CN105256021B - 基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因突变检测领域，尤其涉及利用Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法和试剂盒。为了克服现有人类EGFR基因突变检测方法及试剂盒的不足,本发明提供了一种基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒，由于在EGFR基因片段扩增体系中引入耐热DNA连接酶和针对突变位点的特定连接引物体系，极大抑制了样品中的野生型EGFR基因片段的扩增，可以基于扩增片段条带直接判定野生型样本；或使得低突变含量样品其最终的PCR产物中突变片段的比例高于50%，从而保证了Sanger测序对于杂合基因片段体系的准确识别；本发明方法及试剂盒可以基于Sanger测序检测出样本中含量低至1%的EGFR基因突变，准确率极高，检测费用低廉并且还可能测出新的未知突变。
Description
技术领域
本发明属于基因突变检测领域，尤其涉及利用Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法和试剂盒。
背景技术
人类表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）是一种由原癌基因C-erbB-1(HER-1)编码的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，广泛表达于大部分正常上皮细胞中。然而在许多实体肿瘤（如非小细胞肺癌）中往往存在EGFR高表达或异常表达的情况，这与肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭、转移及凋亡的抑制有关，因此EGFR已经成为相关肿瘤（尤其是非小细胞肺癌）靶向治疗的一个重要靶点。目前应用于临床的EGFR靶向药物包括:EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs,如吉非替尼即易瑞沙和厄罗替尼即特罗凯)，以及EGFR单克隆抗体如西妥昔单抗。大量研究表明, 吉非替尼（Gefitinib）和厄罗替尼（Erlotinib）的疗效与EGFR基因尤其是其18-21号外显子的突变状况密切相关。携带EGFR基因突变的肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂高度敏感，患者将得到很大的受益；反之野生型基因的患者将基本不受益，因此EGFR基因检测作为非小细胞肺癌等癌症靶向药物选用的前提被列入了最新的NCCN（美国国家综合癌症网络）肿瘤临床实践指南。
目前报导的EGFR基因突变检测方法包括Sanger测序、Scorpions-ARMS、TaqMan-qPCR、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP等,其中在临床和科研中较为常用的方法为Sanger测序法和Scorpions-ARMS(Scorpions，蝎形探针；Amplification refractory mutation system,扩增阻滞突变***)法。基于Scorpions-ARMS法开发的如德国Qiagen公司的EGFR检测试剂盒，可同时检测EGFR基因的29种常见突变,具有灵敏度高（可测出低至1%水平的突变），操作简单，快速检测等优点；然而该类进口试剂盒检测成本过高（每份标本需3000-5000元）限制了其临床的推广和应用。Sanger测序法是基因突变/多样性检测的金标准，具有技术和平台成熟、结果准确和全面等优点，相比于Scorpions-ARMS法，检测费用低廉并且还能测出未知突变；然而Sanger测序法主要的不足在于检测灵敏度约10-20%左右（即突变基因含量要大于10%甚至20%才能被可靠检出），这制约了其临床应用。由于体细胞突变组分只占临床等样本中的一部分，除此之外还可能存在大量的野生型基因，因此提高在大量正常基因背景中少量突变检测的灵敏性，是目前改进或者开发方法的关键。
发明内容
为了克服现有人类EGFR基因突变检测方法及试剂盒的不足, 本发明的目的之一在于提供一种基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒；本发明的另一个目的在于提供一种基于Sanger测序的灵敏检测人类EGFR基因突变的方法。
由于本发明在EGFR基因特定片段的扩增体系中加入了耐热DNA连接酶和针对突变位点的连接引物，导致样品中的野生型EGFR基因片段的扩增将受到有效的抑制，而突变型的扩增则基本不受影响；因此使得突变含量低至1%的样品其最终的扩增产物中突变片段的比例高于50%，从而保证了Sanger测序对于杂合基因片段体系的准确识别。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
本发明首先涉及一种基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的引物，所述引物由扩增引物组和连接引物组组成，所述连接引物组的核苷酸序列如SEQ.ID NO.9-SEQ.ID NO.26所示。
其次，本发明的基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒，是在EGFR基因片段扩增体系中加入了所述的连接引物组、耐热DNA连接酶及其缓冲液。
更具体地，基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒，具体步骤和本发明试剂盒相关内容如下：
（1）样本采集和基因组DNA提取
采集或取出待测生物样本如患者的肿瘤组织或外周血等，利用相应的试剂盒提取其基因组DNA。
（2）EGFR基因特定片段扩增
采用本发明试剂盒分别配制EGFR基因外显子组合的含连接酶扩增体系，一共需要配制5管；所配制的5管扩增体系除了扩增引物和连接引物不同外其余均相同，如表1所示：
表1 EGFR基因外显子扩增体系（25uL）
同时配制对应的不含连接引物、耐热DNA连接酶缓冲液和耐热DNA连接酶这三种组分的对照扩增体系5管，体系配制参照表1，所缺组分添加量由灭菌去离子水替补，其余组份同对应的正常体系。
共5管正常体系（含连接酶体系）和5管对照体系（不含连接酶体系）在基因扩增仪上进行EGFR基因片段的扩增，扩增条件均为：95℃预变性5-10min；94℃变性15-30s，50-53℃退火45-90s，72℃延伸1-2min，循环30-36次；72℃终延伸10-12min。
（3）目的基因片段的割胶回收
所有的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在0.5ug/mL 的EB 溶液中染色20min并用清水脱色后置于凝胶成像***上拍照和分析。在对照体系成功扩增出目的基因片段的情况下，以DNA Marker条带为标准，选择正常体系中各外显子扩增产物浓度不低于10ng/uL的条带进行割胶，并用凝胶纯化试剂盒进行回收。
（4）目的基因片段序列测定
对于割胶回收产物，按照DNA片段测序的标准操作进行双向测序和分析，依据所有测序峰图最终分析目的基因片段的序列。
（5）EGFR突变结果判定
在对照体系正常扩增的情况下，如果正常体系中的各外显子扩增条带均无满足割胶回收的目的条带，则无需进行割胶回收及后续操作直接判定样品的EGFR基因检测结果为阴性即野生型；如果有满足割胶回收的目的条带，且双向测序结果显示为对应连接引物靶向的已知突变，则判定样品的EGFR基因检测结果为阳性即突变型,突变类型以实际测出的已知突变为准；如果双向测序结果均为同一未知差异位点，则需进一步判定样品的EGFR基因检测结果为新突变还是多态性，突变/多态性类型以实际测出的为准；如果双向测序结果均为野生型，则判定样品的EGFR基因检测结果为无法判断，需要重新测定；如果双向测序结果是一向为野生型一向为突变型，则判定样品的EGFR基因检测结果为无法判断，需要重新测定。
其中，步骤（1）中样本的采集对象若为肿瘤患者则应在其充分知情同意的前提下进行；采集或取出的组织样本包括但不限定于新鲜组织、冰冻组织、甲醛浸泡组织和甲醛固定石蜡包埋组织切片，血液样本包括但不限定于新鲜血液、血浆和血清，其它生物样本包括但不限定于胸水、腹水和肿瘤脱落细胞，样本采集或取用量等取样要求和前处理按照对应的基因组提取试剂盒执行；提取样本基因组DNA后，利用琼脂糖凝胶电泳或吸亮度法评估其提取量（浓度）和纯度，需要保证EGFR基因片段的有效扩增：如基因组DNA的提取量不少于200ng，纯度以OD260/ OD280在1.8-2.0之间为宜。
其中，步骤（2）中采用的扩增试剂盒组分如表2所示：
表2 本发明扩增试剂盒组分
表2组分中，DNA聚合酶的酶活力单位浓度为5U/uL，具有耐热性能；10×PCR缓冲液是由100mmol/L Tris-HCl（pH=8.3）、500mmol/L KCl和15mmol/L MgCl2组成；dNTPs是由dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mmol/L混合而成的；对应于EGFR基因的第18、19、20和21号外显子，每个外显子各自都有一对扩增引物（正向引物和反向引物），每条扩增引物的浓度均为10umol/L；对应于EGFR基因的第18、19、20和21号外显子，每个外显子各自都有一组靶向其上目标位点（即属可发生29种常见突变的位点）的连接引物，每条连接引物的浓度均为10umol/L；耐热DNA连接酶的酶活力单位浓度不低于4000U/uL，在正常体系下95℃保温1h酶活力不低于原酶活的60%；10×耐热DNA连接酶缓冲液为200 mM Tris-HCl、250 mM 乙酸钾、100 mM 乙酸镁、10 mM NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）、100 mM DTT（二硫苏糖醇）、1%Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚），pH=7.6。
其中，步骤（2）中外显子组合的扩增引物和连接引物及相关信息如表3所示：
表3 EGFR外显子的扩增引物和扩增片段大小以及连接引物和针对的突变类型信息
如表3所示，采用组合多重扩增可以在保证29种突变检测的前提下，最大程度减少所需要的检测管数，从而简化操作和节约成本。对应于表3，扩增引物和连接引物的序列及靶向信息如表4所示：
表4 扩增引物和连接引物序列及靶向信息
表4中SEQ.ID NO.9、11、13、15、17、19、21、23和25的5’端的第一个核苷酸均进行磷酸化修饰，SEQ.ID NO.10、12、14、16、18、20、22、24和26的5’端和3’端的第一个核苷酸均进行磷酸化修饰。
其中，步骤（2）中提供的是针对25uL的体系的组分及含量，可以作为其它体系如50uL等体系的配制依据。
其中，步骤（3）中琼脂糖凝胶电泳的样品上样量不少于15ul，对照体系扩增出的目的片段其电泳条带亮度用肉眼观察，应不低于DNA Marker的标准条带亮度（一般为5-10ng/uL）则表示扩增效果良好；此外由DNA Marker各标准条带的浓度，如某一片段为10ng/uL，则在同样上样量的情况下，只选择亮度与该标准条带相当的目的条带进行割胶回收（浓度低于10ng/uL的目的条带不进行割胶回收），如需要可借助凝胶成像***自带的软件或者美国BioRad公司的Quantity-one等凝胶分析软件进行条带亮度分析。
其中，步骤（4）中DNA片段的测序只需按照Sanger测序的标准操作进行即可，并无进一步改进或者变动；因此可以根据实际需要，按照要求送割胶回收产物到具有资质（如临床基因分析资质）的检测机构或公司进行测定，值得注意的是需要测序单位提供测序的原始数据报括峰图，以便根据自身需求进一步分析和解读。
其中，步骤（5）中作为突变判定的野生型的EGFR基因及其第18、19、20和21号外显子序列参照序列AY588246（GeneBank登录号）；对应于序列AY588246，第18、19、20和21号外显子序列的起止区域分别为156750-156872、157551-157649、164123-164308和174552-174707。
其中，步骤（5）中可直接判定为野生型的样本，仍可以将正常体系扩增的目的基因片段进行割胶测序，进一步确证。
其中，步骤（5）中双向测序结果均为同一未知差异位点假设为腺嘌呤核苷酸A，如有需要则可取正常细胞如血细胞（血液癌患者除外）当成基准，按照常规方法测定其对应的EGFR基因片段序列：如果正常细胞测出的结果也为A则判定为多态性，如果测出非A的结果则判定为未知突变。
其中，步骤（5）中如果需要重新检测EGFR基因突变情况（即双向测序结果均为野生型或一向为野生型一向为突变型）的，若再次采用本发明方法检测仍无法判定突变情况的，则可以建议改用其它测定方法。
其中，步骤（5）中根据得到的样品EGFR基因检测结果后，对照现有的临床结论或科研研究成果，临床医生告知对应的肿瘤患者预测其接受靶向药物治疗的受益情况。
其中，步骤（5）中肿瘤患者包括非小细胞肺癌但不限定于此，靶向药物包括吉非替尼和厄罗替尼但不限定于此。针对非小细胞肺癌，EGFR各单一突变和靶向药物吉非替尼和厄罗替尼使用的受益情况为：20外显子发生T790M突变和***，将预测TKI药物的耐药或者无效；其余突变均预测TKI药物治疗有效。
本发明的有益效果是，基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒，由于在EGFR基因片段扩增体系中引入耐热DNA连接酶和针对突变位点的特定连接引物体系，极大抑制了样品中的野生型EGFR基因的扩增，可以基于扩增片段条带直接判定野生型样本；或使得低突变含量样品其最终的PCR产物中突变片段的比例高于50%，从而保证了Sanger测序对于杂合基因片段体系的准确识别；本发明方法及试剂盒可以基于Sanger测序检测出样本中含量低至1%的EGFR基因突变，准确率极高，检测费用低廉并且还可能测出新的未知突变。
附图说明
图1是本发明基于连接抑制方法的原理示意图。图中“野”代表野生型基因组模板，“突”代表突变型基因组模板（其上的米字符号代表突变位点），箭头代表扩增引物及其延伸方向，L和R代表连接引物（其上的实心原点代表磷酸化修饰），三角形代表DNA聚合酶，圆圈代表DNA连接酶，退火53 ℃前的波浪号代表约等于，退火阶段L连接引物右端翘起代表其和突变位点不配对，延伸阶段扩增引物延伸出的虚线箭头代表DNA链延伸，延伸阶段连接引物右上角的倾斜虚箭头代表连接引物脱离突变型基因组模板，长连接引物是连接引物L和R经过DNA连接酶作用连接而成的。
图2是EGFR18的G719A突变杂合体样本扩增产物的电泳图谱。M代表DNA Marker，紧接着Marker的泳道1-5分别为对照体系的1-5管的扩增产物；泳道6-10分别为正常体系的1-5管的扩增产物。
图3是EGFR18的G719A(6239)杂合体测序峰图局部，图中圆圈和箭头标识处可见发生了GC的转换。
图4是EGFR19的L747_S752 del（6255）杂合体测序峰图局部，图中圆圈和箭头标识处可见发生了缺失。
图5是EGFR20的T790M(6240)杂合体测序峰图局部，图中圆圈和箭头标识处可见发生了GA（或CT）的颠换。
具体实施方式
一、基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒的原理
Sanger测序法是基因多样性/突变检测的金标准，目的基因片段是通过靶向其两端保守区域的引物对扩增得到的；对于复合模板如杂合子来源的核酸样本，若其中的扩增片段含量有小于10%的则难以通过测序准确识别该片段。肿瘤是体细胞疾病，由于体细胞突变组分只占临床等样本中的一部分，除此之外还可能存在大量的野生型基因，因此采用常规的Sanger测序无法保证此类样本基因突变检测的灵敏度需求。
针对Sanger测序法在EGFR基因突变检测中的不足，本发明提出了连接抑制的方法进行改进，图1是其原理示意图。本发明以EGFR基因的29种常见突变为对象，设计了靶向各突变位点的连接引物（SEQ.ID NO.9- SEQ.ID NO.26），使得各对连接引物和野生型基因对应突变位点的区域毗邻互补（两条连接引物都和模板完全互补并且毗邻）。由于在EGFR基因外显子的扩增体系中引入了耐热的DNA连接酶，则退火阶段（～53℃）时DNA连接酶将会连接位于野生型模板上的毗邻互补引物形成长的连接引物，而由于与突变型模板结合的两条连接引物在毗邻处（即突变位点处）没有和模板完全互补则不被连接。当体系处于下一阶段即72℃延伸时，由于结合于野生型模板上的长连接引物退火温度高于72℃，因此仍位于原处从而阻止野生型模板的扩增；而对于突变型模板，由于结合的是两条短的连接引物，其退火温度只有60℃左右，在72℃的温度下它们将和模板分离，因而不会阻碍模板的扩增。
假定肿瘤样本基因组中野生型模板的含量有100，突变模板含量只有1，目的片段以2的指数次方进行扩增；如果以连接引物对于野生型模板扩增的平均抑制效率仅为20%，则野生型目的片段的扩增产量为100*[2*(1-20%)]n（n为扩增循环数）,突变型目的片段的扩增产量为2n；经过21个循环，突变型目的片段的含量将超过野生型目的片段。由此可知通过本发明方法将使得最终样品中的野生型EGFR基因片段的扩增受到有效的抑制，而突变型的扩增则基本不受影响；因此使得突变含量低至1%的样品其最终的扩增产物中突变片段的比例高于50%，从而保证了Sanger测序对于杂合基因片段体系的准确识别。
本发明首次构建了循环DNA聚合和循环DNA连接联合体系，并且进一步优化了聚合和连接体系各组分的含量和比例，最终结合设计的靶向常见的EGFR基因突变的连接引物将其引入到EGFR基因突变的检测中；其中的各技术参数及应用构成了对应于本发明方法的试剂盒。
二、实施例
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于此。
本实施例以健康人血细胞扩增得到的EGFR基因片段为野生型模板，将其克隆到大肠杆菌工程菌中；利用重叠延伸PCR获得突变型的EGFR基因片段，将其克隆到大肠杆菌工程菌中，由此分别构建了EGFR基因野生型和突变型细胞系，在此基础上建立基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒。主要包括以下步骤：
（1）试剂盒中各组分的选用。
本发明试剂盒各组分选用信息如表5所示。
表5 试剂盒组分选用信息
表5组分中，rTaq DNA聚合酶的酶活力单位浓度为5U/uL，Taq DNA连接酶的酶活力单位浓度为4000U/uL，两者均具有良好的耐热性能。
（2）杂合样本制备和基因组DNA提取
参照文献（肖莉 ,EGFR基因缺失突变检测新技术及其应用于游离DNA检测的可行性 .苏州大学博士学位论文，2014；赵静，非小细胞肺癌EGFR基因突变检测试剂盒的开发.北京协和医学院博士学位论文，2011）中的方法构建含有EGFR基因第18-21四个外显子野生型和其上常见的29种突变型的E.coli DH5α工程菌细胞系，通过TA克隆、蓝白斑筛选和测序鉴定获取转入目的片段的阳性E.coli DH5α克隆子。然后用LB液体培养基培养阳性克隆子，按照EGFR基因第18-21四个外显子野生型菌等比例混合得到总的野生型菌（下面简称野生型菌），按总的野生型菌：突变型菌浓度比为100：1混合即得到了含有1%突变细胞比例的杂合体样本。本实施例选择的是EGFR18即18号外显子的G719A(6239)、EGFR19即19号外显子的L747_S752 del（6255）和EGFR20即20号外显子的T790M(6240)共3种突变类型的混合菌，而对于EGFR21即21号外显子则只用野生型菌；则本实施例包含了3种杂合体样本和1种纯合体样本共4个样本。采用TaKaRa公司的MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction KitVer.3.0提取样本的基因组DNA，共得到50uL。各样本基因组DNA的电泳未出现降解且亮度很好，证明提取效果良好；经测定提取量为1-2ug，A260/A280均位于1.8-2.0之间，符合扩增所需的量和纯度。
（3）EGFR基因特定片段扩增
采用本发明试剂盒分别配制上述的5管扩增体系，各管体系的扩增引物和连接引物组参照表3，其余组份均相同如表6所示：
表6 EGFR基因外显子扩增体系（25uL）
同时配制对应的5管不含连接引物、耐热DNA连接酶缓冲液和耐热DNA连接酶这三种组分（连接酶体系）的对照扩增体系，扩增引物参照表3，体系配制参照表6，所缺组分添加量由灭菌去离子水替补。
对于每个样本，共5管正常体系（含连接酶体系）和5管对照体系（不含连接酶体系）在基因扩增仪上进行EGFR基因片段的扩增，扩增条件均为：95℃预变性5min；94℃变性20s，50℃退火60s，72℃延伸1min，循环32次；72℃终延伸10min。
（4）目的基因片段的割胶回收
所有的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在EB 溶液(0.5ug/mL)中染色20min并用清水脱色后置于凝胶成像***上拍照和分析，以EGFR18的G719A突变杂合体样本为例其扩增产物的电泳图谱如图2所示，泳道1-5分别为对照体系的1-5管的扩增产物；泳道6-10分别为正常体系的1-5管的扩增产物。以北京天根公司的D2000 DNA Marker条带为标准（普通条带浓度约为10ng/uL），EGFR18的G719A突变的对照体系均可以成功扩增出目的基因片段，而正常体系中只有第1管的扩增产物条带明亮（浓度高于10ng/uL），其余4管的扩增产物条带微弱（浓度明显低于10ng/uL）。对于其余两种突变杂合体模板和EGFR21野生型纯合体模版，其对照体系均可以成功扩增出目的基因片段；而对于正常体系只有EGFR19的L747_S752 del突变杂合体样本的第2管和EGFR20的T790M(6240)突变杂合体样本的第5管出现明亮的目的条带，其余各管目的条带均十分微弱；而对于EGFR21纯合体样本的正常体系，5管的扩增条带均十分微弱；因此可以直接判定EGFR21纯合体样本为EGFR基因野生型，并分别割取EGFR18的G719A突变杂合体样本的第1管、EGFR19的L747_S752 del突变杂合体样本的第2管和EGFR20的T790M(6240)突变杂合体样本的第5管扩增产物条带，用生工生物工程(上海)股份有限公司的琼脂糖凝胶纯化试剂盒进行回收。
（5）目的基因片段序列测定
对于（4）中3个割胶回收产物，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序峰图如图3（仅展现单向测序图谱）所示。由图3可知，各杂合体系中突变位点处均出现了明显突变峰，且突变峰均不低于正常峰；进一步分析发现EGFR18峰图中GCC突变为GGC（相当于互补链的CGG突变为CCG），EGFR19峰图中GGAA后面出现了缺失突变，EGFR20峰图中GGT突变成GAT（相当于互补链的CCA突变为CTA）。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aatatcagcc ttaggtgcg 19
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<400> 4
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<210> 5
<211> 18
<212> DNA
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<400> 5
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<211> 18
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atacgagcac ctctggact 19
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tccttacttt gcctccttc 19
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<212> DNA
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gaattcaaaa agatcaaagt gctgg 25
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gctccggtgc gttcggcacg 20
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cccgtcgcta tcaaggaatt aaga 24
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gggggtccat ggctctgaac ctc 23
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caggaagcct acgtgatgg 19
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ccagcgtgga caacccc 17
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cgtggacaac ccccacg 17
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ctacgtgatg gccagcgt 18
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ccacgtgtgc cgcctg 16
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gcagctcatg cccttcg 17
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gtcaagatca cagattttgg gct 23
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ggccaaactg ctgggtg 17
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<211> 21
<212> DNA
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agattttggg ctggccaaac t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gctgggtgcg gaagaga 17
Claims (4)
1.一种基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的引物，其特征在于：所述引物由扩增引物组和连接引物组组成，所述连接引物组的核苷酸序列如SEQ.ID NO.9- SEQ.IDNO.26所示，所述引物必须同耐热DNA酶在同一反应体系下共同使用。
2.一种基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是在EGFR基因片段扩增体系中加入了如权利要求1所述的连接引物组、耐热DNA连接酶及其缓冲液。
3.根据权利要求2所述的基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs、8条扩增引物、18条连接引物、耐热DNA连接酶和耐热DNA连接酶缓冲液；所述8条扩增引物其序列如SEQ.ID NO.1- SEQ.IDNO.8所示，其中SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2、SEQ.ID NO.3和SEQ.ID NO.4 、SEQ.ID NO.5和SEQ.ID NO.6、SEQ.ID NO.7和SEQ.ID NO.8分别用于靶向第18、19、20、21号外显子片段的扩增；所述18条连接引物其序列如SEQ.ID NO.9- SEQ.ID NO.26所示，其中SEQ.ID NO.9和SEQ.ID NO.10靶向第18号外显子的3种突变位点，SEQ.ID NO.11和SEQ.ID NO.12靶向第19号外显子的19种突变位点，SEQ.ID NO.13-SEQ.ID NO.22靶向第20号外显子的5种突变位点，SEQ.ID NO.23-SEQ.ID NO.26靶向第21号外显子的2种突变位点。
4.根据权利要求3所述的基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶的酶活力单位浓度为5 U/μL ，具有耐热性能；所述PCR缓冲液是由pH=8.3的100mmol/L Tris-HCl、500mmol/L KCl和15mmol/L MgCl2组成；所述dNTPs是由dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mmol/L混合而成的；所述扩增引物的浓度均为10μmol/L ；所述连接引物的浓度均为10μmol/L ；所述耐热DNA连接酶的酶活力单位浓度不低于4000 U/μL ，在正常体系下95度保温1h酶活力不低于原酶活的60%；所述耐热DNA连接酶缓冲液的配制为20 mM Tris-HCl、25 mM 乙酸钾、10 mM 乙酸镁、1 mM NAD、10 mM DTT、0.1% TritonX-100，pH=7.6。
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