CN105287685B

CN105287685B - 天目琼花醇提物在制备治疗动脉粥样硬化性疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN105287685B
Application number: CN201510482073.3A
Authority: CN
Inventors: 张颖; 秦树存; 姚树桐; 司艳红
Original assignee: Taishan Medical University
Current assignee: Taishan Medical University
Priority date: 2015-08-10
Filing date: 2015-08-10
Publication date: 2019-01-08
Anticipated expiration: 2035-08-10
Also published as: CN105287685A

Abstract

本发明公开了一种天目琼花醇提物在制备治疗外源性动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)性疾病药物中的应用。本发明采用高脂饮食诱导apoE^‑/‑小鼠AS模型，以C57BL/6J小鼠为空白对照，辛伐他汀用药组作为阳性对照，灌胃给予天目琼花醇提物12周后，观察天目琼花对AS的影响，并探索相应机制。结果显示，天目琼花醇提物明显降低了血清中脂质水平，抑制了氧化应激与炎症反应，减轻了高脂饮食诱导的apoE^‑/‑小鼠主动脉壁的脂质蓄积和动脉硬化斑块的形成，抑制了AS的发生与发展。本发明既开发了天目琼花醇提物的新用途，又为治疗AS提供了一条新途径。

Description

天目琼花醇提物在制备治疗动脉粥样硬化性疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及天目琼花应用领域，具体为一种天目琼花醇提物在制备治疗动脉粥样硬化性疾病药物中的应用。

背景技术

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是严重危害人类健康的常见病与多发病，易损斑块的形成与破裂是造成AS病变晚期临床急性症状的主要原因。大量流行病学调查和实验研究表明，高血脂、吸烟、糖尿病、高血压、性别差异等都是与AS发生有关的危险因素，Richard等认为高脂血症(Hyperlipidemia，HLP )是致AS的直接原因和首要危险因素。其中血清胆固醇尤其是低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平与AS的发生呈正相关。Berliner 等研究发现LDL-C能在血浆中或动脉内膜下经自由基引发的脂质过氧化而转变为氧化低密度脂蛋白(ox- LDL - C)，ox-LDL-C是内皮损伤的关键成分，同时也是内皮炎症因子的潜在诱导物，启动动脉粥样硬化损伤。人血管内皮在AS发展过程中起关键作用，抗炎药物可以调节血管内皮的功能，并表现出一定的抗AS药理作用。在AS进程中，巨噬细胞凋亡不仅直接导致凋亡的平滑肌细胞和巨噬细胞不能被有效吞噬，促进脂质核心的形成及增大，而且富含游离胆固醇的凋亡巨噬细胞通过释放基质降解蛋白酶损伤纤维帽，并产生肿瘤坏死因子-α、白介素-1β等炎症因子，引起继发性炎症反应和坏死，从而促进斑块不稳定。

因此，限制胆固醇吸收，降低非高密度脂蛋白（non-HDL），升高高密度脂蛋白（highdensity lipoprotein, HDL），抑制氧化应激水平及动脉壁炎症已成为防治AS的重要手段。内皮细胞炎症反应的调节可能作为寻找抗动脉粥样硬化药物研究的靶点。因此研究防治措施和寻找有效治疗药物是全世界极为重视的研究领域，中药在防治高脂血症和心脑血管疾病方面有着独特的优势，因其疗效肯定、持续、副作用小而成为首选的治疗药物。

天目琼花(Viburnum.sargentii koehne)也称鸡树条子、鸡树条荚蒾和山绣球等，为忍冬科(Caprifoliaceae) 荚蒾属(ViburnumL.)落叶灌木，生于山坡、灌丛和路旁等地，原产于东北、华北等地。果实及枝叶均可入药，主要用于抗抽搐、抗痉挛、镇静及兴奋子宫。我国民间流传许多关于天目琼花的配方，用于治疗咳嗽、疮疥和腰腿痛等，因此可大力挖掘其药用价值。研究证实，天目琼花富含多种有效成分，果实营养丰富，黄酮和萜类物质作为其主要成分，具有显著的抗氧化和抗炎作用。

发明内容

本发明的目的是针对目前动脉粥样硬化缺乏高效又安全的药物，提供传统中药天目琼花醇提物在制备治疗动脉粥样硬化疾病药物中的新用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

天目琼花醇提物在制备治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用。

天目琼花醇提物在制备治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用，所述醇提物的提取方法为：所述醇提物的提取方法为：将天目琼花果实常温晒干，然后研磨成40目粗粉，取500g粉末于95%的乙醇中提取，所述粉末的质量与乙醇的体积比为1：10，醇提物过滤后浓缩成浸膏，每克浸膏相当于3.49g生药，然后将浸膏用5%的羧甲基纤维素钠分别配制成2.5 g生药/ml, 5.0g生药/ml, 10.0g生药/ml，4℃保存备用。

天目琼花醇提物在制备治疗外源性动脉粥样硬化药物中的应用

所述的动脉粥样硬化疾病是指高脂饮食诱导的高脂血症、氧化应激或炎症等因素引起的动脉粥样硬化性疾病。

本发明开发了一种防治动脉粥样硬化疾病的新药物：天目琼花醇提物，本发明采用高脂饮食诱导的apoE-/-鼠AS模型，以辛伐他汀作为阳性对照药，灌胃给予天目琼花醇提物12周后，观察对血脂和AS斑块的影响，实验结果发现，天目琼花醇提物对防治动脉粥样硬化疾病有明显的效果；

本发明还发现了天目琼花醇提物的新用途：治疗动脉粥样硬化疾病，进一步挖掘了天目琼花的生物活性，扩大了该中药的应用范围；

天目琼花醇提物制备方法简单，成本较低，且毒副作用小，具有良好的治疗动脉粥样硬化疾病的优势。

附图说明

图1 天目琼花醇提物对apoE^-/-小鼠血脂的影响。天目琼花醇提物显著降低apoE^-/-小鼠血浆中总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL-C)水平，显著升高高密度脂蛋白(HDL-C)水平，甘油三酯(TG)水平无显著性差异；( mean±SD，n = 8)。^** P < 0.01 vs CD 组； ^# P < 0.05， ^## P < 0.01vs HFD 组；CD，空白对照组；HFD，高脂模型组；SV，辛伐他汀组；TQ-L，天目琼花低剂量组；TQ-M，天目琼花中剂量组；TQ-H，天目琼花高剂量组；

图2 天目琼花显著减轻apoE^-/^-小鼠血浆中白介素-6（IL-6)，肿瘤坏死因子（TNF-α)，C-反应蛋白（CRP)等炎症因子的表达；( mean±SD，n = 8)；^** P < 0.01 vs CD 组； ^# P < 0.05， ^## P < 0.01vs HFD 组；CD，空白对照组；HFD，高脂模型组；SV，辛伐他汀组；TQ-L，天目琼花低剂量组；TQ-M，天目琼花中剂量组；TQ-H，天目琼花高剂量组；

图3 在高脂喂饲的apoE^-/-小鼠中，天目琼花醇提物显著抑制了动脉壁脂质沉积与动脉粥样硬化斑块的形成，减轻了动脉壁损伤(n=8)；给予天目琼花醇提物12周后，通过油红O染色显示动脉壁的损伤情况；CD，空白对照组；HFD，高脂模型组；SV，辛伐他汀组；TQ-L，天目琼花低剂量组；TQ-M，天目琼花中剂量组；TQ-H，天目琼花高剂量组；A，主动脉全长；B，心脏底部；C，斑块面积。

具体实施方式

一、材料和方法

（一）天目琼花醇提物的制备

天目琼花果实采自泰山，由泰山医学院中药学资深专家李同德教授鉴定。天目琼花果实常温晒干后研磨成40目粗粉，取500g粉末于95%的乙醇（M：V=1：10)中提取。醇提物过滤后浓缩成浸膏(3.49g生药/g)，然后将浸膏用5%的羧甲基纤维素钠分别配制成2.5 g生药/ml, 5.0g生药/ml, 10.0g生药/ml，4℃保存备用。

（二）动物分组及处理

40只雄性apoE^-/-小鼠(20±2g, 7周龄)购自北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号：SCYK(京)2014-0004]，适应性饲养1周后随机分为5组：

模型组（高脂饮食：10%猪油+10%蛋黄粉+ 0.30%胆固醇+普通饲料）；

天目琼花低剂量组（高脂饮食+2.5g生药/kg/d）；

天目琼花中剂量组（高脂饮食+5g生药/kg/d）；

天目琼花高剂量组（高脂饮食+10g生药/kg/d）；

辛伐他汀组（高脂饮食+辛伐他汀20mg /kg/d），每组8只动物。

另取8只C57BL/6J雄性小鼠作为空白对照组（普通饮食）；

天目琼花和辛伐他汀均溶于5%的羧甲基纤维素钠中，其终浓度分别为天目琼花2.5 g生药/ml,（5.0g生药/ml, 10.0g生药/ml和辛伐他汀20.0g生药/ml，小鼠灌胃12周。

12周末，动物禁食12小时，称取小鼠体重，乌拉坦麻醉麻后内眦取血，离心后取血清备用。取肝脏生理盐水清洗后称重，心脏底部亦用冰生理盐水清洗后立刻OCT包埋，放于−80℃保存备用，取主动脉全长，−80℃保存，用于油红O染色。

（三）小鼠体重与肝脏重量分析

用药12周后，称取小鼠称量体重和肝重，分析天目琼花对高脂饮食小鼠体重和肝重的影响。

（四）血脂分析

小鼠用药12周后，取小鼠血清，根据说明书（中生北控生物科技有限公司），酶法(Biosino)测定血浆总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白（LDL-C）和甘油三酯(TG)含量，观察天目琼花对小鼠血脂的影响。

（五）天目琼花对氧化应激水平的影响

氧化应激是动脉粥样硬化发生发展的重要因素，它的水平可通过脂质过氧化产物丙二醛（MDA）反映，同时活性氧的毒性作用可被抗氧化剂如超氧化物歧化酶（SOD）拮抗。血浆SOD、MDA的活性反映了氧化应激的反应程度。取小鼠血清，根据试剂说明书（南京建成科技有限公司）使用酶标仪检测SOD和MDA活性。

（六）炎症因子检测

小鼠用药12周后，取血，根据说明书（赛默飞生物科技有限公司），采用Elisa方法检测血清中炎症因子白介素-6（IL-6）、肿瘤活性因子（TNF-α）、C-反应蛋白（CRP)含量表达。

（七）动脉斑块沉积情况分析

为了检测天目琼花对动脉粥样硬化斑块的影响，取apoE^-/-小鼠主动脉全长，采用油红O染色技术，检测动脉壁沉积情况，同时取心脏底部切片，油红O染色，观察主动脉损伤情况。

（八）统计学分析

统计学分析用GraphPad Prism programme ver.4.0进行单因素方差分析检验，结果显示为平均值±标准差，P﹤0.05为有显著性差异。

二、结果

（一）天目琼花醇提物明显降低了高脂诱导apoE^-/-小鼠的体重和肝重。

实验开始前，小鼠随机分为6组，各组体重无明显差别。喂饲高脂饲料12周后，模型组apoE^-/-小鼠体重、肝重均明显升高（P﹤0.01）。与模型组相比，天目琼花醇提物可明显降低小鼠体重和肝重，其作用明显强于辛伐他汀（表1）。

表1天目琼花对高脂喂饲apoE^-/-小鼠体重、肝重及肝脏指数的影响(means ± SD,n=8)

组别	肝重 (g)	体重(g)	肝脏指数（%）
				CD	1.20±0.17	29.12±1.15	4.12±0.15
HFD	1.50±0.43*	33.28±5.58*	4.51±0.20
				SV	1.27±0.13<sup>#</sup>	29.71±1.96<sup>#</sup>	4.27±0.16
TMQH-L	1.15±0.17<sup>##</sup>	29.12±2.12<sup>#</sup>	3.95±0.18
				TMQH-M	1.20±0.23<sup>#</sup>	28.58±1.06<sup>#</sup>	4.20±0.21
TMQH-H	1.10±0.19<sup>##</sup>	27.35±2.12<sup>##</sup>	4.02±0.23

^* P < 0.05 vs CD 组； ^# P < 0.05， ^## P < 0.01 vs HFD 组。CD，空白对照组；HFD，高脂模型组；SV，辛伐他汀组；TMQH-L，天目琼花低剂量组；TMQH-M，天目琼花中剂量组；TMQH-H，天目琼花高剂量组。

（二）天目琼花醇提物对apoE^-/-小鼠血脂的影响

由图1可知，高脂喂饲12周后，模型组apoE^-/-小鼠血浆中TC、LDL-C水平均明显升高（P﹤0.01）。给予低、中、高剂量天目琼花醇提物后，TC分别降低了14.89%，15.51%和22.76%。LDL-C水平分别降低了14.48%，15.25%和22.42%。同时，天目琼花低、中、高剂量组HDL-C分别升高了8.02%，16.25%和51.86%，而天目琼花对TG水平无影响。

（三）天目琼花醇提物降低了血浆中氧化应激水平和炎症因子表达。

MDA为脂质过氧化产物，它是反映体内氧化应激水平的最常用检测指标，SOD为抗氧化剂。由表2可知，喂饲高脂饲料12周后，血浆内MDA含量明显升高，SOD活性明显降低。和模型组相比，天目琼花低、中、高剂量组中MDA水平分别降低20.03%，27.09%和32.72%；SOD活性分别升高7.78%，9.67%和12.75% （表2）。

表2 天目琼花对apoE^-/-小鼠血浆中SOD， MDA 活性的影响 (means ± SD,n=8)

组别	SOD (U/ ml)	MDA(nmol/l)
			CD	183.92±19.05	25.92±7.13
HFD	164.65±20.61*	36.95±4.81*
			SV	185.80±7.43<sup>#</sup>	22.26±1.50<sup>##</sup>
TMQH-L	177.45±11.62<sup>#</sup>	29.55±4.18<sup>##</sup>
			TMQH-M	180.57±5.61<sup>#</sup>	26.94±3.89<sup>##</sup>
TMQH-H	184.65±28.92<sup>#</sup>	24.86±3.65<sup>##</sup>

^* P < 0.05 vs CD 组；^# P < 0.05， ^## P < 0.01vs HFD 组。CD，空白对照组；HFD，高脂模型组；SV，辛伐他汀组；TMQH-L，天目琼花低剂量组；TMQH-M，天目琼花中剂量组；TMQH-H，天目琼花高剂量组。

除此之外，炎症贯穿于血管壁动脉粥样硬化的发生和发展过程中。促炎因子-肿瘤坏死因子-α（TNF-α），在血浆中可激活NF-κB 并刺激活性氧的产生。血浆中重要的炎性介质--白介素-6（IL-6），在血管***中发挥重要作用。急性应激蛋白-C型反应蛋白（CRP），在血浆炎症状态下可刺激TNF-α和IL-6的表达。研究中利用Elissa 方法检测了血浆中3种重要炎症因子的含量。相比于空白对照组，高脂饮食诱导增强了上述炎症因子的表达，差异显著(P<0.01 )。由图2可见，模型组血浆中IL-6，TNF-α和CRP水平显著升高（P<0.01)，用药12周后，天目琼花低、中、高剂量组IL-6分别下降10.40%，18.63%和20.91%；TNF-α下降11.20%，11.25%和17.92%；CRP分别下降12.41%，23.45%和18.62%(P<0.01或P<0.05 )。

（四）天目琼花显著降低apoE^-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块的形成

由图3可见，空白对照组主动脉结构正常，几乎无脂质沉积和斑块形成。高脂饮食12周后，模型组主动脉内壁脂质斑块形成显著。用药天目琼花12周后，低、中、高剂量组剂量依赖性地抑制了脂质的沉积和斑块的形成，其中高剂量组显著改变了动脉斑块的形成和主动脉壁损伤（P<0.01）（图3A,B,C)。

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims

1.天目琼花醇提物在制备治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用，其特征在于，所述醇提物的提取方法为：将天目琼花果实常温晒干，然后研磨成 40 目粗粉，取 500g 粉末于95% 的乙醇中提取，所述粉末与乙醇的质量体积比为 1 ：10，醇提物过滤后浓缩成浸膏，每克浸膏相当于 3.49g 生药，然后将浸膏用 5% 的羧甲基纤维素钠分别配制成 2.5 g生药 /ml, 5.0g 生药 /ml, 10.0g 生药 /ml，4℃保存备用。

2.如权利要求1所述的天目琼花醇提物在制备治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用，其特征在于：所述动脉粥样硬化疾病为外源性动脉粥样硬化。