CN105251051B

CN105251051B - 一种表面兼有抗菌性和生物相容性的材料及制备与应用

Info

Publication number: CN105251051B
Application number: CN201510769698.8A
Authority: CN
Inventors: 曾戎; 尤德强; 屠美; 赵剑豪; 李卫
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Guangzhou Baisilun Biological Technology Co ltd
Priority date: 2015-11-11
Filing date: 2015-11-11
Publication date: 2018-02-02
Anticipated expiration: 2035-11-11
Also published as: CN105251051A

Abstract

本发明公开一种表面兼有抗菌性和生物相容性的材料及制备与应用。本发明的制备方法，包括如下步骤：利用氨基硅烷偶联剂实现材料表面的氨基化，得到表面氨基化的材料；将得到的表面氨基化的材料与二醛反应实现材料表面的醛基化，得到表面醛基化的材料；将得到的表面醛基化的材料与磷酸二胆碱化壳聚糖盐反应实现材料表面的磷酸二胆碱化壳聚糖盐固定化，水洗，得到表面兼有抗菌性和生物相容性的材料。本发明采用的磷酸二胆碱化壳聚糖盐在生理环境下具有良好的细胞相容性、血液相容性和广谱抗菌性，可生物降解；且可在温和条件下固定在材料表面，获得表面兼有良好抗菌性和生物相容性的材料，适用于植入和介入性医疗器械。

Description

一种表面兼有抗菌性和生物相容性的材料及制备与应用

技术领域

本发明属于材料表面改性技术领域，具体涉及一种表面兼有抗菌性和生物相容性的材料及制备方法与应用。

背景技术

植入性生物材料或医学器械表面的细菌等微生物黏附及随后形成的生物膜是导致植入物感染和医疗器械故障失效的主要原因之一，严重威胁着人类的身体健康和生命安全。目前，采用抗菌剂涂层(活性抑菌)和形成抗生物黏附表面(惰性抑菌)是解决植入器械因微生物感染而引发并发症或失效的两种策略。前者的代表技术是表面偶联或涂覆抗菌材料，如含季铵、卤胺、胍及季膦的有机小分子抗菌剂和合成高分子抗菌剂、壳聚糖及其衍生物、含银化合物等无机抗菌剂等，能有效杀灭周围细菌微生物，但一方面植入材料或器械表面被杀死的细菌微生物仍然可能引发免疫反应和炎症，另一方面抗菌活性组分的含量随时间不断下降，影响抗菌有效期，并可能对正常细胞有毒性影响。后者的代表技术是表面引入具有抗蛋白质和细菌黏附功能的聚乙二醇或聚两性离子(如磷酸胆碱、磺基甜菜碱等)化合物，其自身能有效减少细菌黏附而抑制生物膜的形成，并具有良好的血液相容性和细胞相容性，但临床使用时仍然存在细菌引入而导致植入失败的风险。为此，构建一种集成抗菌性和生物相容性表面的改性方法被认为是解决上述问题的有效途径。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种表面兼有抗菌性和生物相容性的材料的制备方法。该制备方法主要是通过表面固定磷酸二胆碱化壳聚糖盐来实现。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的表面兼有抗菌性和生物相容性的材料。

本发明的再一目的在于提供所述表面兼有抗菌性和生物相容性的材料的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种表面兼有抗菌性和生物相容性的材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)利用氨基硅烷偶联剂实现材料表面的氨基化，得到表面氨基化的材料；

(2)将步骤(1)得到的表面氨基化的材料与二醛反应实现材料表面的醛基化，得到表面醛基化的材料；

(3)将步骤(2)得到的表面醛基化的材料与磷酸二胆碱化壳聚糖盐反应实现材料表面的磷酸二胆碱化壳聚糖盐固定化，水洗，得到表面兼有抗菌性和生物相容性的材料。

步骤(1)中所述的氨基硅烷偶联剂优选为3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)；

步骤(1)中所述的材料优选为金属、金属氧化物、陶瓷或高分子，必要时需进行预处理，使其可与氨基硅烷偶联剂反应；

步骤(1)中所述的氨基化的条件优选为室温氨基化24h；

步骤(2)中所述的二醛优选为丁二醛或戊二醛；

步骤(2)中所述的醛基化的条件优选为20～40℃醛基化12～24h；

步骤(3)中所述的磷酸二胆碱化壳聚糖盐的分子结构如式I所示：

其中x/n＝0～0.2，即壳聚糖的脱乙酰度为80％～100％；磷酸二胆碱基团的取代度为y/n，优选为y/n＝30％～90％；更优选为y/n＝30％～75％；n为结构式中重复单元数；R^-(反离子R)优选为：卤素离子、硝酸根、醋酸根或果酸根离子等。

所述的磷酸二胆碱化壳聚糖盐的制备方法，包括如下步骤：

将壳聚糖改性得到的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖(CsTr)溶于反应介质；加入双取代胆碱膦酸酯，其中6-O-三苯基甲醚化壳聚糖(CsTr)中的氨基与膦酸酯的摩尔比为1：(2～10)，0～40℃搅拌反应4～24h；旋干溶剂，加入甲酸，室温搅拌0.5～6h；旋干甲酸，用生理盐水和去离子水透析，冷冻干燥，得到磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐。

所述的壳聚糖改性得到的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖(CsTr)按照文献“S.J.Nishmura,O.Kohgo,K.Kurita,Macromolecules 24(1991)4745-4748.”中的制备方法制备得到；

所述的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖(CsTr)中的氨基与膦酸酯的摩尔比优选为1：(3～8)；

所述的搅拌反应的条件优选为0～40℃搅拌反应6～24h；

所述的室温搅拌的时间优选为1～6h；

所述的反应介质优选为二甲基乙酰胺、三乙胺和四氯化碳的混合溶液；其中每100mL二甲基乙酰胺中含有1～10g的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖，优选为含有1～1.25g；其中三乙胺、四氯化碳与6-O-三苯基甲醚化壳聚糖的氨基摩尔比例优选为6：4：1；

所述的双取代胆碱膦酸酯由氯化胆碱和对苯氧基膦酸酯按摩尔比2：1在二甲亚砜/吡啶混合溶剂中反应2小时制得；

步骤(3)中所述的固定化的条件优选为20～40℃固定化6～24h；

一种表面兼有抗菌性和生物相容性的材料，通过上述制备方法得到；

所述的表面兼有抗菌性和生物相容性的材料在医疗领域中的应用，特别适合用于制备植入性和介入性医疗器械。

本发明的原理：采用本发明方法制备表面兼有抗菌性和生物相容性的材料的反应过程如图1所示。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)与现有技术相比，本发明采用的抗菌剂磷酸二胆碱化壳聚糖盐在生理环境下具有良好的细胞相容性、血液相容性和广谱抗菌性，可生物降解；且可在温和条件下固定在材料表面，获得表面兼有良好抗菌性和生物相容性的材料，适用于植入和介入性医疗器械。

(2)磷酸二胆碱化壳聚糖盐是一种阳离子型细胞膜仿生壳聚糖衍生物，可生物降解，在生理环境下具有良好的细胞相容性、血液相容性和广谱抗菌性，将其固定在材料表面可有效集成抗菌性和生物相容性这两种性能，可广泛用于植入和介入性生物材料及医疗器械。

附图说明

图1是本发明的制备反应过程图。

图2是实施例4中表面固定磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐的钛片的ATR-FTIR谱图。

图3是实施例6中表面固定磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐的钛片的抗菌效果图；其中，图3A为表面处理的钛片；图3B为空白；图3C为未处理的钛片。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐的制备。

取200mg由壳聚糖(x/n＝0)改性得到的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖(CsTr)溶于20mL无水二甲基乙酰胺，同时加入0.42mL的三乙胺和0.19mL的四氯化碳；缓慢加入0.46g双取代胆碱膦酸酯，其中CsTr中的氨基与膦酸酯的摩尔比为1：3，0℃搅拌反应6小时；旋干溶剂，加入甲酸，室温搅拌1小时；旋干甲酸，用生理盐水和去离子水透析3天，冷冻干燥，得到磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐。其中磷酸二胆碱基团的取代度为30％。

实施例2磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐的制备。

取500mg由壳聚糖(x/n＝0.2)改性得到的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖(CsTr)溶于40mL无水二甲基乙酰胺，同时加入1.05mL的三乙胺和0.49mL的四氯化碳；缓慢加入2.3g双取代胆碱膦酸酯，其中CsTr中的氨基与膦酸酯的摩尔比为1：6，40℃搅拌反应12小时；旋干溶剂，加入甲酸，室温搅拌3小时；旋干甲酸，用生理盐水和去离子水透析3天，冷冻干燥，得到磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐。其中磷酸二胆碱基团的取代度为50％。

实施例3磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐的制备。

取300mg由壳聚糖(x/n＝0.1)改性得到的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖(CsTr)溶于30mL无水二甲基乙酰胺，同时加入0.63mL的三乙胺和0.29mL的四氯化碳；缓慢加入1.84g双取代胆碱膦酸酯，其中CsTr中的氨基与膦酸酯的摩尔比为1：8，25℃搅拌反应24小时；旋干溶剂，加入甲酸，室温搅拌6小时；旋干甲酸，用生理盐水和去离子水透析3天，冷冻干燥，得到磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐。其中磷酸二胆碱基团的取代度为75％。

实施例4钛表面磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐的固定化。

钛片分别用丙酮、乙醇和去离子水充分清洗，以除去粘附在表面的油脂和其它杂质，再采用5mol/L的NaOH水溶液于80℃反应24h，去离子水清洗后烘干；再将其放入2％(V/V)的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)乙醇溶液中室温反应24h，烘干，实现表面氨基化；将表面氨基化的钛片浸泡在2％(V/V)的戊二醛水溶液中40℃反应12h，实现表面醛基化；将表面醛基化的钛片浸泡在5mg/mL磷酸二胆碱化壳聚糖盐(实施例1制备)溶液中，40℃反应6h，然后去离子水清洗，实现表面的磷酸二胆碱化壳聚糖盐固定化，得到兼有抗菌性和生物相容性表面的钛片，其表面红外光谱如图2所示。

实施例5不锈钢表面磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐的固定化。

不锈钢分别用丙酮、乙醇和去离子水充分清洗，以除去粘附在表面的油脂和其它杂质，再采用5mol/L的NaOH水溶液于80℃反应24h，去离子水清洗后烘干；再将其放入2％(V/V)的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)乙醇溶液中室温反应24h，烘干，实现表面氨基化；将表面氨基化的不锈钢浸泡在2％(V/V)的戊二醛水溶液中室温反应24h，实现表面醛基化；将表面醛基化的不锈钢浸泡在5mg/mL磷酸二胆碱化壳聚糖盐(实施例1制备)溶液中，室温反应24h，然后去离子水清洗，实现表面的磷酸二胆碱化壳聚糖盐固定化，得到兼有抗菌性和生物相容性表面的不锈钢。

实施例6固定磷酸二胆碱化壳聚糖盐的钛表面的抑菌性能

以大肠杆菌(Escherichia coli)(市售)(革兰氏阴性菌)为细菌模型，测定实施例4制备的钛片表面固定磷酸二胆碱化壳聚糖盐(取代度＝30％)在37℃，pH＝7条件下的抑菌性。将大肠杆菌菌液OD₅₉₈＝0.1(10⁶～10⁸CFU/mL)100μL滴加在表面固定磷酸二胆碱化壳聚糖盐的钛片(1cm²)上，37℃恒温摇床内培养3h后，将其放入无菌水中超声10min，洗脱表面细菌。取50μL洗脱液均匀涂布于LB固体培养基中培养18h，观察细菌生长情况(见图3)，结果表明钛片表面固定磷酸二胆碱化壳聚糖盐抑菌率高于95％，满足抗菌材料对细菌的抑菌要求。

实施例7表面固定磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐的钛片的生物相容性评价

依据国家标准GB/T16886.4和16886.5测试实施例4制备的表面固定磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐的钛片体外生物相容性，包括细胞毒性和溶血率。结果表明表面固定磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐的钛片的溶血率为0.8％，满足医用材料低于5％的要求；对L929的细胞毒性为0级，具有良好的细胞相容性，满足医用材料对细胞相容性的要求。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种表面兼有抗菌性和生物相容性的材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(3)将步骤(2)得到的表面醛基化的材料与磷酸二胆碱化壳聚糖盐反应实现材料表面的磷酸二胆碱化壳聚糖盐固定化，水洗，得到表面兼有抗菌性和生物相容性的材料；

步骤(1)中所述的材料为金属、金属氧化物或高分子；

其中x/n＝0～0.2，即壳聚糖的脱乙酰度为80％～100％；磷酸二胆碱基团的取代度为y/n＝30％～90％；n为结构式中重复单元数；R^-为：卤素离子、硝酸根、醋酸根或果酸根离子；

步骤(1)中所述的氨基硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷；

步骤(2)中所述的二醛为丁二醛或戊二醛。

2.根据权利要求1所述的表面兼有抗菌性和生物相容性的材料的制备方法，其特征在于：

所述的磷酸二胆碱化壳聚糖盐的制备方法，包括如下步骤：

将壳聚糖改性得到的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖溶于反应介质；加入双取代胆碱膦酸酯，其中6-O-三苯基甲醚化壳聚糖中的氨基与膦酸酯的摩尔比为1：(2～10)，(0～40)℃搅拌反应4～24h；旋干溶剂，加入甲酸，室温搅拌0.5～6h；旋干甲酸，用生理盐水和去离子水透析，冷冻干燥，得到磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐。

3.根据权利要求2所述的表面兼有抗菌性和生物相容性的材料的制备方法，其特征在于：所述的反应介质为二甲基乙酰胺、三乙胺和四氯化碳的混合溶液；其中每100mL二甲基乙酰胺中含有1～10g的6-O-三苯基甲醚化壳聚糖，其中三乙胺、四氯化碳与6-O-三苯基甲醚化壳聚糖的氨基摩尔比例为6：4：1。

4.根据权利要求1所述的表面兼有抗菌性和生物相容性的材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的醛基化的条件为20～40℃醛基化12～24h；

步骤(3)中所述的固定化的条件为20～40℃固定化6～24h。

5.一种表面兼有抗菌性和生物相容性的材料，其特征在于：通过权利要求1～4任一项所述的制备方法得到。

6.权利要求5所述的表面兼有抗菌性和生物相容性的材料在医疗领域中的应用，其特征在于：所述的材料用于制备植入性和介入性医疗器械。