CN105259289A - ***类杀菌剂废水中致毒手性单体的识别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种***类杀菌剂废水中致毒手性单体的识别方法，属于农药工业废水手性单体的毒物鉴别领域。其步骤包括：废水中***类杀菌剂的富集浓缩，分离与定性识别，手性单体的分离，致毒手性单体的识别。本发明从农药工业废水中分离并识别***类杀菌剂，并且鉴别出废水中致毒的***类杀菌剂手性单体，有利于有针对性的指导合成工艺与水处理设施，削减农药工业废水的毒性与潜在风险，从而降低农药生产对环境和人类健康的影响。
Description
技术领域
本发明涉及一种农药工业废水中致毒手性单体的识别方法，具体地说是农药工业废水中***类杀菌剂手性单体的制备方法与致毒单体的识别方法。
背景技术
农药在农业生产中起着至关重要的作用，中国作为农业大国，也是农药生产和使用大国。国家***数据显示，2014年我国农药累计生产量为374.4万吨。农药生产过程中产生了大量的农药工业废水，废水通常具有成分复杂、毒性大、难生物降解、色度高、COD高等特点。已有研究表明农药工业废水具有生态毒性和遗传毒性，对水生生态安全和人类的健康构成威胁。目前生产的农药中手性农药的比例占到了40％左右，手性农药通常含有1或2个手性中心。已有研究表明不同手性单体的毒性及生物活性具有显著差异，废水处理工艺的处理效果也有明显区别。我国的农药生产以外消旋体形式存在，缺少手性分离步骤。因此建立快速稳定的技术识别农药工业废水的致毒手性单体具有重大意义，有利于有针对性的去除废水中的高风险污染物，削减废水的毒性及指导农药生产工艺的改进，从而降低农药对环境和人类健康的影响。
通过检索发现目前国内外文献还没有基于液相色谱-质谱定性分析、制备色谱分离与毒性测试识别农药工业废水的致毒***类杀菌剂手性单体的报道。
发明内容
目前农药生产废水量大，环境风险高，然而农药残留主要以外消旋体形式存在，废水中不同手性单体药效不同，毒性差异较大，废水处理不具有针对性，对致毒单体的去除率较低，需要建立具有针对性的毒性单体鉴别方法。本发明所要解决的技术问题是提供一种***类杀菌剂废水中致毒手性单体的识别方法，基于制备色谱纯化技术分离农药工业废水中致毒的***类杀菌剂，建立手性单体的制备及其大型溞毒性和抗菌活性的评估方法来识别农药工业废水中主要的致毒手性单体，为农药生产工艺及废水处理工艺改进提供指导意见。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种***类杀菌剂废水中致毒手性单体的识别方法，它包括如下步骤：
(1)废水中***类杀菌剂的富集浓缩：利用固相萃取柱对水样中的***类杀菌剂进行富集，利用有机溶剂洗脱固相萃取柱，获得不同极性的***类杀菌剂，将洗脱液旋蒸、氮吹浓缩、定容、保存；
(2)废水中***类杀菌剂的定性识别与分离制备：利用液质联用对步骤(1)得到的废水浓缩液中的***类杀菌剂进行定性识别，确定具体的***类杀菌剂成分，再利用制备色谱对具体的***类杀菌剂成分(包括戊唑醇、己唑醇、粉唑醇和丙环唑等)分别进行分离纯化，浓缩得到纯品；
(3)***类杀菌剂手性单体的分离：基于手性色谱柱利用超临界流体色谱对步骤(2)得到的具体的***类杀菌剂成分进行手性分离，浓缩得到手性单体；
(4)致毒手性单体的识别：利用大型溞毒性测试平台将步骤(3)得到的手性单体暴露于大型溞，通过24～48小时观察受抑制的大型溞数来计算半数抑制浓度EC50值；利用盆栽喷雾法将瓜类炭疽病菌和番茄灰霉病菌接种到黄瓜叶片上，通过观察叶片上的病斑数来计算半数抑制浓度IC50值，建立毒性-活性比数据库，筛选毒性贡献最高，活性贡献最低的单体，以识别致毒手性单体。
步骤(1)中，所述的固相萃取柱为WatersOasisHLB或C18固相萃取小柱；固相萃取柱在使用之前，依次用正己烷、二氯甲烷、甲醇和去离子水活化，流速控制在1～4滴/秒，萃取结束后，离心除去萃取柱中的水分并将其放在干燥器中备用。其中，所述的离心优选5000r/min条件下离心5min。
步骤(1)中，所述的有机溶剂为正己烷、二氯甲烷和甲醇的组合。上述有机溶剂优选的体积用量各为5～10mL。
步骤(1)中，所述的旋蒸，温度控制在30-35℃，旋蒸浓缩至1mL以下。
步骤(2)中，所述的定性识别为采用液质联用定性检测，具体参数如下：
高效液相色谱仪HPLC：Agilent1260；
质谱仪：API4000-ABSCIEX；
色谱柱：WatersXBridgeBEHC18XP分析柱(2.1mm×50mm,2.5μm)；柱温：40℃；流动相：A：水，B：甲醇；流速：0.2-0.6mL/min；进样体积为5μL；
流动相梯度见表1。
质谱条件见表2。
利用多反应监测模式对***类杀菌剂定性分析的参数见表3。
表1
| 时间/min | 水体积百分含量/％ | 甲醇体积百分含量/％ |
| 0.0 | 90 | 10 |
| 0.5 | 90 | 10 |
| 2.0 | 30 | 70 |
| 4.0 | 20 | 80 |
| 8.0 | 10 | 90 |
| 8.5 | 90 | 10 |
| 12.0 | 90 | 10 |
表2
| 参数 | 名称 | 参数 | 数值 |
| 质谱仪 | API 4000 | 碰撞气Collision Gas(CAD) | 7 |
| 离子源 | 电喷雾离子化ESI | 气帘气Curtain Gas(CUR) | 35 |
| 电离模式 | 正离子模式 | 雾化气Ion Source Gas1(Gas1) | 45 |
| 雾化气 | 氮气 | 加热气Ion Source Gas2(Gas2) | 50 |
| 碰撞气 | 氩气 | 离子喷雾电压Ion Spray Voltage | 4000 |
| 采集方式 | 多反应监测MRM | 温度Temperature(TEM) | 600 |
表3
步骤(2)中，制备色谱的分离参数如下：
制备色谱仪：WatersAutoPurificationHPLCSystem；
色谱柱：WatersXBridgeC18制备柱(19mm×150mm,5μm)；柱温：35℃；
流动相：A：水，B：甲醇；流速：3-7mL/min；进样体积为500μL；
紫外吸收波长：220nm；
流动相梯度见表4。
基于建立的化合物正辛醇-水分配系数LogKow与保留时间tR的线性关系式(LogKow＝0.11501tR-0.21618)计算出***类杀菌剂出峰时间估算值，进而利用估算值加减0.4作为杀菌剂的预计出峰时间范围。典型***类杀菌剂的预计出峰时间范围如表5所示。
表4
| 时间/min | 水体积百分含量/％ | 甲醇体积百分含量/％ |
| 0.0 | 50 | 50 |
| 50 | 0 | 100 |
| 80 | 0 | 100 |
表5
步骤(2)中，所述的浓缩，方式为在体积百分含量5％-20％甘油水溶液保护的条件下，利用氮吹将组分中的甲醇去除，以保证易挥发物质的回收率，剩下的水溶液利用二氯甲烷液液萃取3次，萃取液经旋蒸、氮吹浓缩。
步骤(3)中，所述的超临界流体色谱，参数如下：
超临界流体色谱制备***：WatersSFC80，紫外检测器(Gilson151)；
色谱柱：手性制备柱(25mm×250mm,10μm)；柱温：40℃；
流动相：A：食品级二氧化碳，B：甲醇；流速：45-50g/min；
紫外吸收波长：220nm；
流动相梯度见表6。
表6
A、B相百分含量总和为100％。
步骤(4)中，手性单体的大型溞毒性：将手性单体吹干替换成二甲基亚砜，随后将50μL替换成二甲基亚砜的手性单体加入到9.95mL水中，配成稀释倍数为2的不同梯度试验液，接着往10mL试验液中加入5只24h/48h以内刚产的幼溞，设置4个平行，将其放入光照培养箱中培养24h/48h，观察记录每个试验液中活动受抑制的大型溞数目。计算半抑制浓度(EC50-Daphnia)，以表征***类杀菌剂手性单体对大型溞的急性毒性效应。手性单体的抗菌活性：参照<<国家南方农药创制中心生物筛选SOP>>采用盆栽喷雾法测定手性单体对瓜类炭疽病菌和番茄灰霉病菌的生物活性。将手性单体样品加入少量N,N-二甲基甲酰胺进行溶解，之后用0.1％的吐温80表面活性剂水配制成稀释倍数为2的不同梯度试验液，接着在黄瓜苗上均匀喷洒试验液，24小时后各自人工接种瓜类炭疽病菌和番茄灰霉病菌，接种后立即移至恒温室保湿箱中保湿诱发，5天左右待空白病斑稳定后记录各试验液的病斑数。计算半抑制浓度(IC50-Fungus)，以表征***类杀菌剂手性单体的抗菌活性。
通过***类杀菌剂手性单体的抗菌活性IC50-Fungus的倒数获得抗菌活性单元，***类杀菌剂手性单体的大型溞毒性EC50-Daphnia的倒数获得大型溞毒性单元，基于抗菌活性单元和大型溞毒性单元按公式(1)计算毒性-活性比。毒性-活性比最大的单体即为最主要的致毒手性单体来源。
有益效果：本发明方法提供了一种农药工业废水中致毒***类杀菌剂手性单体的识别方法，本发明从农药工业废水中制备纯化得到***类杀菌剂，并且鉴别出废水中主要的致毒手性单体，有利于削减农药工业废水的毒物及提高致毒手性单体的去除率，并且能够指导农药生产工艺的改进，从而降低农药对环境和人类健康的影响。
附图说明
图1为典型***类杀菌剂(戊唑醇、己唑醇、粉唑醇和丙环唑)的多反应监测色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
一种***类杀菌剂废水中致毒手性单体的识别方法，其步骤为：
(1)固相萃取：利用WatersOasisHLB固相萃取小柱(6cc,500mg)富集农药工业废水的有机物，萃取小柱使用之前依次用正己烷、二氯甲烷、甲醇、去离子水活化，流速控制在1～4滴/秒，萃取结束后在5000r/min的转速下离心5min除去萃取柱中的水分并将其放在干燥器中；
(2)洗脱浓缩：依次用5mL正己烷、10mL二氯甲烷、10mL甲醇将固相萃取柱上不同极性的有机物洗脱下来并收集洗脱液，利用旋转蒸发仪在30-35℃温度条件下将洗脱液浓缩至1mL以下，将其清洗转移至氮吹管中氮吹浓缩，定容并转移至进样小瓶中保存；
(3)***类杀菌剂的定性识别：基于液相色谱-质谱建立的多反应监测模式对农药工业废水样品中常见***类杀菌剂进行定性分析，参数如下：
高效液相色谱仪HPLC：Agilent1260；
质谱仪：API4000-ABSCIEX；
色谱柱：WatersXBridgeBEHC18XP分析柱(2.1mm×50mm,2.5μm)；柱温：40℃；流动相：A：水，B：甲醇；流速：0.4mL/min；进样体积为5μL；
流动相梯度见表1。
质谱条件见表2。
利用多反应监测模式对***类杀菌剂定性分析的参数见表3。
农药工业废水中常见***类杀菌剂的定性分析结果见表7。
表7
| 戊唑醇 | 己唑醇 | 粉唑醇 | 丙环唑 | |
| 废水 | 可检出 | 可检出 | 可检出 | 可检出 |
(4)***类杀菌剂的分离制备：利用制备色谱将定性分析结果识别到的杀菌剂(戊唑醇、己唑醇、粉唑醇和丙环唑)从废水浓缩液中分离纯化，并进行浓缩得到纯品。其参数如下：
制备色谱仪：WatersAutoPurificationHPLCSystem；
色谱柱：WatersXBridgeC18制备柱(19mm×150mm,5μm)；柱温：35℃；
流动相：A：水，B：甲醇；流速：5mL/min；进样体积为500μL；
紫外吸收波长：220nm；
流动相梯度见表4。
基于建立的化合物正辛醇-水分配系数LogKow与保留时间tR的线性关系式(LogKow＝0.11501tR-0.21618)计算出***类杀菌剂出峰时间估算值，进而利用估算值加减0.4作为杀菌剂的预计出峰时间范围。典型***类杀菌剂(戊唑醇、己唑醇、粉唑醇和丙环唑)的预计出峰时间范围如表5所示。浓缩方式为在体积百分含量为5％-20％甘油水溶液保护的条件下，利用氮吹将组分中的甲醇去除，以保证易挥发物质的回收率，剩下的水溶液利用二氯甲烷液液萃取3次，萃取液经旋蒸、氮吹浓缩。
(5)***类杀菌剂手性单体的制备：基于手性色谱柱利用超临界流体色谱对典型***类杀菌剂(戊唑醇、己唑醇、粉唑醇和丙环唑)进行手性分离，浓缩得到手性单体。手性分离条件如下：
超临界流体色谱制备***：WatersSFC80，紫外检测器(Gilson151)；
色谱柱：手性制备柱(25mm×250mm,10μm)；柱温：40℃；
流动相：A：食品级二氧化碳，B：甲醇；流速：50g/min；
紫外吸收波长：220nm；
流动相梯度见表6。
(6)手性单体的大型溞毒性：将手性单体吹干替换成二甲基亚砜，随后将50μL替换成二甲基亚砜的手性单体加入到9.95mL水中，配成稀释倍数为2的不同梯度试验液，接着往10mL试验液中加入5只24h/48h以内刚产的幼溞，设置4个平行，将其放入光照培养箱中培养24h/48h，观察记录每个试验液中活动受到抑制的大型溞数目。将受到抑制的大型溞数目和浓度值的对数LogC用SPSS软件中的Probit做统计，在统计列表中找到50％受抑制率对应的LogC，最终计算出半数受抑制浓度EC50-Daphnia来表征***类杀菌剂手性单体对大型溞的急性毒性效应。
(7)手性单体的抗菌活性：参照<<国家南方农药创制中心生物筛选SOP>>采用盆栽喷雾法测定手性单体对瓜类炭疽病菌和番茄灰霉病菌的生物活性。利用马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养瓜类炭疽病菌和番茄灰霉病菌，将手性单体样品加入少量N,N-二甲基甲酰胺进行溶解，之后用0.1％的吐温80表面活性剂水配制成稀释倍数为2的不同梯度试验液，接着在黄瓜苗上均匀喷洒试验液，24小时后各自人工接种瓜类炭疽病菌和番茄灰霉病菌，接种后立即移至恒温室保湿箱中保湿诱发，5天左右待空白病斑稳定后记录各试验液中叶片病斑个数。利用公式(2)计算瓜类炭疽病菌和番茄灰霉病菌的预防效果，将浓度对数值与预防效果用线性回归方程拟合，最终计算出半抑制浓度IC50-Fungus来表征***类杀菌剂手性单体的抗菌活性。
(8)致毒手性单体的识别：通过***类杀菌剂手性单体的抗菌活性IC50-Fungus的倒数获得抗菌活性单元，***类杀菌剂手性单体的大型溞毒性EC50-Daphnia的倒数获得大型溞毒性单元，基于抗菌活性单元和大型溞毒性单元建立毒性-活性比，如公式(1)所示。毒性-活性比最大的单体即为最主要的致毒手性单体来源。
***类杀菌剂(戊唑醇、己唑醇、粉唑醇和丙环唑)手性单体的毒性-活性比结果如表8所示，己唑醇-P1单体的毒性-活性比最大，其值为30.3，其次为丙环唑-P2单体，再次为戊唑醇-P1单体。因此农药工业废水中主要致毒手性单体为己唑醇-P1单体，丙环唑-P2单体和戊唑醇-P1单体，需要进一步改进水处理工艺提高去除效率并推进生产工艺改进以达到手性分离效果。
表8
| 手性单体 | 毒性-活性比 | 手性单体 | 毒性-活性比 |
| 戊唑醇-P1 | 17.7 | 粉唑醇-P2 | 0.8 |
| 戊唑醇-P2 | 0.9 | 丙环唑-P1 | 2.6 |
| 己唑醇-P1 | 30.3 | 丙环唑-P2 | 18.8 |
| 己唑醇-P2 | 3.0 | 丙环唑-P3 | 1.6 |
| 粉唑醇-P1 | 0.3 | 丙环唑-P4 | 7.7 |
Claims (8)
1.一种***类杀菌剂废水中致毒手性单体的识别方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)废水中***类杀菌剂的富集浓缩：利用固相萃取柱对水样中的***类杀菌剂进行富集，利用有机溶剂洗脱固相萃取柱，获得不同极性的***类杀菌剂，将洗脱液旋蒸、氮吹浓缩、定容、保存；
(2)废水中***类杀菌剂的定性识别与分离制备：利用液质联用对步骤(1)得到的废水浓缩液中的***类杀菌剂进行定性识别，确定具体的***类杀菌剂成分，再利用制备色谱对具体的***类杀菌剂成分分别进行分离纯化，浓缩得到纯品；
(3)***类杀菌剂手性单体的分离：基于手性色谱柱利用超临界流体色谱对步骤(2)得到的具体的***类杀菌剂成分进行手性分离，浓缩得到手性单体；
(4)致毒手性单体的识别：利用大型溞毒性测试平台将步骤(3)得到的手性单体暴露于大型溞，通过24～48小时观察受抑制的大型溞数来计算半数抑制浓度EC50值；利用盆栽喷雾法将瓜类炭疽病菌和番茄灰霉病菌接种到黄瓜叶片上，通过观察叶片上的病斑数来计算半数抑制浓度IC50值，建立毒性-活性比数据库，筛选毒性贡献最高，活性贡献最低的单体，以识别致毒手性单体。
2.根据权利要求1所述的***类杀菌剂废水中致毒手性单体的识别方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的固相萃取柱为WatersOasisHLB或C18固相萃取小柱；固相萃取柱在使用之前，依次用正己烷、二氯甲烷、甲醇和去离子水活化，流速控制在1～4滴/秒，萃取结束后，离心除去萃取柱中的水分并将其放在干燥器中备用。
3.根据权利要求1所述的***类杀菌剂废水中致毒手性单体的识别方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的有机溶剂为正己烷、二氯甲烷和甲醇。
4.根据权利要求1所述的***类杀菌剂废水中致毒手性单体的识别方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的定性识别为采用液质联用定性检测，具体参数如下：高效液相色谱仪HPLC：Agilent1260；色谱柱：WatersXBridgeBEHC18XP分析柱(2.1mm×50mm,2.5μm)；柱温：40℃；流动相：A：水，B：甲醇；流速：0.2-0.6mL/min；质谱仪：API4000-ABSCIEX；离子源：电喷雾离子化ESI；电离模式：正离子模式；采集模式：多反应监测模式；多反应监测模式的离子对：戊菌唑为284>159,284>70；腈菌唑为289>125,289>70；烯效唑为292>125,292>70；多效唑为294>125,294>70；硅氟唑为294>135,294>70；氧环唑为300>231,300>159；氟硅唑为316>247,316>165；灭菌唑为318>125,318>70；叶菌唑为320>125,320>70；氟环唑为330>121,330>101；种菌唑为334>125,334>70；腈苯唑为337>125,337>70；丙环唑为342>159,342>69；丙硫菌唑为344>326,344>125；氟菌唑为346>278,346>73；氟醚唑为372>159,372>70；戊唑醇为308>125,308>70；粉唑醇为302>123,302>70；己唑醇为314>159,314>70。
5.根据权利要求1所述的***类杀菌剂废水中致毒手性单体的识别方法，其特征在于，步骤(2)中，制备色谱的分离参数如下：WatersAutoPurificationHPLCSystem；色谱柱：WatersXBridgeC18制备柱(19mm×150mm,5μm)；柱温：35℃；流动相：A：水，B：甲醇；流速：3-7mL/min；以多反应监测模式扫描出的***类杀菌剂作为目标物质，设置离子对进行见峰收集。
6.根据权利要求1所述的***类杀菌剂废水中致毒手性单体的识别方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的浓缩，方式为在体积百分比5％-20％甘油水溶液保护的条件下，利用氮吹将组分中的甲醇去除，以保证易挥发物质的回收率，剩下的水溶液利用二氯甲烷液液萃取3次，萃取液经旋蒸、氮吹浓缩。
7.根据权利要求1所述的***类杀菌剂废水中致毒手性单体的识别方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的超临界流体色谱，参数如下：超临界流体色谱制备***：WatersSFC80，紫外检测器(Gilson151)；色谱柱：手性制备柱(25mm×250mm,10μm)；流动相：A：食品级二氧化碳，B：甲醇；流速：45-50g/min；检测波长：220nm；柱温：40℃。
8.根据权利要求1所述的***类杀菌剂废水中致毒手性单体的识别方法，其特征在于，步骤(4)中，按公式(1)计算毒性-活性比，毒性-活性比最大的单体即为最主要的致毒手性单体。
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