CN105255703B - 用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控芯片及其观测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控芯片及其观测方法。该微流控芯片包括：基底以及固定于基底上方的功能层；其中，在所述功能层上形成功能小室阵列，在该功能小室阵列中各功能小室底部基底部分的上表面形成有电性隔离的第一电极和第二电极。本发明微流控芯片一次可以多组平行实验，通量高，从而大大降低了实验成本，实现了大序列细胞划痕迁移观测实验。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控芯片及其观测方法。
背景技术
细胞迁移参与了组织器官形成、组织损伤修复等重要生理过程；细胞迁移功能失调，则会导致肿瘤细胞侵袭及转移。通过促进或抑制细胞迁移可影响某些疾病(缺血性心血管疾病、肿瘤)的发生发展与转归，因此研究细胞迁移具有重要的理论意义与实用价值。
目前，传统的测定细胞迁移方法以细胞趋化小室法(Boyden Chamber)和划痕法最常用。前者由上、下两室组成，中间以微孔滤膜隔开。趋化因子加入下室，形成浓度梯度，细胞接种在上室，受趋化因子浓度梯度的影响，穿过膜上的微孔移动到另一侧。之后，细胞固定、染色和计数，以此确定其迁移能力。后者是用移液枪头在融合细胞上划出一道划痕，观察细胞向划痕区域的迁移情况，来判断细胞的迁移能力。
微流控芯片(微流控技术)，是微加工技术的产物。由于其通道尺寸与哺乳类细胞线性尺寸相比拟，多维网络结构与生理状态下细胞的空间特征相接近，已被广泛用于细胞生物学研究。Nie等于2007年提出一种利用层流形成细胞划痕的微流控芯片，见参考文献1。Cheng等于2008年提出一种直流电结合化学表面修饰实现细胞迁移的方法，见参考文献2。与传统方法比较，微流控技术具有尺寸可比拟，可控性好，精度高等优点。该些研究均说明了通过微流控技术研究细胞迁移的可行性。
在实现本发明的过程中，申请人发现现有的基于微流控的划痕技术，通量普遍较低，针对一个划痕实验的成本较高，难以大范围应用。
参考文献1：On-Chip cell migration assay using microfluidic channels，Biomaterials 28(2007)4017-4022；
参考文献2：An automatic and quantitative on-chip cell migration assayusing self-assembled monolayers combined with real-time cellular impedancesensing，Lab 0n a Chip-Miniaturisation for chemistry，biology&bioengineering，Volume 8，Number 6，June 2008，Page 837-992。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于上述技术问题，本发明提供了一种用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控芯片及其观测方法，以实现大序列细胞划痕迁移观测实验。
(二)技术方案
根据本发明的一个方面，提供了一种用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控芯片。该微流控芯片包括：基底以及固定于基底上方的功能层；其中，在功能层上形成功能小室阵列，在该功能小室阵列中各功能小室底部基底部分的上表面形成有电性隔离的第一电极和第二电极。
优选地，本发明微流控芯片中，第一电极为划痕电极，第二电极为加电电极，划痕电极上修饰具有抗蛋白吸附功能基团的分子，功能小室内具有细胞悬液；具有抗蛋白吸附功能基团的分子阻止细胞在划痕电极上吸附；当加电电极和划痕电极之间是加正向电压时，抗蛋白吸附的分子从划痕电极上脱离，细胞能在划痕电极上吸附。
根据本发明的再一个方面，还提供了一种利用上述微流控芯片进行细胞迁移观测的方法。该方法包括：步骤S202：用胰蛋白酶消化细胞，并用培养基重悬，并将悬浮状态的细胞接种至微流控芯片的功能小室；步骤S204：培养功能小室内的细胞，直至细胞在划痕电极以外的地方贴壁生长；步骤S206：在划痕小室的划痕电极和加电电极之间施加电压，并持续预设时间，使具有抗蛋白吸附功能基团的分子从划痕电极上脱离；步骤S208：移除含有抗蛋白吸附分子的培养基，更换成含有实验需要的趋化因子的培养基，拍照记录预设时间后细胞向划痕电极迁移的情况。
(三)有益效果
从上述技术方案可以看出，本发明用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控芯片及其观测方法具有以下有益效果：
(1)一次最多可以实现384组平行实验，通量高，从而大大降低了实验成本，并且，理论上来讲，芯片可以重复利用，使用过的芯片经过清 洗和无菌处理后，可以再次进行硫醇修饰，投入到划痕实验中，这又再次大大降低了实验成本；
(2)用电极控制划痕边界，用加电压的方法去除具有抗蛋白吸附功能基团的分子，可以保证各个划痕小室间划痕一致，且细胞和基质在此过程中不会受损，因此迁移结果精准可信。
附图说明
图1为本发明用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控芯片设计原理的示意图；
图2为根据本发明实施例用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控芯片的结构示意图；
图3为图2所示微流控芯片制备方法的流程图；
图4为图3所示微流控芯片制备方法中执行各步骤之后的划痕小室的剖面图；
图5为图2所示微流控芯片观测方法的流程图；
图6为图5所示微流控芯片观测方法中执行各个步骤之后的划痕小室内细胞状态的示意图。
具体实施方式
在对本发明进行介绍之前，首先对其设计原理进行说明。有一种功能基团为聚乙二醇长链(PEG)的硫醇分子。PEG功能基团具有抗蛋白吸附的特性。因此，如果将具有PEG功能基团的硫醇分子修饰到金属电极上的话，就可以阻止细胞吸附在电极表面。并且，在一定电压下，硫醇分子还可以从金属电极上脱离，从而细胞又可以在电极表面吸附生长了。
本发明将上述设计原理、微流控芯片技术与划痕实验相结合，提供了一种能够高通量的，可以实时观察细胞迁移的微流控芯片，并同时给出该微流控芯片的观测方法。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
在本发明的一个示例性实施例中，提供了一种用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控芯片。请参照图2，本实施例用于大序列细胞划痕迁移观 测的微流控芯片包括：基底以及固定于基底上方的功能层。
本实施例中，基底采用透明玻璃。而在本发明其他实施例中，还可以采用有机塑料、Al2O3片、MgO片作为基底制作微流控芯片。
本实施例中，功能层由聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，简称PDMS)制作，厚度为5mm，其上形成有划痕小室阵列，共16行24列共384个正方形的划痕小室。
请参照图2中C图，该划痕小室为向上开口的正方形小室，其边长3.7mm，相邻两划痕小室的中心间距4.5mm，与标准384孔板尺寸一致。在结构上，该微流控芯片与传统多孔板技术兼容，完全适应现有的多孔板平台。
可以理解的是，划痕小室的横截面形状不局限于正方形，其也可以是长方形、圆形，三角形等其他规则或不规则图形。并且，划痕小室的数量也不局限于384，也可以是96、24、12、6等其他标准规格多孔板的孔的数量，或者是设计者规定的其他数量。
如图2中C所示，每一划痕小室底部均具有相互隔开的两种电极-划痕电极和加电电极。其中，即在上表面形成有PEG。
同行划痕小室的划痕电极依次连接，并在微流控芯片的左侧与其它行划痕小室的划痕电极电性连接，形成总划痕电极。同样，同行划痕小室的加电电极依次连接，并在微流控芯片的右侧与其它行划痕小室的加电电极电性连接，形成总加电电极。
通过如此设计，可以通过微流控芯片左侧的总划痕电极和右侧的总加电电极对每一个划痕小室施加电压，在划痕小室内有溶液的情况下，就可以使其中的划痕电极上的PEG脱离，从而使细胞可以在划痕电极的上表面生长。
可以理解的是，本发明中每个划痕小室内电极的连接方式不局限于芯片设计部分所述的每行相连，也可以每列相连或其他连接方式。只要保证所有划痕小室的正极和负极分别相连且互不相交的连接方式，都可以采用。
请参照图2中C图，划痕电极位于划痕小室中央位置，为的Au电极层。并且，该划痕电极通过其在左右两侧的连接电极电性连接至同行相邻划痕小室的划痕电极。划痕电极呈直径1mm的圆形，而左右两 侧的连接电极呈条带形，其宽度为300μm。
请参照图1，硫醇分子在氢硫键的一侧形成金硫键，而固定在Au电极上，即划痕电极的上表面被硫醇化，由于硫醇分子上具有聚乙二醇长链(PEG)，因此，在划痕小室内有细胞悬液时，聚乙二醇长链(PEG)阻止细胞在该Au电极上吸附。
然而，需要说明的是，硫醇与Au的这种反应是可逆的，在一定电压作用下，金硫键断裂，硫醇脱落，在没有聚乙二醇长链(PEG)干扰的情况下，细胞悬液中的细胞就又可以在金表面贴壁生长了。
本实施例中，加电电极为Pt电极，厚度为位于划痕电极的前后两侧，并与划痕电极隔开400μm。并且，加电电极向左右两侧延伸，与同行其他划痕小室的加电电极电性连接。
需要说明的是，除了Pt电极之外，加电电极还可以采用Au电极、银电极或铜电极等金属电极，其厚度可以介于之间。此外，为了增强Au电极和Pt电极与玻璃基底的结合牢固度，在两者与玻璃基底之间，还沉积有钛(Ti)粘结层。
此外，粘结层的材料可以是钛(Ti)，也可以是铬(Cr)，只要能够增强电极和玻璃基底的粘附性即可，并且，在采用非玻璃基底是，可以不使用粘结层；
本领域技术人员应当清楚，每个划痕小室内，加电电极和划痕电极的图案不局限于图2中B图所示的形状，只要划痕电极和加电电极之间留有没有电极覆盖的玻璃表面，均实现本发明。但是，一般情况下划痕电极的面积要小于加电电极。
以下对图2所示微流控芯片的制备方法进行说明，请参照图3，该微流控芯片的制备方法包括：
步骤S102：制作PDMS划痕小室阵列；
该步骤S102具体又可以包括：
子步骤S102a：通过3D打印的方式制备PDMS阳模；
首先用三维绘图软件画出阳模的三维图，输入3D打印机软件，打印机就会自动打出图4中A图所示的阳模。
可以理解的是，浇注PDMS用的阳模，不只有3D打印一种方法，所 使用的材料也不局限于ABS塑料，任何能形成柱状阵列的方法和材料都可以用来制作PDMS阳模，如制作金属阳模。
子步骤S102b：在PDMS阳模内浇注PDMS：
PDMS与固化剂12∶1混合后，搅拌均匀，浇在3D打印的阳模上，80℃烘过夜使其固化，如图4中B图所示。
子步骤S102c：翻模得到具有划痕小室阵列的PDMS功能层：
固化后的PDMS翻模，得到384孔阵列，是为划痕小室，如图4中C图所示。
步骤S104：在玻璃基底上形成划痕电极和加电电极；
该步骤S104具体又可以包括：
子步骤S104a：在玻璃基底上制作Au电极的AZ1500阳模；
玻璃片在丙酮、乙醇和去离子水中依次清洗，烘干后表面均匀旋转涂敷一层AZ1500，放上掩模板曝光。在MIF300显影液中显影后，在需要溅射电极的位置暴露出玻璃表面，而不需要溅射电极的位置留下AZ1500形成的牺牲层，如图4中D图所示。
子步骤S104b：在具有AZ1500阳模的玻璃基底上溅射Ti/Au薄膜；
先溅射一层Ti打底作为粘结层，增强Au电极的吸附性，然后溅射一层Au，如图4中E图所示。
子步骤S104c：去除划痕电极位置之外的Ti/Au薄膜，形成划痕电极；
将玻璃片置于丙酮中浸泡，超声，直至金属层完全剥离，完成Au电极的制作，如图4中F图所示。
子步骤S104d：重复上述子步骤S104a～S104c，制备Ti/Pt薄膜的加电电极。
步骤S106：将PDMS制作的功能层和制作好Au电极和Pt电极的玻璃基底键合，得到完整芯片，如图4中G图所示；
步骤S108：在划痕小室中划痕电极上修饰硫醇；
修饰硫醇之前，先将完整芯片打氧处理，以去除掉Au表面的杂质，增强硫醇修饰的效果。而后，如图4中H图所示，在每个划痕小室内滴加用乙醇、去离子水或磷酸盐缓冲液(PBS)溶解的硫醇溶液，浸泡一段时间，使Au电极与硫醇发生反应，形成一层PEG。
其中，硫醇会只和金电极结合，形成PEG。PEG形成后，细胞就会选择性地只在没有PEG的表面贴壁生长。
至此，图2所示用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控芯片制作完成。
以下对利用图2所示微流控芯片进行大序列细胞迁移观测的观测方法进行说明。请参照图5，该观测方法包括：
步骤S202：用培养基消化细胞至悬浮状态，并将悬浮状态的细胞用排枪接种在微流控芯片的各个划痕小室，如图6中A图所示；
步骤S204：培养划痕小室内的细胞，直至细胞在划痕电极(Au)表面以外的地方贴壁生长，如图6中B图所示。
通常情况下，细胞贴壁后要更换一次培养基，去掉未贴壁的细胞，具体换液时间视细胞的不同情况而定。
此时细胞的生长状态是：在划痕电极(Au)的表面不贴壁生长，而在玻璃基底和加电电极(Pt)的表面会贴壁生长。
步骤S206：在微流控芯片的总划痕电极和总加电电极之间施加电压，总加电电极连接正极，总划痕电极连接负极，并持续预设时间，使划痕电极上的金硫键断裂；
一般进行划痕实验前，都要待细胞长满整个表面再进行。本实施例中，要保证每个划痕小室内有细胞培养基，以构建电化学反应的环境。划痕的操作方法是取一2.5V直流电源，将电源的负电极接到Au电极的总电极上，电源的正电极接到Pt电极的总电极上，并持续30s。而后，金硫键断裂，有PEG的硫醇分子又游离在溶液中，如图6中C图所示。Au电极表面没有了PEG，细胞又可以贴壁生长或者迁移至Au表面。
本领域技术人员应当清楚，在划痕实验中，用2.5V直流电源接通电极持续30s并不是固定参数，理论上直流电源电压可以是0.5V-2.5V，接通电源时间可以是10s-10min。
步骤S208：去硫醇步骤完成之后，先移除有硫醇分子的培养基，再按照具体实验需求，在不同划痕小室内加入有不同种类或浓度趋化因子的培养基，拍照记录一定时间后细胞向划痕电极(Au)表面迁移的情况，如图6中D图所示。
微流控芯片的观测方法介绍完毕，进入数据处理阶段，即：将细胞向 Au表面迁移的情况的显微照片进行数据处理，以得到细胞迁移的具体参数。分析的方法可以使用图像识别软件，识别Au表面未被细胞占据的面积，再通过不同种类或浓度趋化因子的迁移结果之间的对比，得到实验结论。
需要说明的是，在实验的过程中，可以根据实际需要在相应数量的孔内接种细胞，而无需一次实验中完全使用384个孔。而且，在加电去硫醇的步骤里，还可以移除部分孔内的培养基，进而破坏电化学反应的条件，使这些孔内的硫醇不被去掉，灵活可控。
至此，已经结合附图对本发明实施例进行了详细描述。依据以上描述，本领域技术人员应当对本发明微流控芯片及其观测方法有了清楚的认识。
此外，上述对各元件和方法的定义并不仅限于实施例中提到的各种具体结构、形状或方式，本领域普通技术人员可对其进行简单地更改或替换，例如：
(1)加电电极的铂电极可以用金电极替代：替代后原来作为负电极的金电极还为负电极，替代了铂电极的金电极用来作为正电极；
(2)基底还可以用玻璃之外的其他透明材料，例如有机塑料、Al2O3或MgO等来制备，而功能层还可以用PDMS之外的其他材料，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或树脂来制备，只要功能层能通过键合方式结合于基底上方即可；
(3)上述实施例以可以实时观察细胞迁移的划痕实验为例进行说明，而事实上，本发明给出了微流控芯片还可以应用于划痕实验之外的其他生物实验中，其大通量的特点具有独特的优势；
(4)本文可提供包含特定值的参数的示范，但这些参数无需确切等于相应的值，而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应值；
(5)实施例中提到的方向用语，例如“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等，仅是参考附图的方向，并非用来限制本发明的保护范围；
(6)除非特别描述或必须依序发生的步骤，上述制备方法和观测方法中各个步骤的执行顺序并无限制于以上所列，且可根据所需设计而变化或重新安排。
综上所述，本发明提供了一种用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控 芯片及其观测方法，其一次可以实现多组的平行实验，通量高，从而大大降低了实验成本；此外，在划痕实验中，用电极控制划痕边界，用加电压的方法去硫醇，可以保证各个划痕小室间划痕一致，且细胞和基质在此过程中不会受损，因此迁移结果精准可信，具有较好的应用前景。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种用于大序列细胞划痕迁移观测的微流控芯片，其特征在于，包括：基底以及固定于基底上方的功能层；
其中，在所述功能层上形成功能小室阵列，在该功能小室阵列中各功能小室底部基底部分的上表面形成有电性隔离的第一电极和第二电极；所述第一电极为划痕电极，所述第二电极为加电电极；
所述第一电极位于功能小室的中央位置；呈圆形，而左右两侧的连接电极呈条带形，该条带形的宽度小于所述圆形的直径；
所述第二电极位于所述第一电极的前侧和后侧，与所述第一电极隔开预设距离，呈条带形；
所述划痕电极上修饰具有抗蛋白吸附功能基团的分子，所述功能小室内具有细胞悬液；所述具有抗蛋白吸附功能基团的分子阻止细胞在划痕电极上吸附；当加电电极和划痕电极之间是加正向电压时，抗蛋白吸附的分子从划痕电极上脱离，细胞能在划痕电极上吸附。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述分子为硫醇分子，其上具有抗蛋白吸附功能基团，所述划痕电极由能够结合硫醇分子的金属材料制备。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述能够结合硫醇分子的金属材料为金。
4.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述抗蛋白吸附功能基团为聚乙二醇（PEG）长链-。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述加电电极与划痕电极之间的预设距离介于50μm～1mm之间。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：
所述划痕电极通过左右两侧的连接电极电性连接至同行相邻功能小室的划痕电极，同行功能小室的划痕电极依次连接，并在所述微流控芯片的一侧与其它行功能小室的划痕电极电性连接，形成总划痕电极；
所述加电电极向左右两侧延伸，与同行其他功能小室的加电电极电性连接，同行功能小室的加电电极依次连接，并在所述微流控芯片的另一侧 与其它行功能小室的加电电极电性连接，形成总加电电极。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述加电电极由金、银、铂或铜制备，其厚度介于之间。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述划痕电极和加电电极与基底之间，具有粘结层，以增强两者与基底之间的粘结力。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述功能小室的横截面形状为正方形、长方形、圆形或三角形。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述基底的材料为玻璃、有机塑料、Al2O3或MgO；
所述功能层采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或树脂材料制备，其通过键合的方式固定于基底上方。
11.一种观测方法，其特征在于，用于利用权利要求1至10中任一项所述的微流控芯片进行细胞迁移观测，包括：
步骤S202：用胰蛋白酶消化细胞，并用培养基重悬，并将悬浮状态的细胞接种至微流控芯片的功能小室；
步骤S204：培养功能小室内的细胞，直至细胞在划痕电极以外的地方贴壁生长；
步骤S206：在划痕小室的划痕电极和加电电极之间施加电压，并持续预设时间，使具有抗蛋白吸附功能基团的分子从划痕电极上脱离；
步骤S208：移除含有抗蛋白吸附分子的培养基，更换成含有实验需要的趋化因子的培养基，拍照记录预设时间后细胞向划痕电极迁移的情况。
12.根据权利要求11所述的观测方法，其特征在于，所述在划痕小室的划痕电极和加电电极之间施加电压，并持续预设时间的步骤中：
所述加电电极连接正极，划痕电极连接负极，所述电压介于0.5V-2.5V之间，所述预设时间介于10s-10min之间。
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