CN105255719A - 一种三维多孔微流控芯片及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三维多孔微流控芯片及其制备方法与应用。本发明以泡沫金属作为模板，用微流控芯片材料将其结构完整复制，再除去金属模板得到三维多孔材料；再将其硅烷化修饰，孔隙中填充温敏材料，与微流控芯片整合后，除掉温敏材料得到三维多孔微流控芯片。将三维多孔材料表面的功能基团活化后与生物分子偶联得到三维多孔微流控检测芯片。本发明的三维多孔微流控芯片可用于生物医学分析中，如用于循环肿瘤细胞的分离。本发明的三维多孔微流控芯片具有多孔性、高透明性、强韧性、生物相容性好等优点，其三维多孔结构可以固定大量的生物分子，能够高效率、高通量地对待测物进行分离。本发明三维多孔微流控芯片的制备简便易行、成本低、重复性好。

Description

一种三维多孔微流控芯片及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物、化学及材料科学领域，具体涉及一种三维多孔微流控芯片及其制备方法与应用。

背景技术

循环肿瘤细胞是由癌症病灶脱落进入外周血的肿瘤细胞，循环肿瘤细胞的检测对于肿瘤的早期诊断、个性化治疗的评估、药物评价以及手术预后等有重要意义。由于循环肿瘤细胞在血液中数目极少，对其分离造成了极大挑战。当前亟待开发出简单、高效、快速的分离循环肿瘤细胞的新方法。

微流控芯片是近年来发展迅速的技术，具有易集成、分析速度快、高通量、安全等优势，在肿瘤标志物检测、肿瘤细胞的分选、基因分析、药物合成筛选、生物试剂检测等领域有广泛的应用。但是目前微流控芯片的制备大多步骤繁琐、技术复杂、价格昂贵等，因此限制了其在生物医学分析领域的应用。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种三维多孔微流控芯片的制备方法及通过该方法得到的三维多孔微流控芯片。

本发明的另一目的在于提供一种三维多孔微流控检测芯片的制备方法及通过该方法得到的三维多孔微流控检测芯片。

本发明的再一目的在于提供所述三维多孔微流控芯片或检测芯片的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种三维多孔微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：

（1）将泡沫金属先后放入有机溶剂、水中分别超声清洗1-60分钟。

（2）将清洗后的泡沫金属浸入到液体微流控芯片材料中，在1000-8000rpm的转速下离心使微流控芯片材料充分浸润泡沫金属。

（3）将浸润了微流控芯片材料的泡沫金属在1000-6000rpm的转速下离心以除去泡沫金属孔隙中的微流控芯片材料，之后将包被了微流控芯片材料的泡沫金属加热使微流控芯片材料固化。

（4）将步骤（3）得到的微流控芯片材料包被的泡沫金属浸入到5-14mol/L的酸性溶液中1-12小时以除去泡沫金属，得到三维多孔材料。

（5）将三维多孔材料Plasma处理1-5分钟后浸入到浓度为1-50%的硅烷化试剂溶液中1-10小时，得到硅烷化试剂处理的三维多孔材料。

（6）将硅烷化处理的三维多孔材料浸入到浓度为1-50%的温敏材料溶液中，使温敏材料充分浸润多孔结构，变换温度使温敏材料凝固，得到温敏材料封堵的三维多孔材料。

（7）将步骤（6）得到的温敏材料封堵的三维多孔材料放在洁净的硅片上，倒入液体微流控芯片材料使其完全浸没三维多孔材料，放置1-24小时使微流控芯片材料充分固化。

（8）将覆盖固化微流控芯片材料的三维多孔材料的部分切下，打孔器分别在两端打进液口和出液口，Plasma处理1-5分钟后与载玻片键合，得到温敏材料封闭的微流控芯片。

（9）改变步骤（8）得到的微流控芯片的温度使温敏材料溶解，通入超纯水1-1000分钟将温敏材料冲洗干净得到三维多孔微流控芯片。

步骤（1）中所述的泡沫金属包括泡沫镍、泡沫铜、泡沫铝、泡沫合金等。

步骤（1）中所述的有机溶剂包括丙酮、甲苯、乙醇等。

步骤（2）中所述的微流控芯片材料包括聚二甲基硅氧烷（PDMS）、甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚碳酸酯（PC）、环烯烃共聚物树脂（COC）等。

步骤（4）中所述的酸性溶液包括硝酸、盐酸、硫酸溶液等。

步骤（5）中所述的硅烷化试剂包括羧基乙基硅烷三醇钠盐、γ-氨丙基三乙氧基硅烷等可以在芯片表面衍生羧基、氨基等功能基团的硅烷化试剂等。

步骤（6）中所述的温敏材料包括明胶、温敏壳聚糖等。

一种三维多孔微流控芯片，通过上述方法制备得到。所述的三维多孔微流控芯片的尺寸可调，孔径与泡沫金属材料的孔径相当。

一种三维多孔微流控检测芯片的制备方法，包括如下步骤：将上述三维多孔微流控芯片用化学交联剂活化后，通入1～500mg/mL的生物分子孵育0.5～10小时，再经PBS充分洗涤后得到生物分子修饰的三维多孔微流控芯片，即三维多孔微流控检测芯片。

所述的生物分子优选为用于特异性识别和捕获生物分子或细胞的蛋白或核酸，如抗体、链霉亲和素、凝集素、生长因子、核酸适配体等。

一种三维多孔微流控检测芯片，通过上述方法制备得到。

所述的三维多孔微流控芯片或三维多孔微流控检测芯片在生物医学分析中的应用，如血液中循环肿瘤细胞等特定细胞的分离、细胞外泌体的分离、游离RNA的分离、蛋白的分离等。

一种基于上述三维多孔微流控芯片分离血液中循环肿瘤细胞的方法，包括如下步骤：

（1）将含1-10%牛血清白蛋白和0.1-10%表面活性剂的溶液通入特异性识别和捕获肿瘤细胞的生物分子（如抗体或者核酸适配体等）修饰的三维多孔微流控芯片中，孵育封闭1-1000min，之后PBS冲洗。

（2）取癌症病人的新鲜血液1-10mL，以1-200μL/min的流速通入步骤（1）得到的生物分子修饰的三维多孔微流控芯片中，从而血液中的循环肿瘤细胞被所述生物分子捕获。

步骤（1）中所述的表面活性剂包括吐温、脱脂奶粉等。

本发明利用泡沫金属作为牺牲模板复制出三维多孔的材料，再利用温敏材料作为二次牺牲模板将三维多孔料整合到微流控芯片中，从而得到三维多孔微流控芯片。生物靶向分子通入交联剂活化的三维多孔微流控芯片中固定在多孔材料表面，得到生物靶向分子功能化的三维多孔微流控检测芯片，并将其成功用于循环肿瘤细胞的分离。

本发明具有如下优点和效果：

本发明制备的三维多孔微流控芯片具有多孔性、高透明性、强韧性、生物相容性好等优点。修饰了生物分子的三维多孔微流控检测芯片，其三维多孔结构可以固定大量的生物分子，实现对待测物的高效率、高通量分离。本发明操作简便易行、成本低、重复性好，在一般化学及生物化学实验室均能完成。

附图说明

图1是泡沫镍的扫描电镜图。

图2是由泡沫镍复制得到的三维多孔PDMS材料的扫描电镜图。

图3是FITC标记的二抗表征抗上皮细胞粘附因子抗体修饰的三维多孔微流控检测芯片的荧光显微图。

图4是抗上皮细胞粘附因子抗体修饰的三维多孔微流控检测芯片捕获人乳腺癌细胞的荧光显微图。

图5是血液通入到三维多孔微流控检测芯片中的结构图，1-固化的PDMS，2-三维多孔材料，3-进液口，4-出液口，5-载玻片，6-进液管，7-出液管。

图6是抗上皮细胞粘附因子抗体修饰的三维多孔微流控检测芯片从癌症病人血样中捕获到的循环肿瘤细胞和白细胞的结果图；其中，A、B、C、D为捕获到的癌细胞，E、F、G、H为白细胞，A、E为DAPI染色，B、F为CK-FITC染色，C、G为CD45-PE染色，D、H为前述三种染色的叠加图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

若未特别说明，本说明书中涉及溶液的浓度均为质量分数。

实施例1

（1）将泡沫镍（0.5mm×4mm×20mm）先后用丙酮、乙醇、超纯水分别超声清洗30分钟，之后烘箱干燥。图1为泡沫镍的扫描电镜照片，显示其三维多孔的结构。

（2）将干燥后的泡沫镍浸入到装满未交联的PDMS（聚二甲基硅氧烷）液体的2mL离心管中，8000rpm离心5分钟使PDMS充分浸润泡沫镍。

（3）将步骤（2）得到的PDMS浸润的泡沫镍转移到空的2mL离心管中，3000rpm离心3分钟以除掉泡沫镍孔隙中的PDMS，之后80℃烘箱加热3小时使PDMS固化。

（4）将步骤（3）得到的PDMS包覆的泡沫镍浸入到7mol/L的硝酸溶液中，刻蚀1小时以除掉镍模板，再用超纯水清洗掉残留的硝酸溶液，得到三维多孔材料。图2为三维多孔材料的扫描电镜照片，显示其完整的复制出了泡沫镍的三维多孔结构。

（5）将得到的三维多孔材料Plasma处理3分钟后立刻浸入到含5%羧基乙基硅烷三醇钠盐的磷酸盐缓冲液（PBS）中，室温下孵育4小时，再用超纯水清洗多余的羧基乙基硅烷三醇钠盐的磷酸盐缓冲液，得到羧基化的三维多孔材料。

（6）将羧基化的三维多孔材料浸入到15%的明胶溶液中使其完全浸没填充孔隙，取出三维多孔材料置于35℃以下待明胶凝固，得到明胶封堵的三维多孔材料。

（7）将步骤（6）得到的明胶封堵的三维多孔材料转移至洁净的硅片表面，加入未交联的PDMS液体使其完全淹没覆盖三维多孔材料，室温下放置12小时使PDMS充分交联固化。

（8）将覆盖固化PDMS的三维多孔材料的部分切下，打孔器在两端分别打进液口和出液口，Plasma处理3分钟后与载玻片键合，得到明胶封闭的微流控芯片。

（9）将明胶封闭的微流控芯片加热至50℃，以100μL/min的流速通入温水（38℃左右）40分钟充分冲洗掉残余明胶，得到三维多孔微流控芯片。

（10）将含有10mmol/L1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和10mmol/LN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的混合溶液以50μL/min的流速通入三维多孔微流控芯片中活化30分钟，之后以50μL/min的流速通入10μg/mL抗上皮细胞粘附因子抗体（eBioscience公司，Cat.No.:13-9326-82），室温下孵育1小时后再用PBS溶液以50μL/min的流速冲洗3分钟，即得到抗上皮细胞粘附因子抗体修饰的三维多孔微流控检测芯片。抗体修饰可以通过FITC标记的二抗进行表征，其荧光图片如图3所示，表示抗上皮细胞粘附因子抗体被成功修饰在三维多孔PDMS材料表面。

（11）取100个用DiI预染色的人乳腺癌细胞（MCF-7）分散于1mLPBS溶液中，以100μL/min的流速通入到抗上皮细胞粘附因子抗体修饰的三维多孔微流控检测芯片中，再以100μL/min的流速用PBS冲洗3分钟。将芯片置于倒置荧光显微镜下观察计数，平均捕获率达到91.7%以上。图4为被捕获到的MCF-7细胞的荧光显微照片。

实施例2

（1）将泡沫镍（1.2mm×4mm×20mm）先后用丙酮、乙醇、超纯水分别超声清洗30分钟，之后烘箱干燥。

（2）将干燥后的泡沫镍浸入到装满未交联的PDMS液体的2mL离心管中，6000rpm离心3分钟使PDMS充分浸润泡沫镍。

（3）将步骤（2）得到的PDMS浸润的泡沫镍转移到空的2mL离心管中，3000rpm离心3分钟以除掉泡沫镍孔隙中多余的PDMS，之后75℃烘箱加热4小时使PDMS固化。

（4）将步骤（3）得到的PDMS包覆的泡沫镍浸入到14mol/L的硝酸溶液中，刻蚀5小时以除掉镍模板，再用超纯水清洗掉残留的硝酸溶液，得到三维多孔材料。

（5）将得到的三维多孔材料Plasma处理3分钟后立刻浸入到含10%羧基乙基硅烷三醇钠盐的磷酸盐缓冲液（PBS）中，室温下孵育4小时，再用超纯水清洗多余的羧基乙基硅烷三醇钠盐的磷酸盐缓冲液，得到羧基化的三维多孔材料。

（6）将羧基化的三维多孔材料浸入到10%的明胶溶液中使其完全浸没填充空隙，取出三维多孔材料置于35℃以下待明胶凝固，得到明胶封堵的三维多孔材料。

（7）将步骤（6）得到的明胶封堵的三维多孔材料转移至洁净的硅片表面，加入未交联的PDMS液体，室温下放置24小时使PDMS充分交联固化。

（8）将覆盖固化PDMS的三维多孔材料的部分切下，用打孔器在两端分别打进液口和出液口，Plasma处理3分钟后与载玻片键合，得到明胶封闭的微流控芯片。

（9）将明胶封闭的微流控芯片加热至50℃，以100μL/min的流速通入温水40分钟充分冲洗掉残余明胶，得到三维多孔微流控芯片。

（10）将含有10mmol/LEDC·HCl和10mmol/LNHS的溶液以50μL/min的流速通入三维多孔微流控芯片中活化30分钟，之后以50μL/min的流速通入100μg/mL链霉亲和素（Sigma-AldrichCAS.9013-20-1），室温下孵育4小时，再以50μL/min的流速通入10μg/mL生物素化的抗上皮细胞粘附因子抗体（eBioscience公司，Cat.No.:13-9326-82），室温下孵育1小时后再以50μL/min的流速用PBS冲洗3分钟，即得到抗上皮细胞粘附因子抗体修饰的三维多孔微流控检测芯片。抗体修饰可以通过FITC标记的二抗进行表征。

（11）将含5%牛血清白蛋白和0.2%吐温的混合溶液以50μL/min的流速通入抗上皮细胞粘附因子抗体修饰的三维多孔微流控检测芯片，室温下孵育封闭1小时后用PBS以50μL/min的流速冲洗3分钟。

（12）取癌症病人新鲜的血液1mL，以100μL/min的流速通入到胎牛血清和吐温封闭后的抗上皮细胞粘附因子抗体修饰的三维多孔微流控检测芯片中（图5），之后以100μL/min的流速用PBS冲洗3分钟，除掉血细胞；然后以50μL/min的流速通入4%的多聚甲醛，室温下孵育30分钟，以50μL/min的流速用PBS冲洗多余的多聚甲醛；之后50μL/min的流速通入0.2%的TritonX100，4℃孵育30分钟，以50μL/min的流速用PBS冲洗多余的TritonX100；再以50μL/min的流速通入5%的牛血清白蛋白4℃封闭1小时，以50μL/min的流速用PBS冲洗3分钟；最后以50μL/min的流速通入含CK-FITC（绿色荧光）、CD45-PE（红色荧光）和DAPI（蓝色荧光）的溶液4℃孵育2小时，以50μL/min的流速用PBS清洗3分钟，置于倒置荧光显微镜下观察。循环肿瘤细胞确定为可同时标记DAPI蓝色荧光和CK-FITC的绿色荧光（尺寸大于10μm），白细胞确定为可以同时标记DAPI蓝色荧光和PE-CD45的红色荧光，代表性的细胞如图6所示。以上结果说明本发明的三维多孔微流控检测芯片可以用于循环肿瘤细胞的分离。

上述实施例表明本发明方法制备的三维多孔微流控检测芯片具有较好的分离效果，可用于生物医学研究领域。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种三维多孔微流控芯片的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将泡沫金属先后放入有机溶剂、水中分别超声清洗1-60分钟；

（2）将清洗后的泡沫金属浸入到液体微流控芯片材料中，在1000-8000rpm的转速下离心使微流控芯片材料充分浸润泡沫金属；

（3）将浸润了微流控芯片材料的泡沫金属在1000-6000rpm的转速下离心以除去孔隙中的微流控芯片材料，再加热使微流控芯片材料固化；

（4）将步骤（3）得到的微流控芯片材料包被的泡沫金属浸入到5-14mol/L的酸性溶液中1-12小时以除去泡沫金属，得到三维多孔材料；

（5）将三维多孔材料Plasma处理1-5分钟后浸入到浓度为1-50%的硅烷化试剂溶液中1-10小时，得到硅烷化试剂处理的三维多孔材料；

（6）将硅烷化处理的三维多孔材料浸入到浓度为1-50%的温敏材料溶液中，使温敏材料充分浸润多孔结构，变换温度使温敏材料凝固，得到温敏材料封堵的三维多孔材料；

（7）将步骤（6）得到的温敏材料封堵的三维多孔材料放在洁净的硅片上，倒入液体微流控芯片材料使其完全浸没三维多孔材料，放置1-24小时使微流控芯片材料充分固化；

（8）将覆盖固化微流控芯片材料的三维多孔材料的部分切下，打孔器分别在两端打进液口和出液口，Plasma处理1-5分钟后与载玻片键合，得到温敏材料封闭的微流控芯片；

（9）改变步骤（8）得到的微流控芯片的温度使温敏材料溶解，通入超纯水1-1000分钟将温敏材料冲洗干净得到三维多孔微流控芯片。

2.根据权利要求1所述的三维多孔微流控芯片的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的泡沫金属包括泡沫镍、泡沫铜、泡沫铝、泡沫合金；

步骤（2）中所述的微流控芯片材料包括聚二甲基硅氧烷、甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、环烯烃共聚物树脂；

步骤（6）中所述的温敏材料包括明胶、温敏壳聚糖。

3.根据权利要求1所述的三维多孔微流控芯片的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的有机溶剂包括丙酮、甲苯、乙醇；

步骤（4）中所述的酸性溶液包括硝酸、盐酸、硫酸溶液；

步骤（5）中所述的硅烷化试剂包括羧基乙基硅烷三醇钠盐、γ-氨丙基三乙氧基硅烷。

4.一种三维多孔微流控芯片，其特征在于：通过权利要求1-3任一项所述的方法制备得到。

5.一种三维多孔微流控检测芯片的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将权利要求4所述的三维多孔微流控芯片用化学交联剂活化后，通入1～500mg/mL的生物分子孵育0.5～10小时，再经PBS充分洗涤后得到三维多孔微流控检测芯片。

6.根据权利要求5所述的三维多孔微流控检测芯片的制备方法，其特征在于：所述的生物分子包括抗体、链霉亲和素、凝集素、生长因子、核酸适配体。

7.一种三维多孔微流控检测芯片，其特征在于：通过权利要求5或6所述的方法制备得到。

8.权利要求4所述的三维多孔微流控芯片或权利要求7所述的三维多孔微流控检测芯片在生物医学分析中的应用。

9.一种基于权利要求4所述的三维多孔微流控芯片分离血液中循环肿瘤细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将含1-10%牛血清白蛋白和0.1-10%表面活性剂的溶液通入特异性识别和捕获肿瘤细胞的生物分子修饰的三维多孔微流控芯片中，孵育封闭1-1000min，之后PBS冲洗；

（2）取癌症病人的新鲜血液1-10mL，以1-200μL/min的流速通入步骤（1）得到的生物分子修饰的三维多孔微流控芯片中，从而血液中的循环肿瘤细胞被所述生物分子捕获。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的表面活性剂包括吐温、脱脂奶粉。