CN105267947A - 一种新的耐辐射球菌PprI蛋白的用途及药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及PprI蛋白的用途及药物。本发明提供了PprI蛋白在制备防治高等真核生物辐射损伤药物中的应用。本发明研究发现PprI蛋白对人类细胞和小鼠急性放射损伤具有至关重要的防治作用，并增强了抗氧化和DNA损伤修复能力。

Description

一种新的耐辐射球菌PprI蛋白的用途及药物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及PprI蛋白的用途及药物。

背景技术

电离辐射在工业、农业、国防和医学的应用，在给人类社会带来巨大裨益的同时，来源于核事故、肿瘤放射治疗、航天以及其他核突发事件的大剂量电离辐射可引起人类严重的急性放射损伤(ARIs)，并且导致极高的死亡率。ARIs的有效防治是国际放射损伤领域的一个巨大的挑战，关系到国家的核安全，受到欧美等各国政府的高度关注，辐射损伤的救治与防护已成为各国研究的热点。因此，研究开发抗辐射损伤药物，在现代医药保健事业中已经受到人们的极大重视。

目前，抗辐射损伤药物主要包括氨琉基类辐射防护剂、细胞因子类药物、激素类药物、中草药类药物、金属硫蛋白、海洋生物成分药物等。

氨琉基类化合物是研究历史较长且效果较好的一类辐射防护剂。氨乙基异硫脲(Aminoethylisothiourea，AET)就是半胱胺的琉基被脒基取代的衍生物。AET防护作用时间较半胱胺长，且能口服，预防效果较好。缺点是无论口服或注射给药副作用均较大。

IL-1是第1个被证明具有辐射防护作用的细胞因子，早在1986年就发现预先腹腔注射IL-1可以减轻电离辐射对小鼠的致死效应，并且具有剂量依赖性。具有辐射防护作用的细胞因子还包括G-CSF、GM-CSF、IL-11、SCF、PF4等。然而这些细胞因子的缺点是在体内寿命极短，只有数秒或几小时，增加用量或用药频率，会产生严重的毒副作用。

天然甾体激素(如***)或人工合成的非甾体激素(如已烷雌酚、已烯雌酚等)，在动物实验中都显示一定程度的辐射防护作用，而且辐照前后给药都有效果。注射***、雌三醇等，能提高小鼠受照后的存活率，延缓放射病症状的出现时间，减轻症状的严重程度，对骨髓造血细胞具有明显的辐射防护作用，并能促进它们的恢复。

经过多年的研究，人们发现具有清热解毒、活血化瘀、补血益气、养阴升白的中药均有不同程度的抗辐射作用，如人参、灵芝、白藜芦醇等，且中药药源广、毒性低，使其在抗辐射损伤药物的研究中显示出巨大的优势和潜力。金属硫蛋白(Metallothioneins，MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸、结合有金属的非酶蛋白。据报道，口服MT能够延长一次性大剂量电离辐射小鼠的存活时间，降低一次性大剂量和多次小剂量电离辐射对免疫***的损伤。小鼠辐照后给予含MT的蛋白奶后，小鼠白细胞数、淋巴细胞增殖率和骨髓细胞DNA含量较单纯照射组均明显增高。

近年来，在抗辐射药物研究方面，人们开始把目光投向海洋生物。王玉贞等首次就扇贝多肽对⁶⁰Co射线辐射损伤胸腺细胞的保护作用进行了研究，发现扇贝多肽对胸腺细胞具有辐射保护作用。进一步研究还发现，扇贝多肽除对电离辐射外，对紫外线辐射损伤小鼠胸腺淋巴细胞液也具有保护作用。扇贝多肽抗辐射作用的机理可能与其抗氧化及提高机体免疫力有关。

近年来，抗辐射损伤药物研究已取得瞩目的成绩，但是仍然存在很多问题，主要问题是药物的疗效和毒性。因此，对毒副作用小、效果显著的抗辐射损伤药物的研发具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了PprI蛋白的用途及药物。本发明研究发现，PprI蛋白对人类细胞和小鼠急性放射损伤具有至关重要的防治作用，并增强了抗氧化和DNA损伤修复能力。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了PprI蛋白在制备防治高等真核生物辐射损伤药物中的应用。

耐辐射球菌是迄今为止地球上发现的抗辐射能力最强的非致病菌。因其具有高效的DNA损伤修复能力，它对电离辐射、紫外线、干燥等极端环境的抗性引起全球辐射生物学家的关注。耐辐射球菌保护自己免受辐射损害的具体机制仍未阐明，目前的研究表明，紧密的环状染色体结构和DNA双链断裂的修复作用在它的辐射抗性中起着至关重要的作用。

pprI基因在耐辐射球菌辐射损伤诱导的DNA修复中起着中心调控的作用。它的表达产物PprI蛋白刺激了受照后recA和其他DNA损伤修复基因的转录。蛋白质组学分析表明，在电离辐射刺激后，PprI蛋白作为一个调控开关，上调了31种蛋白，其中RecA和PprA因其在DNA复制和修复中的重要作用而倍受关注。PprI蛋白在大肠杆菌中的表达能够刺激受照大肠杆菌recA基因转录增加，增强过氧化氢酶的活性。此外，pprI基因在酵母中的表达可增强酵母菌株对极端环境的抵抗能力并且增加乙醇的产量。

毫无疑问，耐辐射球菌是一种原核生物。由于几十亿年的生物进化和分化，原核生物与高等真核生物在基因组成、蛋白表达、调控机制、密码子偏爱性等方面已形成了截然不同的两大生物种系。此外，值得注意的是，耐辐射球菌pprI基因与人体和哺乳动物细胞之间并无同源序列。因此，耐辐射球菌发现60年来，国内外有关耐辐射球菌基因及其蛋白质的研究主要局限于原核细胞如耐辐射球菌自身、大肠杆菌以及低等真核生物酵母菌***。

在申请号：201410153614.3的发明专利中【杨占山，吴伟，乔慧萍，文玲，施怡，任丽丽。一种DNA分子及毕赤酵母重组质粒和高效表达耐辐射球菌PprI蛋白的毕赤酵母重组菌。中国发明专利，申请号：201410153614.3。2014】，成功地将优化改造的的耐辐射球菌pprI基因转入毕赤酵母菌株，获得高效表达和纯化的PprI蛋白。然而，由于原核生物与高等真核生物两大种系的巨大差异，以及PprI蛋白只存在于耐辐射球菌中，上述专利在酵母菌中获得的pprI原核蛋白能否应用于高等真核生物人类辐射损伤的防治，其作用效果如何，这些问题迄今在国内外有关文献中尚未见任何报道。本发明研究了毕赤酵母菌表达提纯的PprI原核蛋白作为辐射防护药物在高等真核生物急性放射损伤中的应用。研究发现，原核PprI蛋白对人体细胞和哺乳动物致死性急性放射损伤具有非常显著的预防和救治作用，并阐明了有关作用机理。本发明对于原核和真核两大种系生物存在巨大差异的经典传统理论提出了挑战，在国际辐射防护领域首次实现了耐辐射球菌原核PprI蛋白用于高等真核生物急性辐射损伤防治的这两大种系的重大跨越。

在本发明提供的一些实施例中，防治辐射损伤为提高细胞或机体辐射存活率。

在本发明提供的另一些实施例中，防治辐射损伤为促进受辐射损伤的DNA或组织器官的修复。

本发明还提供了PprI蛋白在制备抗氧化药物中的应用。

在本发明提供的一些实施例中，抗氧化为降低细胞内ROS(活性氧)水平。当细胞暴露于电离辐射或高氧分压时，细胞内氧浓度增加，导致ROS产生，进一步损伤蛋白质、核酸和其他细胞内重要元素。本发明中，PprI蛋白通过降低细胞内ROS水平，从而可提高细胞抗辐射能力及抗氧化能力。

在本发明提供的另一些实施例中，抗氧化为提高SOD、CAT活性，和/或降低丙二醛浓度。

本发明还提供了PprI蛋白在制备Rad51蛋白表达促进剂中的应用。Rad51蛋白在DNA损伤后的修复过程中发挥着引导重组交换的关键作用，PprI蛋白可促进Rad51蛋白表达，从而促进受损DNA的修复。

本发明还提供了一种PprI蛋白药物，包括PprI蛋白。

作为优选，药物的剂型为注射剂。

在本发明提供的一些实施例中，药物还包括药学上可接受的辅料。

本发明提供了PprI蛋白的用途及药物。本发明以人脐静脉内皮细胞和BALB/c小鼠为研究对象，研究了PprI蛋白对γ射线损伤的辐射防护作用及其机理。结果发现PprI蛋白显著增加了受照细胞的存活率、抗氧化能力和DNA损伤的修复能力并且降低了辐射后细胞的凋亡率及γH2AX焦点数；PprI蛋白降低了受照小鼠的死亡率，增加了受照小鼠骨髓细胞克隆形成率以及白细胞和血小板的数量，PprI蛋白同时减轻了受照小鼠多种组织器官的辐射病理学损伤并且增加了某些组织器官的抗氧化能力。这些发现表明，PprI蛋白对人类细胞和小鼠急性放射损伤具有至关重要的防治作用，原核PprI蛋白可作为一种新型的辐射防护药物可用于人类致死性急性辐射损伤的预防和救治，这对于核与辐射事故、核突发事件及肿瘤放射治疗引起的急性放射损伤具有重要应用价值。

附图说明

图1示PCR扩增程序图表；

图2示重组表达质粒pHBM905A-6×His-PprI的构建路线图；

图3示经1％甲醇诱导3天后毕赤酵母转化子培养上清液的SDS-PAGE检测；1道：pHBM905A质粒转化毕赤酵母GS115菌株(阴性对照)；2-9道：pHBM905A-6×His-PprI重组质粒的毕赤酵母GS115菌株转化子1-8号；

图4示毕赤酵母转化子表达产物的Westernblot检测；1道：2号酵母转化子诱导2天的培养上清液；2道：3号酵母转化子诱导2天的培养上清液；3道：3号酵母转化子诱导1天的培养上清液；

图5示目的蛋白的肽质量指纹图谱鉴定图；

图6示表达纯化的PprI融合蛋白用12％SDS-PAGE考马斯亮蓝染色分析图；M：marker；1道：透析后的上清液；2道：流出液；3道：300mMNaCl，20mMImidazole，pH值8.0洗脱组分；4-5道：300mMNaCl，250mMImidazole，pH值8.0洗脱组分；

图7示PprI增加了受4Gyγ射线照射后的HUVEC的存活率，采用CCK-8比色法测定细胞存活率，数据以标示，试验重复三次(n＝3)(P＜0.05，t检验)；

图8示PprI增加了细胞的克隆形成率，数据以标示，数据以标示，试验重复三次(n＝3)(P＜0.05，t检验)；

图9示收集照射后48h细胞，膜联蛋白Ⅴ-FITC和PI-TRITC染色后流式细胞仪分析，数据以标示，试验重复三次(n＝3)(P＜0.05，t检验)，其中1示对照组，2示PBS处理组，3示PprI处理组；在右边的是HUVEC受照后凋亡标记蛋白的Westernblot分析，细胞提取物进行12％SDS-PAGE检测及Bcl-2和Bax抗体的免疫印记检测，β-Actin作为内参蛋白；

图10示在人脐静脉内皮细胞的细胞凋亡图像；A)、B)、C)和D)分别表示PBS处理细胞(未照射)、PprI处理细胞(未照射)、PBS处理细胞(照射4Gy)和PprI处理细胞(照射4Gy)；

图11示在照射后24h用流式细胞仪对ROS水平的测定，细胞照射剂量为4Gy，未处理组的活性氧水平设置为100％，数据以标示，试验重复三次(n＝3)(P＜0.05，t检验)；

图12示照射和未照射24h后HUVEC内的SOD(图12-1)、CAT(图12-2)活性和MDA(图12-3)浓度，细胞照射剂量也是4Gy，数据以标示，试验重复三次(n＝3)(P＜0.05，t检验)；

图13示4Gyγ射线照射后不同组细胞内γH2AX焦点随着时间减少的变化，数据以标示，试验重复三次(n＝3)(P＜0.05，t检验)；

图14示人脐静脉内皮细胞的γH2AX焦点数；

图15示暴露于电离辐射细胞的Rad51蛋白的免疫印迹分析，β-Actin为内参蛋白；

图16示小鼠6Gyγ射线照射后30天内的生存率；

图17示照射后1d、7d、14d、28d、35d白细胞、血小板及淋巴细胞百分比的变化，数据以标示，试验重复三次(n＝3)(P＜0.05，t检验)；

图18示0Gy和4Gy照射后小鼠骨髓细胞的克隆形成率，数据以标示，试验重复三次(n＝3)(P＜0.05，t检验)；

图19示受照射小鼠肝、肺、睾丸和小肠组织的病理学检查：a.Nacl注射组肝组织病理学改变(100×)；b.Nacl注射组肝组织病理学改变(400×)；c.PprI注射组肝组织病理学改变(100×)；d.PprI注射组肝组织病理学改变(400×)；e.Nacl注射组肺组织病理学改变(100×)；f.Nacl注射组肺组织病理学改变(400×)；g.PprI注射组肺组织病理学改变(100×)；h.PprI注射组肺组织病理学改变(400×)；i.Nacl注射组睾丸组织病理学改变(100×)；j.Nacl注射组睾丸组织病理学改变(400×)；k.PprI注射组睾丸组织病理学改变(100×)；L.PprI注射组睾丸组织病理学改变(400×)；m.Nacl注射组小肠组织病理学改变(100×)；n.Nacl注射组小肠组织病理学改变(400×)；o.PprI注射组小肠组织病理学改变(100×)；p.PprI注射组小肠组织病理学改变(400×)；

图20示pprI增强了照射后小鼠的抗氧化活性；a.不同组织中SOD的活性；数据以标示，试验重复三次(n＝3)(P＜0.05，t检验)；b.不同组织中CAT的活性；数据以标示，试验重复三次(n＝3)(P＜0.05，t检验)。

具体实施方式

本发明公开了PprI蛋白的用途及药物，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的PprI蛋白的用途及药物中所用质粒、载体、细胞、引物、仪器等均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1pHBM-PprI表达载体的构建及PprI蛋白的纯化

根据毕赤酵母的密码子偏爱性，设计合成了40对DNA引物，其序列如SEQIDNO：1～40所示，采用全基因合成的方法对pprI基因(GeneID:1798483DR_0167)进行优化改造，并通过设计引物5’-gtcacatcatcaccaccatcatgttccatctgctaacgtttctccac-3’和5’-ggccattattgggcagcatcttgtggttca-3’在其N未端添加一个6×His标签(见图1)，合成的pprI基因的序列见SEQIDNO：81。引物及基因的序列见表1。

表1引物及基因的序列

PCR产物经纯化后克隆到毕赤酵母表达载体pHBM-905A(湖北大学马立新教授惠赠)的CopI和NotI位点构建重组表达质粒pHBM905A-PprI(图2)。将质粒pHBM905A-PprI用SalI酶线性化处理后电转化毕赤酵母GS115菌株并进行扩增和DNA序列分析。含有表达载体的GS115细胞于28℃用BMGY培养基培养48h后用1％的甲醇于28.5℃的BMMY培养基中诱导表达。3d后收集15μL的培养上清液用SDS-PAGE电泳、Westernblot和MALDI-TOF质谱仪检测目的蛋白的表达。与阴性对照菌株相比，5个阳性毕赤酵母转化子的培养上清液中均可见到在分子量为43kDa的位置附近有特异性的表达蛋白质条带(图3)。WesternBlot检测结果显示，目的蛋白能与抗6×His的标签抗体发生特异性结合反应，而且反应强度随甲醇诱导时间的增加而相应增强(图4)。用UltraflexIITOF/TOF质谱仪进行了肽质量指纹图谱(PeptideMassFingerprinting，PMF)检测，并将检测结果输入美国国家生物技术信息中心(TheNationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)的OMOSSA数据库进行分析(图5)。结果显示，该蛋白序列确实是来源于耐辐射奇球菌的DR_0167号蛋白。延长培养后，收集了1L培养上清液，用Ni-NTA柱纯化，一次即可获得2-5mg目的蛋白(图6)。因此，在酵母菌中成功完成PprI蛋白质高效表达和纯化(国际标准：获得大于或等于1mg目的蛋白为高效表达)。

带有His标签的PprI蛋白用Ni-NTA柱(Thermo)进行纯化。用25mM咪唑漂洗柱床后，再用20mM和250mM的咪唑洗脱目的蛋白。PprI蛋白的浓度用BCA试剂盒(Sigma,St.Louis,MO,USA)进行测定。

实施例2PprI蛋白抗辐射作用试验

(一)试验方法

1、细胞增殖试验和克隆存活试验：

细胞增殖试验：

HUVECs购自ScienCell研究实验室，用ECM培养基在37℃、5％CO₂的培养箱内培养。指数生长期的HUVEC以5000个/孔的密度接种于96孔板，每孔100μL，细胞贴壁生长后，换成含终浓度为4μg/mLPprI蛋白的新鲜培养基，于37℃、5％CO₂的培养箱内继续培养6h。用苏州大学辐照中心⁶⁰Co源给予吸收剂量为4Gy的γ射线照射。照后24h取出96孔板，向每孔中加入10μL的CCK-8溶液，将96孔板在培养箱内孵育2h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。每个浓度平行6孔，设立空白对照组，实验重复3次。细胞存活分数＝实验组吸光度/对照组吸光度×100％。

克隆存活试验：将指数生长期的HUVEC分别以100个/皿、500个/皿、1000个/皿、2000个/皿、5000个/皿的密度接种于60mm培养皿中。待细胞贴壁生长后换成含终浓度为4μg/mLPprI蛋白的新鲜培养基，以吸收剂量为0、2、4、6、8Gyγ射线照射，每组设3个平行样，照后更换新鲜培养基继续培养10-14d，待培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃上清，甲醇固定，Giemsa染色后计数大于50个细胞集落数,实验重复三次。细胞克隆形成率(PlatingefficiencyPE)＝(未照射细胞克隆数/接种细胞数)×100％，细胞存活分数(Survivalfraction，SF)＝某一剂量照射组的克隆数/(该组细胞接种数×PE)×100％。根据细胞克隆形成结果，使用Sigmaplot10.0软件按单击多靶模型：S＝1－(1e^-D/D0)^N拟合剂量-存活曲线，得出平均致死剂量D₀、外推值N，准阈剂量D_q＝D₀×lnN和存活分数SF。

2、细胞凋亡试验：

细胞一式三份接种于6孔板中，分别于4Gy照射前6h加入PBS和PprI蛋白。照后48h，细胞用FITC标记的AnnexinV和PI(KeyGen,Nanjing,China)进行染色后避光送流式细胞仪(Beckman-Coulter，Brea，CA，USA)检测。

3、ROS(活性氧类)形成试验：将处于指数生长期的HUVEC以2.0×10⁵个/孔的密度接种于6孔板，待细胞贴壁生长后换成含终浓度为4μg/mL耐辐射球菌PprI蛋白的新鲜培养基(设未照射组、单纯照射组)，于37℃、5％CO₂的培养箱内继续培养6h。每组设三个平行样，实验重复三次。之后给以吸收剂量为4Gyγ射线照射。照后24h吸去培养基，每孔加入1mL稀释好的DCFH-DA(按照1:1000用无血清培养基稀释DCFH-DA，使终浓度为10μmol/L)，在培养箱内孵育20min。用无血清培养基洗涤三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。收集细胞，送流式细胞仪(CytomicsFC500.BeckmanCoulter.USA)检测。

4、SOD、CAT酶活性测定和MDA浓度测定：

细胞一式三份接种于6孔板中，分别于4Gy照射前6h加入PBS和PprI蛋白。照后24h，分别用T-SOD试剂盒、CAT试剂盒和MDA试剂盒测定SOD、CAT活性以及MDA浓度。

5、免疫荧光试验：

细胞接种于6孔板中的玻璃爬片上培养12h，分别于4Gy照射前6h加入PBS和PprI蛋白。细胞用3.7％的多聚甲醛固定30min后每孔加入1％的TritonX100于4℃破膜15min后，之后每孔加入1ml5％的BSA室温封闭1h。取出爬片，滴加anti-γH2AX抗体于4℃孵育过夜后加入TRITC标记的二抗室温封闭1h，用DAPI室温避光染色15min后送激光共聚焦检测。

6、Westernblot：

用鼠源抗Bcl-2一抗、鼠源抗Bax一抗、鼠源抗Rad51一抗、鼠源抗β-Actin一抗和兔抗鼠二抗进行Westernblot分析。

7、小鼠辐射生存率观察：

清洁级纯品种雄性BALB/c小鼠，8-10周龄，由苏州大学医学部动物实验中心提供，随机分为2个对照组和2个实验组，每组10只动物。分别在在照前24h和照后24h肌肉注射NaCl生理盐水或PprI蛋白注射液。小鼠用⁶⁰Co-γ射线全身照射，剂量率为2Gy/min，吸收剂量为6Gy。小鼠照后置无菌室观察30d，每天记录小鼠的死亡情况。

8、骨髓细胞克隆形成试验：

BALB/c小鼠(雄性、8周龄、斯莱克公司、12只每组)分别在照后1h腹腔注射NaCl或PprI蛋白。小鼠用Co-60源照射4Gy，剂量率为2Gy/min。未照射组同样按上述方法注射NaCl或PprI蛋白。7d后处死小鼠，取出骨髓用1640培养基重悬调整细胞密度为2000个/ml。然后细胞与5％琼脂混合形成0.3％半固体琼脂培养基于37℃、5％CO₂的环境下培养14d，计数大于50个细胞的克隆数。

9、外周血细胞计数检测：

不同组小鼠按上述方法照射4Gy。分别于照后1、7、14、28、35d用EDTA管收集血液样本应用全血细胞仪进行计数分析。

10、小鼠组织器官病理学观察：

NaCl和PprI蛋白处理组小鼠的肺、肝、肾和睾丸组织用***固定，石蜡包埋后切片，放在载玻片上，并用苏木精和伊红染色后在光镜下观察。切片由一个专业病理学家进行双盲法观察，以确定辐射组织病理学变化。

11、小鼠不同组织SOD和CAT活性测定：

BALB/c小鼠(雄性、8周龄、斯莱克公司、12只每组)分别按上述方法注射NaCl和PprI蛋白。4Gyγ射线照后48h测定血液、血浆、肝、肾、心脏和骨髓的SOD和CAT活性。

12、统计分析：数据经检验符合正态分布并用方差分析和T检验进行统计学分析。

(二)实验结果

1、PprI蛋白提高HUVECs辐射存活率

本发明研究pprI对人脐静脉内皮细胞HUVECs的抗辐射作用。结果显示，与PBS处理组相比，在4Gyγ射线照射之前加入PprI蛋白显著提高了细胞的存活率(图7)。

应用克隆形成实验【10.PuckT,MarcusP.Actionofx-raysonmammaliancells.JExpMed.103,653–666(1956).】，计数了不同剂量照射后细胞的克隆数并且用多靶单击模型拟合剂量存活曲线，结果表明，与PBS处理组相比，在2Gy和4Gy照射后，PprI蛋白作用组HUVECs的存活率明显增加(图8)。PBS和PprI蛋白作用组的Do值分别为1.5837和1.6597，Dq值分别为0.9936和1.5430，Do值和Dq值越小，说明细胞放射敏感性越高。这些结果表明，PprI蛋白成功提高了HUVECs的辐射抗性。

2、PprI蛋白降低了HUVECs辐射凋亡率

本发明同时测定了假暴露(未照射射线)或暴露于4Gyγ射线后HUVECs的凋亡水平。4Gy电离辐射使PBS作用组细胞的凋亡率显著增高，而PprI蛋白的加入显著降低了细胞凋亡率。Bcl-2蛋白在线粒体凋亡途径中发挥着至关重要的作用，Bcl-2蛋白的过表达可以抑制细胞的破坏。用Westernblot分析了电离辐射后48h凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax)的表达情况。与PBS作用组细胞的表达水平相比，PprI蛋白降低了促凋亡蛋白Bax的表达，促进了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(图9和图10)。这些研究表明，PprI蛋白减轻的细胞凋亡可能与线粒体通道的调控有关。

3、PprI蛋白增强了抗氧化和DNA损伤修复能力

氧化应激是DNA损伤增值的一个关键因素。当细胞暴露于电离辐射或高氧分压时，细胞内氧浓度增加，导致ROS产生，进一步损伤蛋白质、核酸和其他细胞内重要元素。

本发明用荧光探针DCFH-DA检测受照人脐静脉内皮细胞胞内ROS水平。研究结果表明，PprI蛋白可以降低细胞内ROS水平。本发明还研究了受照人脐静脉内皮细胞胞内抗氧化蛋白SOD和CAT的活性(图11)。SOD能降解超氧阴离子为过氧化氢，CAT可以降解由SOD或电离辐射直接产生的过氧化氢。和PBS作用组相比，4Gyγ射线照射后PprI蛋白作用组细胞的SOD和CAT活性显著增加。此外，发现PprI蛋白作用组细胞内脂质过氧化程度显著降低(通过测量细胞内丙二醛-MDA的浓度)，表明PprI蛋白减轻了受照细胞***性的损伤程度(图12)。

γH2AX是DNA双链断裂最早的标记。本发明进一步研究PprI蛋白对γH2AX焦点数形成的影响。与对照组相比，电离辐射后1、2、4、8h，PprI蛋白作用组细胞内γH2AX焦点数显著减少(图13和图14)。

此外，RecA蛋白在耐辐射球菌同源重组的修复中起着关键作用。真核生物的Rad51蛋白与RecA蛋白在结构和功能上都高度同源。与PBS作用组相比，PprI蛋白作用组受照细胞内Rad51的表达量显著增加(图15)。以上结果表明PprI蛋白增强了受照人脐静脉内皮的辐射抗性。

4、PprI增强了受照小鼠的生存率

在上述细胞放射损伤防治研究的基础上，本发明进一步研究PprI蛋白对受6Gy致死剂量γ射线照射后BALB/c小鼠死亡率的影响。研究发现，生理盐水注射组即对照组小鼠在受照后30d内死了9只，生存率为10％；而照前24hPprI蛋白注射组(注射剂量为800μg/㎏体重)小鼠在相同条件下死亡5只，生存率为50％；照后24hPprI蛋白注射组(注射剂量为800μg/㎏体重)小鼠在相同条件下死亡7只，生存率为30％(图16)。这些结果表明，PprI蛋白注射对动物致死性辐射损伤具有显著的防治作用。

此外，本发明检测了在受照后1、7、14、28、35d小鼠外周血细胞中WBC、PLT以及淋巴细胞百分比的变化。和生理盐水作用组相比，在照后第7d，PprI蛋白作用组小鼠WBC计数和淋巴细胞百分比显著增高；在照后第7、14dPLT计数显著增高(图17)。本发明还观察了照后第7d未照射小鼠、生理盐水作用组小鼠和PprI蛋白作用组小鼠骨髓细胞克隆形成率的变化。和生理盐水作用组相比，PprI蛋白作用组小鼠骨髓细胞克隆形成率显著增高(图18)。

5、PprI促进了受照动物组织器官的修复

本发明观察了受照小鼠肝脏、肺脏、睾丸和小肠的组织病理改变。

肝脏：在照后28天，生理盐水作用组小鼠肝组织表现为肝细胞变性坏死，细胞数量减少，细胞核碎裂，肝血窦扩张、充血，中央静脉血管壁脱落，肝小叶组织结构紊乱；而PprI蛋白作用组在照后第28天小鼠肝细胞轻度核***，枯否细胞轻度增加，肝小叶结构和肝血窦基本恢复正常(图19a-19d)。

肺脏：在照后28天，生理盐水作用组小鼠肺组织表现为红细胞渗出及炎性细胞浸润，肺泡间隔明显增厚，血管壁脱落和玻璃样变。而PprI蛋白作用组在照后第28天小鼠肺组织无红细胞渗出及炎细胞浸润，肺泡间隔纤维增生不明显，肺组织结构基本恢复正常(图19e-19h)。

睾丸：在照后28天，生理盐水作用组小鼠睾丸组织表现为间质增宽，生精小管萎缩空泡化，排列紊乱，管壁断裂，生***呈单层排列，恢复缓慢。而PprI蛋白作用组在照后第28天小鼠睾丸组织支持细胞、***及各级***细胞再生，睾丸结构和***完全恢复正常(图19i-19L)。

小肠：在照后14天，生理盐水作用组小鼠小肠组织表现为小肠绒毛结构严重破坏，腺体及粘膜下层细胞坏死、溶解、消失。而PprI蛋白作用组在照后第14天小鼠小肠组织固有层、粘膜下层及粘膜上皮细胞开始增生，基底膜增厚，绒毛结构较完整(图19m-19p)。

6、PprI增强了小鼠的抗氧化能力

本发明测定了PprI对受照小鼠不同器官和组织内SOD和CAT含量的影响。与生理盐水作用组相比，在照后48h，PprI蛋白作用组小鼠红细胞、血浆、肝脏和骨髓的SOD和CAT活性显著增强，而肾脏和心肌细胞的SOD和CAT活性无差异(图20a-20b)。这些结果表明PprI蛋白增强了小鼠某些组织的抗氧化蛋白活性。

总结：

本发明应用一系列生物学和分子生物学方法***地阐明了耐辐射球菌PprI蛋白对受致死剂量照射的人脐静脉内皮细胞和小鼠的辐射防护的作用。本发明进一步优化了PprI蛋白在毕赤酵母中高效表达和纯化方法；发现PprI蛋白对人体细胞和小鼠急性辐射损伤具有显著的预防和治疗作用。在这两个***的研究中，PprI蛋白作用组辐射细胞存活率增加和凋亡率降低。引人注目的是，活性测定结果表明，PprI蛋白可增加真核Rad51蛋白(这是原核DNA修复蛋白RecA的同源蛋白)的表达和调控。此外我们观察到，PprI蛋白增强了受照细胞的抗氧化反应，从而减轻辐射诱导的DNA损伤。总之，本发明耐辐射球菌PprI蛋白对人类细胞和小鼠致死性辐射损伤具有至关重要的防护和救治作用，可作为一种新型有效的原核抗辐射蛋白药物用于人类急性辐射损伤的防治，这对于提高我国应对核与辐射事故、核突发事件的医学应急能力以及降低肿瘤放射患者的辐射毒性作用具有重要意义和应用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.PprI蛋白在制备防治高等真核生物辐射损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述防治辐射损伤为提高细胞或机体辐射存活率。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述防治辐射损伤为促进受辐射损伤的DNA或组织器官的修复。

4.PprI蛋白在制备抗氧化药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗氧化为降低细胞内ROS水平。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗氧化为提高SOD、CAT活性，和/或降低丙二醛浓度。

7.PprI蛋白在制备Rad51蛋白表达促进剂中的应用。

8.一种PprI蛋白药物，其特征在于，包括PprI蛋白。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂。

10.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。