315 320
Lys Ile Phe Phe Pro Asn Met Met Lys Ser Ile Ala Lys Ala Gly Val
325 330 335
Glu Val His Thr Arg Leu Ala Asn Glu Ile Arg Ser Glu Val Lys Ser
340 345 350
Ala Gly Gly Lys Ile Thr Met Ser Ala Met Glu Lys Met Pro Leu Met
355 360 365
Lys Ser Val Val Tyr Glu Ala Leu Arg Val Asp Pro Pro Val Ala Ser
370 375 380
Gln Tyr Gly Arg Ala Lys Gln Asp Leu Thr Ile Glu Ser His Asp Ala
385 390 395 400
Val Phe Glu Val Lys Lys Gly Glu Met Leu Phe Gly Tyr Gln Pro Phe
405 410 415
Ala Thr Lys Asp Pro Lys Ile Phe Asp Arg Pro Glu Glu Phe Val Ala
420 425 430
Asp Arg Phe Val Gly Glu Glu Gly Glu Lys Leu Leu Lys Tyr Val Leu
435 440 445
Trp Ser Asn Gly Pro Glu Thr Glu Ser Pro Thr Val Gly Asn Lys Gln
450 455 460
Cys Ala Gly Lys Asp Phe Val Val Met Val Ser Arg Leu Phe Val Thr
465 470 475 480
Glu Phe Phe Leu Arg Tyr Asp Thr Phe Asn Val Asp Val Gly Thr Ser
485 490 495
Ala Leu Gly Ala Ser Ile Thr Ile Thr Ser Leu Lys Lys Ala
500 505 510
<210> 6
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工系列
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(400)
<400> 6
Met Ala Asn Thr Thr Ser Ser Ser Ala Lys Asp Gly Ser Asn Ser Leu
1 5 10 15
Phe Ser Pro Tyr Lys Met Gly Lys Phe Asn Leu Ser His Arg Val Val
20 25 30
Leu Ala Pro Met Thr Arg Cys Arg Ala Leu Asn Ser Ile Pro Gln Val
35 40 45
Ala Leu Val Glu Tyr Tyr Gly Gln Arg Ala Thr Asp Gly Gly Phe Leu
50 55 60
Ile Thr Glu Gly Thr Met Ile Ser Pro Ser Ser Ala Gly Phe Pro His
65 70 75 80
Val Pro Gly Ile Phe Thr Lys Glu Gln Val Glu Ala Trp Lys Lys Ile
85 90 95
Val Asp Val Val His Ala Lys Gly Ser Val Ile Phe Cys Gln Leu Trp
100 105 110
His Val Gly Arg Ala Ser His Glu Val Tyr Gln Pro Gly Gly Ala Ala
115 120 125
Pro Ile Ser Ser Thr Glu Lys Pro Ile Ser Lys Arg Trp Arg Ile Leu
130 135 140
Met Pro Asp Gly Thr Tyr Gly Ile Tyr Pro Lys Pro Arg Ala Leu Gly
145 150 155 160
Thr Asn Glu Ile Ser Gln Val Val Glu Asp Tyr Arg Lys Ala Ala Leu
165 170 175
Asn Ala Ile Glu Ala Gly Phe Asp Gly Ile Glu Ile His Gly Ala His
180 185 190
Gly Tyr Leu Ile Asp Gln Phe Leu Lys Asp Gly Ile Asn Asp Arg Thr
195 200 205
Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Leu Thr Asn Arg Cys Lys Phe Ile Thr Gln
210 215 220
Val Val Gln Ala Val Val Thr Ala Ile Gly Ala Asp Arg Val Gly Val
225 230 235 240
Arg Val Ser Pro Ala Ile Asp His Leu Asp Ala Met Asp Ser Asn Pro
245 250 255
Leu Thr Leu Gly Leu Ala Val Val Glu Arg Leu Asn Lys Ile Gln Leu
260 265 270
Gln Phe Asp Ser Lys Leu Ala Tyr Leu His Val Thr Gln Pro Arg Tyr
275 280 285
Val Ala Tyr Gly Gln Thr Glu Ala Gly Arg Pro Gly Ser Glu Glu Glu
290 295 300
Glu Ala His Leu Met Arg Thr Leu Arg Asn Ala Tyr Gln Gly Thr Phe
305 310 315 320
Ile Cys Ser Gly Gly Tyr Thr Arg Glu Leu Gly Ile Glu Ala Val Ala
325 330 335
Gln Gly Asp Ala Asp Leu Val Ser Tyr Gly Arg Leu Phe Ile Ser Asn
340 345 350
Pro Asp Leu Val Thr Arg Leu Lys Leu Asn Ala Pro Leu Asn Lys Tyr
355 360 365
Asn Arg Lys Thr Phe Tyr Thr Gln Asp Pro Ile Val Gly Tyr Thr Asp
370 375 380
Tyr Pro Phe Leu Gln Gly Asn Gly Ser Asn Val Pro Leu Ser Arg Leu
385 390 395 400。

Claims (1)

1.一种利用枸杞茉莉酸代谢途径重要酶基因提高植物抗逆性的方法，该植物为拟南芥，其特征在于包括的步骤：
将阳性拟南芥用200uMNaCl/0.5cm打孔器/4℃/处理后，在0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、24h小时取叶片；叶片RNA 的分离 采 用 RNeasy Plant Mini Kit试剂盒,用分光光度计测定OD260 和OD280 值，根 据OD260/OD280值判断RNA的质量，用琼脂糖凝胶电泳检测的RNA的完整性；RNA提取按照该试剂盒说明书进行；具体步骤为：
1）称取100 mg的枸杞叶片，在液氮中研磨至细粉末状，转到RNase-free、液氮预冷的2mL离心管中，使液氮挥发，但样品不能解冻；
2）加入450 μL含有v/v 的1%β-巯基乙醇的RLT Buffer，用力振荡，56 ℃水浴1-3 min；
3）将裂解液转移至放在2 mL收集管上的紫色QIAshredder离心柱上，12000 r/min，离心2 min，弃掉离心柱，将上清液转移至新的离心管中；
4）加入200 μL的100%乙醇到裂解液中，用移液器快速混匀；
5）将混匀后的溶液转移至放在2 mL收集管上的粉色RNeasy离心柱上，12000 r/min，离心15 s，弃掉滤液；
6） 加入700 μL的RW1 buffer到粉色RNeasy离心柱中，12000 r/min，离心15 s，弃掉滤液；
7）加入500 μL的RPE Buffer到粉色RNeasy离心柱中，12000 r/min，离心15 s，弃掉滤液；
8）加入500 μL的RPE Buffer到粉色RNeasy离心柱中，12000 r/min，离心2 min，小心移走2 mL收集管；
9） 将粉色RNeasy离心柱转移至新的2 mL收集管中，12000 r/min，离心1 min；
10）再将粉色RNeasy离心柱转移至新的1.5 mL收集管中，加入50 μL RNase-free的无菌水，12000 r/min，离心1 min；
11） 将步骤10）中收集管内收集到的液体再次转移至粉色RNeasy离心柱中，12000 r/min，离心1 min；
12）取2 μL枸杞叶片总RNA在含有2%甲醛的w/v为 0.7%的琼脂糖凝胶中检测，测定RNA浓度；
用TransScriptTM one –step gDNA Rmoval and cDNA synthesis SuperMIx合成cDNA第一链；反应体系为：TotalRNA 5ul,Random Primer，0.1ug/ul， 1ul，2×TSReaction Mix10ul,TransScriptTM 1ul，gDNA Remover 1ul，RNase-free Water 2ul；反应条件为25℃10min，42℃ 30min，85℃ 5min；
将合成的cDNA稀释10倍后作为模板；设计引物qPCRAOS15’-AGCAACCATTTCTTCTTCCT
CG-3’,qPCRAOS25’-GTCACGTTCATTGAGCTCGT-3’,qPCRAOC1:5’-GATCTTGTCCCCTTCAGCAA-3’，qPCRAOC2：5’-AGATCTTGTCCCCTTCAGCA-3’，qPCROPR1:5’-TCATCTTGACGCCATGGACT
-3’，qPCROPR2:5’-ATGTGCCTCCTCCTCTTCAC-3’用TransStartTM Top Green qPCRSuperMix做RT-qPCR；反应体系为：Forward Primer，10uM， 0.5ul，Reverse Primer，10uM，0.5ul，2×TransStartTM Top Green qPCR SuperMix 12.5ul，passive Reference Dye，0.5ul Template 1ul ；反应条件为 94℃ 30s,94℃ 5s ，60℃ 15s，72℃ 10s，40个循环；
处理数据后得到结果说明盐、低温、受伤处理后茉莉酸代谢途径三个关键酶基因LmAOS/AOC/OPR表达量提高，而且转基因拟南芥比非转基因拟南芥的长势好。
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