CN105256039A - 骨质疏松症诊断标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了PIGK基因可以作为骨质疏松症早期诊断的分子标志物。本发明利用基因芯片和QPCR的方法发现PIGK基因在正常人和骨质疏松症患者的血液中的表达存在显著差异，即可以通过检测血液中PIGK基因表达情况来判断受试者是否患有骨质疏松症。根据两者的相关性，本发明开发了一种诊断骨质疏松的试剂盒，该试剂盒通过检测PIGK基因的表达从而进行骨质疏松的诊断。本发明的诊断试剂盒可用于疾病的早期诊断，在临床上具有广泛的应用前景。

Description

骨质疏松症诊断标志物
技术领域
本发明属于分子诊断领域，涉及一种用于骨质疏松症诊断的分子标志物，具体涉及血液中的分子标志物-PIGK基因在制备诊断骨质疏松症的产品中的应用。
背景技术
骨质疏松症(osteoporosis，OP)是多种原因引起的一组骨病，骨组织有正常的钙化，钙盐与基质呈正常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。在多数骨质疏松中，骨组织的减少主要由于骨质吸收增多所致。以骨骼疼痛、易于骨折为特征。
世界卫生组织已将骨质疏松列为仅次于心血管疾病的第二大危害人类健康的疾病。据中国健康促进基金会最新发布的《2013中国骨质疏松骨折防治蓝皮书》显示，骨质疏松骨折是一种脆性骨折，即在受到轻微创伤或日常活动中遭受低能量外伤即可发生的骨折。骨质疏松骨折的常见部位是脊椎、髋骨和前臂远端。我国50岁以上人群约6944万人患有骨质疏松症，约2.1亿人骨量偏低。北京等地区流行病学调查显示，50岁以上女性脊椎骨折的患病率为15％，相当于每7个50岁以上的女性中就有一个发生过脊椎骨折。
骨质疏松症的检测包括实验室检查指标的检测和辅助检测。
实验室检查指标：
骨质疏松症患者部分血清学生化指标可以反应骨转换(包括骨形成和骨吸收)状态，在骨的高转换状态(例如Ⅰ型骨质疏松症)下，这些指标可以升高，也可用于监测治疗的早期反应。但其在骨质疏松症中的临床意义仍有待于进一步研究。这些生化测量指标包括：骨特异的碱性磷酸酶(Bone-specificalkalinephosphatase，反应骨形成)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartratedresistantacidphosphatse，反应骨吸收)、骨钙素(Osteocalcin，反应骨形成)、Ⅰ型原胶原肽(TypeIprocollagenpeptidase，反应骨形成)、尿吡啶啉(Urinarypyridinoline)和脱氧吡啶啉(Urinarydeoxypyridinoline，反应骨吸收)、Ⅰ型胶原的N-C-末端交联肽(cross-linkedN-andC-telopeptideoftypeIcollagen，反应骨吸收)。正如前面所提到的，使用生化指标检测骨质疏松症的精确度不够。
辅助检查：包括骨影像学检查和骨密度检测。辅助检查的对象一般都是骨质疏松症的晚期患者，不能用于早期骨质疏松症患者的筛查。
基于现有技术中检测骨质疏松症的手段的局限性，寻找一种有效的能够在早期即可诊断骨质疏松症发生的方法是亟待解决的问题。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于骨质疏松症(Osterarthritis，OA)早期诊断的分子标志物。相比传统的骨质疏松症的诊断方法，使用基因标志物来诊断骨质疏松症的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测PIGK基因表达的产品在制备诊断骨质疏松症的工具中的应用。
进一步，上面所提到的检测PIGK基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测PIGK基因表达水平以诊断骨质疏松症的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增PIGK基因的引物；所述用实时定量PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增PIGK基因的引物；所述用免疫检测诊断骨质疏松症的产品包括：与PIGK蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断骨质疏松症的产品包括：与PIGK基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断骨质疏松症的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与PIGK蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与PIGK基因的核酸序列杂交的探针。
在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增PIGK基因的引物的序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。
优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测PIGK基因表达的产品可以应用于该平台实现对PIGK基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知PIGK基因的异常与骨质疏松症相关也属于PIGK基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种诊断骨质疏松症的工具，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测PIGK基因转录水平的针对PIGK基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的PIGK蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括PIGK基因在内的多个基因(例如，与骨质疏松症相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括PIGK蛋白在内的多个蛋白质(例如与骨质疏松症相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与骨质疏松症的标志物同时检测，可大大提高骨质疏松症诊断的准确率。
其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测PIGK基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括PIGK蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测PIGK基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对PIGK基因的引物和/或探针。根据PIGK基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测PIGK基因表达水平的引物和探针。
与PIGK基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
所述高通量测序平台包括检测PIGK基因表达水平的试剂。
所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测PIGK基因的转录水平。
进一步，所述PIGK蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述PIGK蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与PIGK蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
在本发明的具体实施方案中，所述针对PIGK基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQIDNO.3所示，反向引物如SEQIDNO.4所示。
用于诊断骨质疏松症的PIGK基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断骨质疏松症的PIGK基因及其表达产物的来源是血液。
在本发明的上下文中，“PIGK基因”包括PIGK基因以及PIGK基因的任何功能等同物的多核苷酸。PIGK基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中PIGK基因(NC_000001.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，PIGK基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：
(1)序列表中SEQIDNO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述PIGK基因的编码序列是SEQIDNO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中，PIGK基因表达产物包括PIGK蛋白以及PIGK蛋白的部分肽。所述PIGK蛋白的部分肽含有与骨质疏松症相关的功能域。
“PIGK蛋白”包括PIGK蛋白以及PIGK蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括PIGK蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与PIGK的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，PIGK蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述PIGK蛋白是具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、***、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是PIGK蛋白的融合蛋白。对于与PIGK蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留PIGK蛋白的生物学活性即可。
本发明的PIGK蛋白也包括对SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留PIGK蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
在本发明的上下文中，“诊断骨质疏松症”既包括判断受试者是否已经患有骨质疏松症、也包括判断受试者是否存在患有骨质疏松症的风险。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了PIGK基因表达与骨质疏松症相关，通过检测受试者中PIGK的表达，可以判断受试者是否患有骨质疏松症、或者判断受试者是否存在患有骨质疏松症的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物-PIGK基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现骨质疏松症的早期诊断，从而降低骨质疏松症的死亡率。
附图说明
图1显示利用基因芯片检测PIGK基因在骨质疏松症患者和正常人中的表达差异；
图2显示利用QPCR检测PIGK基因在骨质疏松症患者和正常人中的表达差异。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选骨质疏松症患者和正常人中差异表达的基因
1、研究对象：
骨质疏松组：随机抽取医院骨科收治的10例原发性骨质疏松症患者，男、女各5例，年龄最小50岁，最大75岁。纳入标准：符合《中国人骨质疏松症建议诊断标准》(第二稿)。无明显心、肝、肾、肺功能不全、无引起继发性骨质疏松症的各种内分泌疾病、排除肿瘤、糖尿病等其他严重疾病干扰骨代谢者。
正常组：选取年龄50-75岁的健康志愿者10例，男女各5例。
两组之间年龄、性别差异无统计学意义(P>0.10)，具有可比性。
所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书。
2、血液中总RNA的提取
(1)匀浆处理(Homogenization)
直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mlTRIzol。
(2)分层(PhaseSeparation)
a.样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充***解。
b.每1mlTRIzol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。
(3)RNA沉淀(RNAPrecipitation)
a.4℃12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(通常可吸取550μl)转移到新管中。
b.在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。
(4)RNA漂洗(RNAWash)
a.RNA沉淀中加入1ml75％乙醇(用RNase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1mlTRIzol加入1ml75％乙醇。
b.4℃5,000-8,000rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，室温放置1-2分钟晾干沉淀。
(5)溶解RNA(RedissolvingtheRNA)
沉淀中加入50-100μlRNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存。
3、RNA质量和纯度检测
RNA质量：通过RNA完整性来表示，可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：1.2％胶；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。
RNA纯度：OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA样品，OD260/OD280值(10mMTris,pH7.5)在2.0左右。
4、基因芯片杂交及扫描
总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASYMiniKit纯化，用Amhion的RNAFragmentationReagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4x44K基因)，在芯片杂交炉中65℃杂交17h，然后洗脱、染色，最后用AgilentDNAMicroarrayScanner扫描仪扫描。
5、芯片数据处理与分析
杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。
6、统计学处理
采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P<0.05差异有显著性意义。
7、结果
结果显示(如图1所示)，与正常人相比，骨质疏松症患者血液中PIGK基因的mRNA水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2QPCR实验验证骨质疏松症患者和正常人中差异表达的基因
1、研究对象：
骨质疏松组：随机抽取医院骨科收治的50例原发性骨质疏松症患者，男、女各25例，年龄最小50岁，最大75岁。纳入标准：符合《中国人骨质疏松症建议诊断标准》(第二稿)。无明显心、肝、肾、肺功能不全、无引起继发性骨质疏松症的各种内分泌疾病、排除肿瘤、糖尿病等其他严重疾病干扰骨代谢者。
正常组：选取年龄50-75岁的健康志愿者46例，男女各23例。
两组之间年龄、性别差异无统计学意义(P>0.10)，具有可比性。
所有研究对象对本研究均知情并签署了知情同意书。
2、血液中总RNA的提取
步骤同实施例1。
3、逆转录
用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/LdNTP，0.1mmol/lDTT，30μmmol/lOligodT,200U/μlM-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
4、QPCR
(1)引物设计
根据Genbank中PIGK基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
PIGK基因：
正向引物为5’-CAGTCACATTGTCCTAAT-3’(SEQIDNO.3)；
反向引物为5’-CTCGTAACTTCTATAATCCA-3’(SEQIDNO.4),
GAPDH基因：
正向引物为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQIDNO.5)；
反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQIDNO.6)。
(2)按照表1配制PCR反应体系：
其中，SYBRGreen聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
表1PCR反应体系
试剂 体积
正向引物 1μl
反向引物 1μl
SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl
模板 2μl
去离子水 补足25μl
(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃10s，60℃40s)*42个循环。以SYBRGreen作为荧光标记物，在LightCycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图2所示，与正常人相比，骨质疏松症患者血液中PIGK基因的mRNA水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果同基因芯片实验。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测PIGK基因表达的产品在制备诊断骨质疏松症的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测PIGK基因表达水平以诊断骨质疏松症的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增PIGK基因的引物；所述用实时定量PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增PIGK基因的引物；所述用免疫检测诊断骨质疏松症的产品包括：与PIGK蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断骨质疏松症的产品包括：与PIGK基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断骨质疏松症的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与PIGK蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与PIGK基因的核酸序列杂交的探针。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括的一对特异扩增PIGK基因的引物如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。
5.一种用于诊断骨质疏松症的工具，其特征在于，所述工具能够通过检测样本中PIGK基因的表达来诊断骨质疏松症。
6.根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。
7.根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测PIGK基因转录水平的针对PIGK基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的PIGK蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测PIGK基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括PIGK蛋白的特异性抗体；所述试纸包括用于检测PIGK基因转录水平的试剂；所述高通量测序平台包括用于检测PIGK基因转录水平的试剂。
8.根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述检测PIGK基因转录水平的试剂包括针对PIGK基因的引物和/或探针。
9.根据权利要求8所述的工具，其特特征在于，所述针对PIGK基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQIDNO.3所示，反向引物如SEQIDNO.4所示。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的工具，其特征在于，所述样本是血液。
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