CN105254716B

CN105254716B - 一种韭菜籽抗氧化六肽及其制备方法与应用

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Publication number: CN105254716B
Application number: CN201510820291.3A
Authority: CN
Inventors: 洪晶; 陈涛涛; 张杨; 杨娟娟; 叶南慧; 孟春
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2015-11-24
Filing date: 2015-11-24
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2035-11-24
Also published as: CN105254716A

Abstract

本发明公开了一种韭菜籽抗氧化六肽及其制备方法与应用。该抗氧化六肽序列为Phe‑Pro‑Leu‑Pro‑Ser‑Phe（FPLPSF），体外实验表明，该多肽可以有效清除DPPH、ABTS、羟基自由基和超氧阴离子等自由基。本发明所涉及的抗氧化肽具有结构简单、抗氧化活力强等特点，可作为现有人工合成抗氧化剂的优良替代，对新型抗氧化保健品开发与应用方面具有重要价值。

Description

一种韭菜籽抗氧化六肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种韭菜籽天然抗氧化六肽及其制备方法和在食品领域中的应用，属于食品领域。

背景技术

我国是一个农业大国，农作物的种类繁多，但由于受加工技术条件的所限农作物的加工大都处于初级阶段，其加工后的残余物中仍有较大含量的蛋白质，而它们大多主要用于饲料工业或自然排放，不仅浪费了资源，同时也造成环境污染。植物活性肽概念的提出及分离检测技术的提高，使人们开始逐渐重视对富含蛋白质的农副产品的深加工并从中获得多种活性肽，如酪蛋白磷酸肽、降血压肽和易消化吸收肽等，植物来源活性肽的研究和开发对提高我国农产品深加工的附加值具有重要作用。

抗氧化剂近些年来在国内外发展很快，用途也越来越广。研究人为人体内氧化产生的自由基与人的衰老和许多疾病有关，因此抗氧化剂不仅用于含脂肪食品的抗氧化，而且作为功能因子用于保健食品及化妆品等的开发。抗氧化剂的种类很多，但一些化学合成的抗氧化剂如BHA、BHT等，由于其本身肯能具有毒副作用，各国政府纷纷对其强制规定了ADI值控制其过量添加。于是人们把目光逐步转向从各种植物和动物组织中提取天然抗氧化剂。抗氧化活性多肽由于低毒、高效等特点，作为食品和机体的抗氧化剂，被认为是人工合成抗氧化剂的理想替代者。

抗氧化肽能有效地清除体内过剩的活性氧自由基，保护细胞和线粒体的正常结构和功能，防止脂质过氧化的发生，而氧化与人类及其他动物的许多疾病诸如癌症、老化、动脉硬化等的发病机理有关。适当摄入具有抗氧化活性的物质可以降低体内自由基水平，防止脂质过氧化，帮助机体抵御疾病。

韭菜籽为我国常见食用蔬菜百合科植物韭菜Allium tuberosum Rottl干燥成熟的种子，韭菜籽（药典中常称为韭子）为我国传统中药品种，始载于《名医别录》，列为中品。据药典记载，韭菜籽具有温补肝肾、壮阳固精之功效。韭菜籽作为壮阳补肾用入药在我国民间已有数千年的历史。2002年我国***将其列为药食两用植物天然产物。韭菜籽这种植物种子资源在我国十分丰富，产量居世界首位。目前国内外一直以来对韭菜尤其是其种子韭菜籽的研究很少。国外还未对韭菜籽进行过化学成分和功效等方面的研究，国内化学成分方面的研究也并不多，迄今为止, 对其活性多肽或药理研究国内外都还几乎没有报道。因此，有必要充分利用我国十分丰富的韭菜（韭菜籽）植物资源，对其进行深入***研究，为实现韭菜籽中药现代化和开发新型、高效、安全的健康食品提供科学依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备简单，抗氧化活性强的韭菜籽抗氧化六肽，并且可以将该抗氧化六肽应用于保健食品的研制与开发。

本发明的一种抗氧化六肽，其氨基酸序列为Phe-Pro-Leu-Pro-Ser-Phe。用单字母表示为FPLPSF，即由苯丙氨酸-脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸-丝氨酸-苯丙氨酸6个氨基酸残基构成。

韭菜籽抗氧化肽的酶解制备方法：采用减提酸沉法得到韭菜籽蛋白，采用酸性蛋白酶将其在最佳酶解条件：pH 3.02、酶添加量1345.7U、底物浓度2%（w/v）、解酶时间6.45h，沸水浴10min灭活，经12000rpm离心20min，取上清液冷冻干燥，即为韭菜籽蛋白质酶解产物；

所述抗氧化六肽分离纯化方法：韭菜籽蛋白质酶解产物利用Sephadex G-25凝胶色谱进行分离，以去离子水为洗脱液，流速0.3 mL/min，测量洗脱组分214 nm波长处的吸光值；收集具有最佳抗氧化活性的峰，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进一步分离；RP-HPLC的洗脱梯度为0~5 min，5%（V/V）乙腈；5~40 min，5%~40%（V/V）乙腈；40-50 min，40%（V/V）乙腈；流速为2.0 mL/min，检测波长214 nm，收集洗脱时间为36~37min的洗脱峰，冷冻干燥即得所述抗氧化六肽。

本发明的优点在于：

所述抗氧化六肽具有强活性，对DPPH，羟基自由基，超氧阴离子和ABTS自由基都有强的清除作用，表明其在抗氧化活性开发和应用方面有重要价值。韭菜籽天然抗氧化六肽FPLPSF对DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基都具有较强的清除活力，当浓度为0.5mg/mL时，韭菜籽天然抗氧化六肽FPLPSF对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别为56.49±0.38%，93.90±2.64%，43.41±0.79%和30.09±1.80%。

附图说明

图1：韭菜籽提取物Sephedex G-25凝胶过滤色谱图。

图2：凝胶色谱洗脱峰A5反相高效液相色谱图。

图3：抗氧化六肽的质谱图。

图4：抗氧化六肽对ABTS自由基的清除作用。

具体实施方式

本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不仅限于下述的实施实例。

实施例1

本发明所述抗氧化六肽的分离纯化包括Sephadex G-25凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）两个步骤。

韭菜籽抗氧化六肽酶解产物的制备：采用酸性蛋白酶在其最佳酶解条件（pH3.02，酶添加量1345.7U, 底物浓度2%（w/v））下解酶时间6.45h，沸水浴10min灭活，经12000rpm离心20min，取上清液冷冻干燥，即为韭菜籽蛋白质酶解产物；

Sephadex G-25凝胶过滤色谱：将韭菜籽酶解产物冻干粉，溶解于去离子水中，12000 rpm离心15 min。取上清液用0.22 μm孔径微滤膜过滤。Sephadex G-50凝胶柱（1.6cm×100 cm）用去离子水平衡，将已过滤的样品上柱。用去离子水洗脱，流速0.3 mL/min，于214 nm波长处检测洗脱液吸光值，绘制洗脱曲线，如图1所示。收集洗脱峰峰5，冷冻干燥，-80 ℃低温保存备用。

高效液相色谱：去离子水溶解上述峰5冻干粉，采用RP-HPLC进一步分离。液相色谱***为LC-20A，装配Gemini 5μ C18 （250mm×10mm）反相柱（Phenomenex，UK），用水和乙腈（含0.05%（V/V）三氟乙酸）构成的洗脱***进行梯度洗脱。洗脱梯度：0~5 min，5%（V/V）乙腈；5~40 min，5%~40%（V/V）乙腈；40-50 min, 40%（V/V）乙腈；洗脱流速2.0 mL/min，检测波长214 nm，洗脱曲线如图2所示。收集洗脱留时间为36~37 min(洗脱峰16)，冷冻干燥即为本发明所述抗氧化六肽，命名为FF-6。

将收集到的抗氧化组分冷冻干燥，采用高效液相色谱检验所得到的组分纯度。经检测，该抗氧化肽组分纯度达到95%，可测定其氨基酸序列。

用液相色谱与质谱连用（LC-MS/MS）方法测定氨基酸序列（图3），得到FF-6的氨基酸序列FPLPSF。

实施例2

实施例1中得到的天然抗氧化六肽活性进行研究：

DPPH自由基清除作用：0.4 mL 不同浓度的样品与等体积的4%（W/V）DPPH无水乙醇溶液充分混合，室温下避光静置30 min，于517 nm下测定吸光值。用去离子水和还原型谷胱甘肽代替样品分别作空白对照和阳性对照。样品的DPPH自由基清除活力按下列公式（1）计算：

式中，A₀：空白对照组吸光值；A_s：样品组吸光值

ABTS自由基清除作用：用蒸馏水配制7 mmol/L的ABTS⁺溶液和2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液（使用前必须先在室温下放置16 h）,分别将ABTS⁺和过硫酸钾溶液按1∶1体积比混合,临用前用Ph 7.4 ，5 mmol/L 的磷酸盐缓冲溶液将混合液稀释至吸光值A₇₃₄ 为0.70±0.02。取0.5 mL不同浓度的样品和0.5 mL的ABTS自由基溶液混合静置10 min后于734 nm下测其吸光值。用去离子水和还原型谷胱甘肽代替样品分别作空白对照和阳性对照。ABTS自由基清除活力按下列公式（2）计算：

（2）

式中，A₀：空白对照组吸光值；A_s：样品组吸光值。

超氧阴离子自由基清除作用：取0.4 mL样品溶液加入50 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液（pH 8.3）0.4 mL，以蒸馏水代替样品做为空白对照管。震荡混匀，25℃水浴中保温10min后加入1.5 mmol/L的邻苯三酚盐酸溶液0.1 mL（25 ℃水浴预热），迅速混匀反应5 min，每隔30 s在320 nm 处测定吸光度值A₃₂₀。用去离子水和还原型谷胱甘肽代替样品分别作空白对照和阳性对照。作吸光值随时间变化的回归方程，曲线斜率为邻苯三酚自氧化速率，样品对超氧阴离子的清除活力按下列公式（3）计算：

（3）

式中，ΔA₀/min：空白对照组吸光值曲线斜率；ΔA_s/min：样品组吸光值曲线斜率。

羟基自由基清除活性：取100uL 样品与100uL 6.0mmol/L 硫酸亚铁、100uL6.0mmol/L 过氧化氢混合后在室温下避光孵育10min，加入10uL 6.0mmol/L的水杨酸反应30min，在510nm波长下测定反应物的吸光值。用蒸馏水做空白对照。羟基自由基的清除活性按下列公式（4）计算：

式中， A _s：实验组的吸光值；A ₀：不含过氧化氢的实验组的吸光值；A _b：空白对照组的吸光值

螯合铁活性：取100uL 样品与10uL 2.0mmol/L 氯化亚铁和270uL 去离子水混合在室温下孵育3分钟，加入20uL 5.0mmol/L的菲洛嗪，反应10min后再562nm波长下测定反应物的吸光值。用蒸馏水做空白对照。螯合铁活性用以下公式（5）计算：

式中，A _b：对照组吸光值；A _s：实验组吸光值。

经本实施实例测定，韭菜籽天然抗氧化六肽FPLPSF对DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基都具有较强的清除活力，当浓度为0.5mg/mL时，韭菜籽天然抗氧化六肽FPLPSF对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别为56.49±0.38%，93.90±2.64%，43.41±0.79%和30.09±1.80%（表1）。

表一. FF-6的抗氧化活性

所有试验的样品浓度为0.5mg/mL;

^a: DPPH 自由基清除活力;

^b: ABTS⁺自由基清除活力;

^c: 羟基自由基清除活力;

^d: 超氧自由基清除活力;

^e: 螯合活力。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种韭菜籽抗氧化六肽及其制备方法与应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 1

Phe Pro Leu Pro Ser Phe

1 5

Claims

1.一种韭菜籽抗氧化六肽，其特征在于：所述抗氧化六肽氨基酸序列为Phe-Pro-Leu-Pro-Ser-Phe。

2.一种如权利要求1所述的韭菜籽抗氧化六肽的制备方法，其特征在于：从天然韭菜籽中分离纯化或人工合成方法得到；具体步骤包括如下：

（1）韭菜籽蛋白酶解产物的制备：采用碱提酸沉法得到韭菜籽蛋白，采用酸性蛋白酶将其在最佳酶解条件下酶解:pH 3.02、酶添加量1345.7U、底物浓度2%（w/v）、解酶时间6.45h，沸水浴10min灭活，经12000rpm离心20min，取上清液冷冻干燥，即为韭菜籽蛋白质酶解产物；

（2）韭菜籽蛋白的酶解产物利用Sephadex G-25凝胶色谱进行分离，以去离子水为洗脱液，流速0.3 mL/min，测量洗脱组分214 nm波长处的吸光值；收集具有最佳抗氧化活性的峰，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进一步分离；RP-HPLC的洗脱梯度为0~5 min，5%（V/V）乙腈；5~40 min，5%~40%（V/V）乙腈；40-50 min，40%（V/V）乙腈；流速为2.0 mL/min，检测波长214 nm，收集洗脱时间为36~37min的洗脱峰，冷冻干燥即得所述抗氧化六肽。

3.一种如权利要求1所述的韭菜籽抗氧化六肽在制备抗氧化保健品中的应用。