CN105267188A - 10-姜酚在制备防治鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种10-姜酚在制备防治鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用，属于渔药技术领域。本发明首次将10-姜酚应用于制备杀灭鱼类体外寄生虫药物中，特别是用于杀灭多子小瓜虫，在有效剂量范围内即能100％杀灭该虫，起到有效治疗和预防多子小瓜虫病的作用。10-姜酚来源于生姜，属姜科多年生草本植物，是亚洲传统药食两用植物，对人安全，无环境残留。10-姜酚对草鱼的LC₅₀为85.43mg/L，是其杀灭多子小瓜虫最低有效浓度(4mg/L)的21.4倍，使用安全性高。10-姜酚在生姜中含量高，提取制备工艺简单成熟，抗虫活性高，无环境污染和残留，在新型环保绿色渔药领域有着良好应用前景。

Description

10-姜酚在制备防治鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用

技术领域

本发明属于渔药技术领域，具体涉及一种10-姜酚在制备防治鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。

背景技术

鱼类体外寄生纤毛虫病是危害淡水养殖业的严重疾病。多子小瓜虫作为鱼类体外寄生纤毛虫类的一种，对寄主无选择性，可感染草鱼，淡水白鲳和斑点叉尾鮰等多种淡水和咸淡水养殖鱼类。该虫主要寄生在鱼鳃、鳍和皮肤上，导致寄生处上皮细胞增生，出现许多小白点，因此，小瓜虫病又称“白点病”。该病分布广泛，遍及全球，我国每年4月～6月和9月～11月，水温为20℃～24℃，是小瓜虫病的流行盛期。该病主要危害鱼苗和鱼种，发病快，死亡率高，极难治愈。

生产上过去一直使用孔雀石绿、硝酸亚汞和醋酸亚汞防治多子小瓜虫病。但由于此类药物高毒高残留，污染环境，危害消费者健康，均已被禁止使用。我国具有丰富的中草药资源，毒性小，残留低，长期用于人畜疾病治疗，安全可靠，也满足无公害绿色水产品生产中对病害防治的安全性要求。因此，植物源渔用杀虫药具有广阔开发前景。研究发现，一些中草药提取物中存在杀灭多子小瓜虫的活性物质。

生姜(Zingiberofficinale)是姜科多年生草本植物姜的新鲜根茎，味辛，性微温，具有解表散寒、温中止呕、温肺止咳的功效，常用于风寒感冒、脾胃寒症、肺寒咳嗽等。采用活性追踪法，分离、纯化和鉴定了生姜中的活性化合物10-姜酚，首次发现该化合物具有杀灭多子小瓜虫的活性，在文献[Phytochemistry,48(5),889-891]中已公开了该化合物的结构，其结构式为：

分子式为C₂₁H₃₄O₄，分子量350.49，白色结晶或油状液体，味辣而苦。相对密度1.0713。折射率1.5212，沸点235～240℃(2.39kPa)。微溶于水，可溶于乙醇、***、氯仿、苯、醋酸。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种10-姜酚在制备防治鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

10-姜酚作为原料在制备防治鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。

所述的鱼类体外寄生纤毛虫指的是多子小瓜虫(Ichthyophthiriusmultifiliis)。

所述的药物的剂型优选为药液、药膏或粉剂。

所述的10-姜酚的有效浓度为4～16mg/L。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)10-姜酚来源于食药两用的生姜，属姜科多年生草本植物，同时，该化合物对草鱼的半致死浓度(85.43mg/L)是其防治多子小瓜虫病最低有效浓度(4mg/L)的21.4倍，使用安全性高，解决了目前防治鱼类体外寄生纤毛虫病存在的不安全问题。

(2)本发明首次将10-姜酚应用于制备杀灭鱼类体外寄生虫药物中，特别是用于杀灭多子小瓜虫，在有效剂量范围内即能100％杀灭该虫，起到有效治疗和预防多子小瓜虫病的作用。

(3)本发明首次报道了10-姜酚杀灭多子小瓜虫活性，防治小瓜虫病的有效浓度为4～16mg/L，效果好。

(4)本发明的原料来源丰富，生姜是亚洲的一种传统药食两用植物，对人安全，无环境残留；在我国栽培早、种植广、产量大。提取制备工艺简单成熟，产业化前景广阔。

(5)10-姜酚在生姜中含量高，提取制备工艺简单成熟，抗虫活性高，无环境污染和残留，在新型环保绿色渔药领域有着良好应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例110-姜酚对多子小瓜虫成虫和包囊的杀灭作用

1.1实验材料：寄主模型鱼为草鱼(Ctenopharyngodonidellus)，体重25.7±3.8g，来源于广州市花都区五星村鱼苗场。多子小瓜虫(Ichthyophthiriusmultifiliis)来源于广州市花地湾花鸟鱼虫市场。实验所用10-姜酚的纯度≥98％，由暨南大学水生生物研究所制备提供。具体制备方法如下：

自生姜提取的姜油树脂2kg，购自贵州红星发展都匀绿友有限责任公司。将其依次用石油醚、乙酸乙酯、水萃取，得到石油醚萃取物500g，乙酸乙酯萃取物1200g，水萃取物300g。经杀虫实验，测定出乙酸乙酯部位活性最佳。乙酸乙酯部位经过一级硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯(1:0、1:1、0:1)和乙酸乙酯：甲醇(1:1、0:1)为洗脱***进行梯度洗脱，每级洗脱液60L。根据一级硅胶柱层析各部位杀虫活性结果，将杀虫活性最佳的石油醚：乙酸乙酯(1:1)部位590g经过二级硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯(1:0、4:1、1:1)和乙酸乙酯：甲醇(1:0、0:1)为洗脱***进行梯度洗脱，每级洗脱液50L。根据二级硅胶柱层析各部位杀虫活性结果，将杀虫活性最佳的石油醚：乙酸乙酯(4:1)部位350g经过三级硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯(1:0、10:1、4:1)和乙酸乙酯：甲醇(1:1、0:1)为洗脱***进行梯度洗脱，每级洗脱液40L。根据三级硅胶柱层析各极性部位杀虫活性结果，将杀虫活性最佳的石油醚：乙酸乙酯(10:1)部位96g经过制备型高效液相色谱，以甲醇：水(80:20)为流动相进行洗脱，洗脱液40L，获得纯度≥98％的活性化合物10-姜酚。

1.2实验方法：

1.2.110-姜酚药液配制：在十万分之一天平上精确称取10-姜酚5mg，用20μL二甲基亚砜促溶，加入3.105mL蒸馏水，配成1600mg/L的一级储备液。取0.2mL一级储备液和4.8mL超纯水，得到5mL64mg/L的二级储备液。再利用二倍梯度稀释法，配制成64、32、16、8、4、2、1和0(对照组)mg/L的药液各2mL。此时，64mg/L药液的二甲基亚砜含量为0.0256％(v/v)，对照(0mg/L药液)的二甲基亚砜含量亦为0.0256％(v/v)。

1.2.2将含有大约100个成虫(滋养体)的200μL的水溶液加入24孔板的孔中，随后各加入200μL药液，此时10-姜酚的最终浓度依次为32、16、8、4、2、1、0.5和0mg/L，每组设置3个平行。4倍显微镜下记录4h内成虫的死亡时间和第4h的死亡率，计算出半数有效浓度(EC₅₀)。计算公式如下：

死亡率(％)＝(1-实验组活成虫个数/对照组成虫总数)×100％

结果表明：8mg/L浓度下的10-姜酚可100％杀死多子小瓜虫成虫，并且随着浓度增加，全部致死时间缩短。

1.2.3在24孔板中，向孔中加入200μL约含30个成熟多子小瓜虫成虫的虫液，显微镜下准确计数各孔成虫数，静置6h，待其形成包囊后，计数各孔包囊数，再分别加入200μL不同浓度的试液，使最终试液的浓度依次为32、16、8、4、2、1、0.5和0mg/L，各实验浓度设置3个平行。在4倍显微镜下记录自包囊加药后至第4h的死亡数，计算4h死亡率和4h的EC₅₀。计算公式如下：

死亡率(％)＝各孔中死亡包囊数/各孔总包囊数×100％；

上述计数完毕后，将24孔板(未死亡的包囊)于23℃恒温培养箱中静置12h，保持相同温度，在4倍显微镜下观察孵化情况，计数各孔孵化幼虫数。计算公式如下：

平均每个包囊孵化的幼虫数＝各孔幼虫总数/各孔包囊数；

结果表明：10-姜酚的浓度在16mg/L可以100％杀死包囊，完全抑制包囊孵化，无感染性幼虫释放。随着药液浓度的降低，平均每个包囊释放的感染性幼虫数增加。8mg/L和4mg/L的10-姜酚能显著降低每个存活包囊释放幼虫的数量，且绝大部分包囊释放出未成熟的圆形幼虫，该种形态的幼虫不具感染力，存活时间短。

实施例210-姜酚对多子小瓜虫幼虫的杀灭作用

2.1实验材料：同实施例1。

2.2实验方法：

2.2.110-姜酚药物的配制：同实施例1。

2.2.2将含有大约200个多子小瓜虫幼虫的100μL水溶液加入96孔板的各孔中，另外加入100μL药液，使得各孔中10-姜酚最终浓度分别为32、16、8、4、2、1、0.5和0(对照)mg/L，每组设置6个平行。显微镜下统计4h内幼虫的死亡时间和第4h幼虫的死亡率，计算出EC₅₀，计算公式如下：

死亡率(％)＝(1-实验组活幼虫个数/对照组幼虫总数)×100％；

结果表明10-姜酚在2mg/L浓度下4h内可100％致死幼虫。并且随着浓度增加，有效时间缩短。

实施例3低浓度10-姜酚对幼虫感染力的影响

3.1实验材料：同实施例1。

3.2实验方法：

3.2.110-姜酚药液的配制：根据实施例1的方法，配制成2、1、0.5、0.25和0(对照)mg/L的药液各120mL。

3.2.2用曝气蒸馏水调整幼虫的浓度，取40mL大约含2×10⁵个感染性幼虫的水溶液加入100mL烧杯中，再加入40mL药液，混匀，使感染性幼虫于最终浓度分别为1、0.5、0.25、0.125和0mg/L的10-姜酚试液中处理2h，每个浓度设置3个处理平行。

将150尾未感染多子小瓜虫的健康草鱼，随机平均分配到15个水族箱中(每个水族箱10尾鱼，事先加入5L曝气自来水)，将各浓度10-姜酚处理过的幼虫倒入各水族箱中，与草鱼接触(平均每尾鱼20000只幼虫)，每一处理浓度设置3个平行。感染2h后，每个水族箱再加至10L曝气自来水，温度控制在23±0.5℃，充氧泵供氧。第五天，用150mg/L的麻醉剂(MS222)(Sigma)麻醉草鱼，记数草鱼体表小白点数，统计感染率和感染强度。计算公式如下：

感染率(％)＝(体表存在白点的鱼数/总鱼数)×100％；

感染强度＝体表白点总数/体表存在白点的鱼数；

结果表明：多子小瓜虫感染性幼虫被低浓度的10-姜酚处理2h后感染力显著降低。处理浓度为1mg/L和0.5mg/L时能显著降低小瓜虫对草鱼的感染率，且感染强度显著低于对照组。

实施例410-姜酚对多子小瓜虫病的防治效果

4.1实验材料：同实施例1。

4.2实验方法：

4.2.1精确称取2.1g10-姜酚，配制成40000、20000、10000和0(对照组)mg/L的药液各30mL。

4.2.2选取轻度感染多子小瓜虫的草鱼(体表白点数40±9个)随机分到12个装有10L水的玻璃缸(体积15L)中，每个水族箱放入5尾被感染草鱼。再选取120尾未感染多子小瓜虫的健康草鱼，随机分到这12个水族箱中(每个水族箱10条健康草鱼)，与已感染多子小瓜虫的草鱼混养。随后向各水族箱中加入1mL上述配制的药液，混匀，使10-姜酚的药液最终浓度分别为4、2、1和0mg/L，每组3个平行。每天更换相同体积新鲜曝气自来水并加药，保持各水族箱药物浓度与第一天相同，持续用药10天，停药5天。期间，记录草鱼死亡数，并及时清理死鱼，保持水质。第15天，用150mg/L的麻醉剂(MS222)麻醉草鱼，记录各实验组草鱼体表的白点个数，统计感染率、感染强度和存活率；结果见表1。

表1：10-姜酚处理被感染草鱼和未感染草鱼混合体系10天停药5天的结果

“I”表示实验前被感染草鱼；“N”表示实验前未被感染草鱼；

感染率(％)＝(体表存在白点的鱼数/总鱼数)×100％；

感染强度＝体表白点总数/体表存在白点的鱼数；

存活率(％)＝(实验后存活鱼数/实验前总鱼数)×100％；

同一纵栏内数值右上角标有相同字母表示差异不显著(P<0.05)，标有不同字母表示差异显著(P<0.05)。

结果显示：10-姜酚在4mg/L浓度下，10天内可完全治愈多子小瓜虫病(感染率和感染强度为0，存活率为100％)；2mg/L10-姜酚可使未感染鱼的感染率控制在13.3％，已感染鱼的感染率降至20％，且感染强度与对照组相比明显减小并差异显著，显示在此浓度下，10-姜酚起到了良好的预防作用和明显的治疗作用。

实施例510-姜酚对草鱼的急性毒性实验

5.1实验材料：同实施例1

5.2预实验：测定实验鱼在24h内全部死亡的10-姜酚药物浓度为140mg/L和96h不发生死亡的10-姜酚药物浓度为20mg/L。

5.3向15个玻璃缸(体积：10L)中分别装入5L曝气自来水，和10尾草鱼，温度控制在23±0.5℃，并由供氧泵供氧。在预实验的基础上设置120、80、40、20、和0(对照)mg/L五个浓度组，进行正式实验。实验期间随时观察各浓度下实验鱼的中毒情况，如发现草鱼中毒死亡，应立即捞出，以免破坏水质。96h后统计实验结果，计算半致死浓度(LC₅₀)和95％置信区间(使用SPSS软件probit程序计算)。结果见表2。

结果表明：10-姜酚对草鱼的LC₅₀为85.43mg/L，分别是其对成虫和幼虫EC₅₀的25.28倍和108.1倍，可见10-姜酚对草鱼安全。

表2：10-姜酚离体杀多子小瓜虫成虫(滋养体)和幼虫效果(EC₅₀)以及对草鱼的急性毒性(LC₅₀)

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.10-姜酚在制备防治鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的鱼类体外寄生纤毛虫指的是多子小瓜虫。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物的剂型为药液、药膏或粉剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的10-姜酚的有效浓度为4～16mg/L。