CN105251005A - 基于上转换的新型光控活细胞染色方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于上转换的新型光控活细胞染色方法及应用。本发明的技术方案包括三方面：1)稀土上转换纳米颗粒的合成：首先利用稀土盐为原料，通过溶剂热法制备出稀土上转换纳米颗粒。2)介孔硅壳层包覆的上转换纳米颗粒及表面光敏分子和靶向分子的修饰：采用模板法在上转换纳米颗粒外层包覆介孔硅，接着用偶氮苯和叶酸对其进行修饰。3)有机染料的包埋:将有机染料包埋至介孔中。本发明的优势：1)具有靶向作用，能够实现在肿瘤部位的精准定位。2)只有当外界980nm近红外光照射时，染料才能被释放，从而实现肿瘤部位的精准定时、定量着色。3)该染料投递载体可循环使用，以减少原料的使用及降低能耗，从而降低成本。

Description

基于上转换的新型光控活细胞染色方法及应用

技术领域

本发明涉及一种基于上转换纳米颗粒的光控染料释放并对活细胞进行靶向着色的新方法，属生物技术和医学领域。

背景技术

细胞染色技术是生命科学、基础医学和诊断学等领域非常重要的科研和临床诊断的手段之一。但是在活细胞中，普通染料(如罗丹明和4',6-二脒基-2-苯基吲哚等)很难通过细胞膜，使得活细胞的着色非常困难，所以传统细胞染色过程中，常常需要先用甲醛、丙酮等化学试剂将细胞固定,再用染料对细胞进行着色,这些化学试剂通常会破坏细胞膜，这一过程也就导致了细胞的死亡，无法实现活细胞的生理状态的观察。

目前，虽然在细胞染色过程中也出现了一些新型的活细胞染色试剂，可以顺利穿透细胞膜(比如钙黄绿素)来实现对活细胞的着色，但这些染料在释放时也常存在“着色时间和剂量不可控，半衰期短，无细胞特异性，无法对完整生物体进行着色”等缺陷，导致在细胞染色时常需要将组织块或者细胞群落分散成游离的单个细胞，再对其进行着色。这种染色方法对细胞着色无特异性，无法区分出正常细胞和肿瘤细胞，并且只能对细胞进行一次染色，而对***、增殖细胞的染色效果不理想。因此研制新型的活细胞染色技术，实现对活细胞乃至活体特异部位着色的新型染色技术具有重要的科研和临床应用价值。

发明内容

根据现有技术的不足，我们提出新型染料技术，主要集中于如何有效向活细胞中投递任意染料，并实现染料的定位定量释放。

具体技术方案如下：

本发明的基于上转换的光控活细胞染色方法；步骤如下：

1)利用纳米级染料载体***，将细胞浆染料或者细胞核染料包裹进入纳米颗粒的介孔中成为一个染料库；

2)利用染料载体***表面的靶向修饰功能，通过主动靶向作用将染料输送到所需细胞和组织；

3)利用纳米颗粒中的上转换核心作为光源转换器，将近红外光转换成原位的紫外光和可见光，位于纳米载体表面的大量光感分子在紫外光和可见光的驱动下构象发生反复变化，从而促进分子马达的运转。本发明便可以通过控制近红外光的照射部位和时间来选择性地将纳米颗粒内的有机染料释放出来，最终实现靶向细胞的可控制性着色。

所述的纳米颗粒；其包括稀土上转换纳米颗粒子核；核外包裹介孔二氧化硅壳层；壳层表面修饰光敏分子偶氮苯及靶向叶酸分子。

本发明所述的纳米颗粒制备方法，步骤如下：

(1)按照质量分数比为氯化钇：氯化镱：氯化铥＝(500～750):(150～250):0.3将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入溶剂水使上述物质完全溶解；在磁力搅拌条件，加热至沸腾，直至稀土盐溶液变成白色固体；

(2)水蒸干后，冷却至60～80℃，按照体积比为油酸：十八烯＝2～3:1将二者加入反应器中使白色固体完全溶解；

(3)按照质量数为NaOH：氟化铵＝1～6：3将二者加入的反应器中加入甲醇使其完全溶解，氟化铵与上述氯化铥的质量比＝3:1；调节温度升温到120～150℃，抽真空30～50min，通氩气；迅速升温到260～300℃，维持反应1～3h；结束后加入丙酮离心纯化，真空干燥处理后得到稀土上转换纳米颗粒。

所述的包裹介孔二氧化硅壳层的制备方法：采用公开的常津，王汉杰等发明(公开号：CN104771756A)，化疗用稀土上转换光控药物释放纳米制剂及其制备方法：

(1)取稀土上转换纳米颗粒：十六烷基三甲基溴化铵：氢氧化钠＝1：(50～200)：(5～20)将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入水使上述物质完全溶解，磁力搅拌条件下加热到50～80℃，搅拌1～2h；

(2)然后加入正硅酸乙酯，其中正硅酸乙酯与稀土上转换纳米颗粒的质量比＝0.01～0.5：1；反应1～2h后，离心纯化；

(3)将(2)中的颗粒分散到乙醇中，加入氯化钠作为除模板剂，其中氯化钠与颗粒的质量比＝10～50：1，磁力搅拌条件下加热到50～80℃，搅拌3～9h；反应完全后离心纯化，产物真空干燥处理后得到介孔硅壳层包覆的上转换纳米颗粒。

本发明所述的壳层表面修饰光敏分子偶氮苯及靶向叶酸分子的方法，步骤如下：

(1)按照物质的质量分数比为4-苯偶氮苯甲酰氯：叶酸：3-氨丙基三乙氧基硅烷＝1：(1～50)：(1～6)将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入溶剂二甲基亚砜将上述物质完全溶解，避光条件下搅拌5～10h；

(2)接着加入按照质量份数比碳二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺＝0.4:0.4～0.8，其中碳二亚胺与4-苯偶氮苯甲酰氯的质量份数比为0.4：1，继续搅拌3～9h后离心纯化，得到表面修饰光敏分子偶氮苯及靶向叶酸分子壳层。

本发明所述纳米颗粒装载有机染料的步骤如下：

(1)按照物质的质量分数比为上转换纳米纳米颗粒：有机染料＝1～10:1加入到反应器中，然后向反应器中加入二甲基亚砜溶剂将上述物质完全分散；

(2)在磁力搅拌条件下，搅拌6～12h，然后离心纯化，最终得到上转换光控染料释放的纳米载体，产物真空干燥处理，得到颗粒尺寸为80～150nm的纳米载体。

本发明所述基于上转换纳米颗粒的染色方法，步骤如下：

1)将制备好的上转换光控纳米染料载体颗粒与待染色活细胞共培养0.5～2h；

2)当纳米染料载体在靶向分子叶酸的作用下特异性地聚集到肿瘤部位后，给予具有组织穿透性的近红外激光照射；

3)穿透深部组织的激光被上转换纳米核捕获，在该部位产生相应的紫外光和可见光；

4)紫外光和可见光被纳米载体表面的光敏小分子偶氮苯吸收后，其构象发生反复变化，促进分子马达运转，从而控制染料的释放。

上述步骤中称取物质的质量为毫克级(mg)，称取的体积为毫升级(ml)。

本发明提供了一种上转换光控染料释放纳米载体的制备方法。如图3所示，其主要涉及三个部分内容即1)稀土上转换纳米颗粒的合成；2)稀土上转换纳米颗粒包覆介孔硅壳层及表面光敏分子和靶向分子的修饰以及有机染料的包埋。组装得到的稀土上转换光控染料释放的纳米载体的结构稳定，粒径均一，具有靶向定位，光控释放等优点。

本发明首先，如图4透射电镜测试结果显示，利用溶剂热法制备稀土上转换纳米颗粒(A)粒径小于50nm，粒度分布均匀，制备的稀土上转换光控染料释放纳米颗粒(B)粒径小于100nm，粒度分布均匀。如图5荧光发射光谱分析所示，制备的稀土上转换纳米载体颗粒能够在近红外光照射下，发出多重颜色的光如紫外光和蓝光等。如图6明场及暗场条件下照片显示，上转换纳米载体的宏观照片(A)和近红外照射条件下的荧光照片(B)。如图7进行细胞毒性实验结果表明，制备的上转换纳米载体的细胞毒性非常低。如图8装载有DAPI细胞核染料的纳米载体对人***细胞(Hela细胞)进行着色，当给予近红外光照射以后细胞的着色效果更加明显(C图)。

二、本发明的有益效果：

1)本发明涉及的稀土上转换光控染料释放纳米载体***的主要优势包括：操作简便，适用性强，成本低，在水中具有较好的分散性，能够同时实现染料在肿瘤组织处的定时、定量和定位释放。

2)本发明涉及的稀土上转换光控染料释放的纳米载体的主要性能指标包括：a)有效粒径在80～150nm之间，粒径更均匀，且可以根据载体的组成成分，实验条件等进行调节；b)稳定性好，可在水溶液中保存至少2个月以上；c)表面含有大量靶向分子叶酸，易于载体在肿瘤组织处的聚集；d)整个制备过程简单快捷，制备周期短，产率高，适合大批量生产。

本发明同传统的化疗载体相比具有如下优势：

附图说明

图1：稀土上转换纳米载体吸收近红外光转换为紫外光和可见光的并激活偶氮苯分子马达启动的作用机理图。

图2：上转换纳米载体光控染料释放的作用机理图。

图3：上转换光控染料释放纳米载体的制备方法流程图。

图4:按照实施例1合成的稀土上转换纳米颗粒(A)和按照实施例4制备光稀土上转换光控染料释放纳米载体颗粒(B)投射电子显微镜照片(形貌分析)。

图5：稀土上转换光控染料释放纳米载体荧光发射光谱分析。

图6：稀土上转换光控染料释放纳米载体的宏观照片(A)和近红外照射条件下的荧光照片(B)。

图7：稀土上转换光控染料释放纳米载体的细胞毒性分析。

图8：装载有DAPI细胞核染料的纳米载体对人***细胞(Hela细胞)进行着色，当给予近红外光照射后细胞的着色效果。

具体实施方式

下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

实施例1：

溶剂热法制备稀土上转换纳米颗粒(UCN)：

(1)称取24mgYCl3·6H2O,100mgYbCl3·6H2O和12mgTmCl3·6H2O，将上述三种物质加入到4ml水中，在磁力搅拌条件，加热至沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体。

(2)水蒸干后，冷却80℃，用移液管加入10ml油酸配体溶液及5ml十八烯配体溶液使白色固体完全溶解；

(3)接着加入20mgNaOH和60mg氟化铵，用5ml甲醇溶解；调节温度升温到130℃，采用油泵抽真空40min，通氩气；迅速升温到280℃，维持反应1h；结束后加入30ml丙酮离心纯化，最终产物真空干燥处理后保存。制备的稀土上转换纳米颗粒粒径为20～30nm。图4：按照实施例1合成的稀土上转换纳米颗粒。

实施例2：

溶剂热法制备稀土上转换纳米颗粒(UCN)：

(1)称取12mgYCl3·6H2O,100mgYbCl3·6H2O和12mgTmCl3·6H2O，将上述三种物质加入到5ml水中，在磁力搅拌条件，加热至沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体。

(2)水蒸干后，冷却70℃，用移液管加入15ml油酸配体溶液及5ml十八烯配体溶液使白色固体完全溶解；

(3)接着加入10mgNaOH和60mg氟化铵，用10ml甲醇溶解；调节温度升温到120℃，采用油泵抽真空50min，通氩气；迅速升温到260℃，维持反应2h；结束后加入20ml丙酮离心纯化，最终产物真空干燥处理后保存。

实施例3：

溶剂热法制备稀土上转换纳米颗粒(UCN)：

(1)称取24mgYCl3·6H2O,50mgYbCl3·6H2O和6mgTmCl3·6H2O，将上述三种物质加入到6ml水中，在磁力搅拌条件，加热至沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体。

(2)水蒸干后，冷却80℃，用移液管加入10ml油酸配体溶液及5ml十八烯配体溶液使白色固体完全溶解；

(3)接着加入60mgNaOH和30mg氟化铵，用5ml甲醇溶解；调节温度升温到150℃，采用油泵抽真空30min，通氩气；迅速升温到300℃，维持反应3h；结束后加入40ml丙酮离心纯化，最终产物真空干燥处理后保存。

实施例4：

介孔硅壳层包覆的上转换纳米颗粒及表面光敏分子和靶向分子的修饰以及罗丹明染料的装填：

a)稀土上转换纳米颗粒包覆介孔硅壳层(UCNmSiO₂)：

(1)按照物质的质量，分别称取10mg稀土上转换纳米颗粒，2000mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和10mg氢氧化钠加入到反应器中，然后向反应器中加入溶剂水30ml使上述物质完全溶解，磁力搅拌条件下加热到70℃，搅拌1h。

(2)最后加入200ul正硅酸乙酯(TEOS)，反应2h后，离心纯化。

(3)将制备好的颗粒重新分散到40ml乙醇中，接着加入0.6g氯化钠除模板剂，磁力搅拌条件下加热到60℃，搅拌6h。反应完全后离心纯化，最终产物真空干燥处理后保存。

b)表面光敏分子和靶向分子的修饰：

(1)分别称取50mg4-苯偶氮苯甲酰氯，50mg叶酸和20ul3-氨丙基三乙氧基硅烷将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入5ml二甲基亚砜溶剂将上述物质完全溶解，避光条件下搅拌8h。

(2)接着分别加入20mg碳二亚胺(EDC)和30mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。继续搅拌6h后。

(3)加入500mg制备好的介孔硅壳层包覆的上转换纳米颗粒，反应10h后离心纯化，得到表面功能化修饰的稀土上转换纳米颗粒包覆介孔硅壳层的纳米颗粒，产物真空干燥处理后保存。

c)DAPI染料的装填：

(1)称取50mg表面功能化修饰的稀土上转换纳米颗粒包覆介孔硅壳层纳米颗粒和1mgDAPI染料，将上述两种原料加入5ml乙醇溶液中。

(2)磁力搅拌条件下，搅拌9h，然后离心纯化，最终得到稀土上转换光控染料释放的纳米载体，产物真空干燥处理后保存。

实施例5：

介孔硅壳层包覆的上转换纳米颗粒及表面光敏分子和靶向分子的修饰以及细胞核染料的装填：

a)稀土上转换纳米颗粒包覆介孔硅壳层(UCNmSiO₂)：

(1)按照物质的质量，分别称取10mg稀土上转换纳米颗粒，1000mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和10mg氢氧化钠加入到反应器中，然后向反应器中加入溶剂水25ml使上述物质完全溶解，磁力搅拌条件下加热到80℃，搅拌1h。

(2)最后加入100ul正硅酸乙酯(TEOS)，反应2h后，离心纯化。

(3)将制备好的颗粒重新分散到50ml乙醇中，接着加入0.9g氯化钠除模板剂，磁力搅拌条件下加热到50℃，搅拌9h。反应完全后离心纯化，最终产物真空干燥处理后保存。

b)表面光敏分子和靶向分子的修饰：

(1)分别称取60mg4-苯偶氮苯甲酰氯，30mg叶酸和10ul3-氨丙基三乙氧基硅烷将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入3ml二甲基亚砜溶剂将上述物质完全溶解，避光条件下搅拌6h。

(2)接着分别加入20mg碳二亚胺(EDC)和40mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。继续搅拌8h后。

(3)加入300mg制备好的介孔硅壳层包覆的上转换纳米颗粒，反应12h后离心纯化，得到表面功能化修饰的稀土上转换纳米颗粒包覆介孔硅壳层的纳米颗粒，产物真空干燥处理后保存。

c)细胞核染料的装填：

(1)称取3mg4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料，将上述两种原料加入6ml乙醇溶液中。

(2)磁力搅拌条件下，搅拌9h，然后离心纯化，最终得到稀土上转换光控染料释放的纳米载体，产物真空干燥处理后保存。

实施例6：

介孔硅壳层包覆的上转换纳米颗粒及表面光敏分子和靶向分子的修饰以及细胞核染料的装填：

a)稀土上转换纳米颗粒包覆介孔硅壳层(UCNmSiO₂)：

(1)按照物质的质量，分别称取5mg稀土上转换纳米颗粒，2000mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和20mg氢氧化钠加入到反应器中，然后向反应器中加入溶剂水35ml使上述物质完全溶解，磁力搅拌条件下加热到50℃，搅拌2h。

(2)最后加入150ul正硅酸乙酯(TEOS)，反应1h后，离心纯化。

(3)将制备好的颗粒重新分散到30ml乙醇中，接着加入1.2g氯化钠除模板剂，磁力搅拌条件下加热到80℃，搅拌3h。反应完全后离心纯化，最终产物真空干燥处理后保存。

b)表面光敏分子和靶向分子的修饰：

(1)分别称取30mg4-苯偶氮苯甲酰氯，50mg叶酸和20ul3-氨丙基三乙氧基硅烷将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入6ml二甲基亚砜溶剂将上述物质完全溶解，避光条件下搅拌9h。

(2)接着分别加入30mg碳二亚胺(EDC)和30mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。继续搅拌6h后。

(3)加入400mg制备好的介孔硅壳层包覆的上转换纳米颗粒，反应9h后离心纯化，得到表面功能化修饰的稀土上转换纳米颗粒包覆介孔硅壳层的纳米颗粒，产物真空干燥处理后保存。

c)细胞核染料的装填：

(1)称取5mg4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料，将上述两种原料加入9ml乙醇溶液中。

(2)磁力搅拌条件下，搅拌12h，然后离心纯化，最终得到稀土上转换光控染料释放的纳米载体，产物真空干燥处理后保存。

实施例7：

形态观察、粒径及其分布测定。取样品溶液经超速离心分离后，取出沉淀物，加蒸馏水少量使分散，滴于碳支持膜上制样，在透射电镜下观察其形貌状态并拍照。透射电镜下观察到化疗用稀土上转换光控药物释放纳米制剂颗粒呈均匀规则的球形粒子。实验测得的化疗用稀土上转换光控药物释放纳米制剂粒径分布均匀，在80～150nm范围内可控。所制得的纳米粒子如图4所示。

实施例8：

MTT法测试光控热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米制剂的细胞毒性：

1)取处于对数生长期的小鼠成纤维细胞，0.125％胰蛋白酶消化后充分吹打成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度为5×10⁴/m1。

2)向96孔板的每孔中加入100μl细胞悬液，在37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。

3)将120μl含有一定浓度的化疗用稀土上转换光控药物释放纳米制剂溶液加入到新鲜培养基中，并在37℃，5％CO₂培养箱中通细胞共培养24h。

4)24h后取出培养板，向每个孔中加入10μlMTT溶液，在37℃，5％CO2培养箱中继续培养4h后，小心吸取培养孔中的培养基，向每个孔中加入200μlDMSO(二甲基亚砜)溶液，在摇床上摇动20min，使DMSO溶液充分地溶解Formazan晶体。

5)用酶联免疫检测仪在570nm波长处，以空白管调零，测定各孔的吸光值A，按下式计算细胞存活率。每组设8个平行，计算其平均值。

细胞存活率(％)＝实验细胞组吸光值(A2)/空白细胞组吸光值(A1)*100％

实施例9：

装载有DAPI细胞核染料的纳米载体对活的Hela细胞进行着色：

1)将Hela按1×10⁵细胞/孔均匀铺在24孔细胞培养板中，在37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时。

2)取0.1毫克按实施例3制备的纳米载体，加入至0.5毫升的DMEM细胞培养液中充分混匀。

3)取出细胞培养板，吸去培养液，每孔加入2)中的纳米载体和细胞培养液，于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养4h后，用3.5W的980nm近红外光间歇照射5分钟，然后再静止10分钟，最后小心吸取培养孔中的培养基，向每个孔中加入1毫升PBS清洗3遍，在荧光显微镜下检测细胞核的着色情况。

图8：装载有DAPI细胞核染料的纳米载体对人***细胞(Hela细胞)进行着色，当给予近红外光照射后细胞的着色效果。

Claims (7)

1.一种基于稀土上转换光控染料投递的纳米颗粒；其特征是包括稀土上转换纳米颗粒子核；核外包裹介孔二氧化硅壳层；壳层表面修饰光敏分子偶氮苯及靶向叶酸分子。

2.如权利要求1的稀土上转换光控染料投递纳米载体转换方法，其特征是步骤如下：

1)将制备好的上转换光控纳米染料载体颗粒通过静脉注射或局部注射的方式给药；

2)当纳米染料载体在靶向分子叶酸的作用下特异性地聚集到肿瘤部位后，给予具有较强组织穿透性的近红外激光的照射；

3)穿透深部组织的激光被上转换纳米核捕获，在该部位产生相应的紫外光和可见光；

4)紫外光和可见光被纳米载体表面的光敏小分子偶氮苯吸收后，其构象发生反复变化并充当一个分子马达的作用，从而控制染料的释放。

3.权利要求1的稀土上转换光控染料投递纳米载体制备方法，其特征是步骤如下：

1)稀土上转换纳米颗粒的合成：利用各种稀土盐为原料，通过溶剂热制备出稀土上转换纳米颗粒；

2)稀土上转换纳米颗粒外包覆介孔硅壳：采用溶胶凝胶法合成介孔硅层；

3)进行硅壳层表面光敏分子和靶向分子的修饰：将叶酸靶向分子和光敏偶氮苯分子连接在介孔硅壳层的表面；

4)将有机染料染料包埋到上转换纳米载体介孔中。

4.如权利要求3所述的方法，其特征是所述的稀土上转换纳米颗粒的合成方法如下：

(1)按照质量分数比为氯化钇：氯化镱：氯化铥＝(500～750):(150～250):0.3将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入溶剂水使上述物质完全溶解；在磁力搅拌条件，加热至沸腾，直至稀土盐溶液变成白色固体；

(2)水蒸干后，冷却至60～80℃，按照体积比为油酸：十八烯＝2～3:1将二者加入反应器中使白色固体完全溶解；

(3)按照质量数为NaOH：氟化铵＝1～6：3将二者加入的反应器中加入甲醇使其完全溶解，氟化铵与上述氯化铥的质量比＝2～3:1；调节温度升温到120～150℃，抽真空30～50min，通氩气；迅速升温到260～300℃，维持反应1～3h；结束后加入丙酮离心纯化，真空干燥处理后得到稀土上转换纳米颗粒。

5.如权利要求3所述的方法，其特征是所述上转换纳米颗粒外包覆介孔硅壳的制备方法如下：

(1)按照物质的质量份数比为稀土上转换纳米颗粒：十六烷基三甲基溴化铵：氢氧化钠＝1：(50～200)：(5～20)将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入水使上述物质完全溶解，磁力搅拌条件下加热到50～80℃，搅拌1～2h；

(2)然后加入正硅酸乙酯，其中正硅酸乙酯与稀土上转换纳米颗粒的质量比＝0.01～0.5：1；反应1～2h后，离心纯化；

(3)将(2)中的全部颗粒分散到乙醇中，加入氯化钠作为除模板剂，其中氯化钠与颗粒的质量比＝10～50：1，磁力搅拌条件下加热到50～80℃，搅拌3～9h；反应完全后离心纯化，产物真空干燥处理后得到介孔硅壳层包覆的上转换纳米颗粒。

6.如权利要求3所述的方法，其特征是所述硅壳层表面光敏分子和靶向分子的修饰的方法，其特征是步骤如下：

(1)按照物质的质量分数比为4-苯偶氮苯甲酰氯：叶酸：3-氨丙基三乙氧基硅烷＝1：(1～50)：(1～6)将原料加入到反应器中，然后向反应器中加入溶剂二甲基亚砜将上述物质完全溶解，避光条件下搅拌5～10h；

(2)接着加入按照质量份数比碳二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺＝0.4:0.4～0.8，其中碳二亚胺与4-苯偶氮苯甲酰氯的质量份数比为(0,1～0.4)：1，继续搅拌3～9h；

(3)然后加入介孔硅壳层包覆的上转换纳米颗粒，其中纳米颗粒与4-苯偶氮苯甲酰氯的质量比＝10～50：1，反应5～10h后离心纯化，得到稀土上转换光控染料释放纳米载体。

7.如权利要求3所述的方法，其特征是所述有机染料染料包埋到上转换纳米载体介孔中的方法：步骤如下：

(1)按照物质的质量分数比为上转换纳米载体：有机染料＝1～10:1加入到反应器中，然后向反应器中加入二甲基亚砜溶剂将上述物质完全分散；

(2)在磁力搅拌条件下，搅拌6～12h，然后离心纯化，最终得到上转换光控染料释放的纳米载体，产物真空干燥处理，得到颗粒尺寸为80～150nm的纳米载体。