CN105246489B - 含有人参皂苷rf的皮肤外用剂组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有人参皂苷Rf作为有效成分的组合物。所述组合物能够提供改善痤疮及皮肤问题的效果、收敛皮肤及收缩毛孔的效果，并且能够提供改善皮肤血色的效果、促进毛发生长、改善白发、抗头皮屑及防腐效果。

Description

含有人参皂苷RF的皮肤外用剂组合物
技术领域
本发明涉及一种组合物，所述组合物含有人参皂苷Rf(Ginsenoside Rf)，从而能够提供改善痤疮及皮肤问题的效果、收敛皮肤及收缩毛孔的效果，并且能够提供改善皮肤血色的效果、促进毛发生长、改善白发、抗头皮屑及防腐效果。
背景技术
皮肤作为人体的第一道防御屏障，具有使得体内器官免受诸如温度及湿度变化、紫外线、公害物质的外部环境的刺激而保护体内器官的功能。随着年龄的增长，皮肤将由于内在、外在因素而发生变化。即，从内在方面来说，由于调节新陈代谢的各种激素分泌将减少，并且免疫细胞的功能和细胞活性将降低，因此人体所需的免疫蛋白及生物体组成蛋白的生物合成将减少。从外在方面来说，由于臭氧层的破坏，从太阳光线中到达地表的紫外线含量将增加，并且随着环境污染的深化，自由基及活性氧将增加，由此不仅使得皮肤的厚度减小、皱纹增加、弹力减小，而且使皮肤气色变暗，皮肤总发生问题(trouble)，并且使痣和雀斑及老年斑也增加，从而引起气色变差、肤色变暗等各种变化。
为了防止这些由于皮肤内在及外在因素而产生的皮肤状态变化，并维持健康的皮肤状态，人们一直努力通过将从现有的各种动物、植物、微生物等中获得的生理活性物质添加到化妆品中并进行使用来改善皮肤状态。
人参皂苷Rf是包含在人参中的皂素的一种，已知显示出抑制脂质过氧化作用和防御由酒精诱导的脑发育障碍的作用等的生理活性、抑制电压依赖性钙通道(Nah，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，8739-8743，1995)及抗痛功效(Shin et al.，submited，1997)。但是对含有人参皂苷Rf作为有效成分的组合物的改善痤疮及皮肤问题的效果、收敛皮肤及收缩毛孔的效果、改善皮肤血色的效果、促进毛发生长、改善白发、抗头皮屑及防腐效果还没有报道。
发明内容
要解决的技术问题
对此，本发明人发现人参皂苷Rf能够提供改善痤疮及皮肤问题的效果、收敛皮肤及收缩毛孔的效果，并且能够提供改善皮肤血色的效果、促进毛发生长、改善白发、抗头皮屑及防腐效果，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供一种皮肤外用剂组合物，所述组合物含有人参皂苷Rf，从而能够提供改善痤疮及皮肤问题的效果、收敛皮肤及收缩毛孔的效果，并且显示出改善皮肤血色的效果、促进毛发生长、改善白发、抗头皮屑及防腐效果。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供一种含有人参皂苷Rf作为有效成分的用于改善痤疮的皮肤外用剂组合物。
此外，本发明提供一种含有人参皂苷Rf作为有效成分的用于改善血色及肤色的皮肤外用剂组合物。
此外，本发明提供一种含有人参皂苷Rf作为有效成分的用于收缩毛孔的皮肤外用剂组合物。
此外，本发明提供一种含有人参皂苷Rf作为有效成分的用于促进毛发生长的皮肤外用剂组合物。
此外，本发明提供一种含有人参皂苷Rf作为有效成分的用于防止白发的皮肤外用剂组合物。
此外，本发明提供一种含有人参皂苷Rf作为有效成分的用于抗头皮屑的皮肤外用剂组合物。
此外，本发明提供一种含有人参皂苷Rf作为有效成分的作为天然防腐剂使用的皮肤外用剂组合物。
有益效果
本发明的组合物含有人参皂苷Rf，从而能够提供抗炎、改善痤疮及皮肤问题的效果、收敛皮肤及收缩毛孔的效果，并且能够提供改善皮肤血色的效果、促进毛发生长、改善白发、抗头皮屑及防腐效果。
最佳实施方式
根据本发明的组合物含有人参皂苷Rf作为有效成分。
本发明中使用的人参皂苷Rf具有下述化学式1的结构：
化学式1
本发明的人参皂苷Rf可以从植物中提取，也可以根据本领域中公知的方法来合成并使用，也可以使用商业性销售的人参皂苷Rf。另外，人参皂苷Rf可以从人参提取物中获得。这时使用的人参的种类不受特别限定，可以使用水参、红参、白参、太极参及尾参等。并且，所述人参提取物不仅包含由人参中浸提、煎提而得到的浸出液，还包含对浸出液的部分或整个再进行浓缩而得到的浓缩物，或者对所述浓缩液再次干燥而制备的浸渍体、煎剂、片剂流动榨取物，以及包含在人参中而发挥主要效果的化学物质，而且还包含植物本身，并且可使用茎、根、叶、花、果实等人参的所有部分中的提取物，并不会限定于某一特定部分的提取物。另外，从人参提取物中提取人参皂苷Rf的方法可以使用公知的方法。
具体地，所述人参皂苷Rf可以通过本领域中已知的方法，使用水或有机溶剂来制备人参提取物后，从中分离而得到。本发明中使用的有机溶剂可以选自乙醇、甲醇、丁醇、醚、乙酸乙酯、氯仿及这些有机溶剂和水的混合溶剂，优选使用80％的乙醇。这时，提取温度优选为10～80℃，并且可以提取3～24小时。如果超出所述提取温度及提取时间的范围，则提取效率会降低，或者会发生成分的变化。
本发明的组合物优选含有以组合物总重量计为0.001至50重量％的所述人参皂苷Rf。这是由于当所述有效成分的含量少于0.001重量％时，存在由所述成分带来的功效及效果微弱的问题；当超过50重量％时，存在皮肤安全性或剂型上的问题。
本发明的组合物可以作为用于改善痤疮的皮肤外用剂组合物来使用，其抗菌效果优异，尤其对痤疮致病菌的抗菌效果优异，并且提供抗炎效果。
本发明的组合物可以作为用于改善血色及肤色的皮肤外用剂组合物来使用，将其使用于皮肤时，通过扩张毛细血管，并促进血液循环来顺利将营养供应到皮肤，并抑制皮肤老化，因此，改善血色及肤色的效果卓越。
本发明的组合物可以作为用于收缩毛孔、调节皮脂及改善皮肤问题的皮肤外用剂组合物来使用，将其使用于皮肤时，抑制过度分泌的皮脂，并通过促进活性氧的消除和胶原蛋白的合成来收缩毛孔，并且由于炎症因子表达的减少，因此，抑制皮肤问题的效果卓越。
本发明的组合物可以作为用于促进毛发生长的组合物来使用，其通过促进休止期毛发周期转化为生长期毛发周期，从而促进毛发的生长，并且不仅促进新毛发的生成，而且还使得现有毛发健康生长，并且提供预防并抑制毛发从头皮脱落的现象、毛发稀疏或变细的状态的效果。
本发明的组合物可以作为用于防止白发的组合物来使用，其通过增加黑素细胞中的转录因子(MITF)的表达来激活黑素细胞，并促进黑色素的合成，从而提供事先预防对白发的诱发且促进诱发黑发的效果。
本发明的组合物可以作为用于防止头皮屑的皮肤外用剂组合物来使用，其通过有效排出积累在毛发和头皮的毒素来净化头皮，并通过抑制头皮屑菌的增殖及生长而能够预防头皮炎症反应，并且，由于抑制活性氧的生成及作用的抗氧化功能卓越，因此，能够提供镇定并强化头皮，且强化固有的防御力的效果。
本发明的组合物可以作为天然防腐剂组合物来使用，由于本发明的组合物是天然成分，因此提供防腐效果卓越且对人体无害的效果。
根据本发明的组合物可以含有化妆品学或皮肤科学上可接受的载体或基材而剂型化。其可以作为适合局部使用的全部剂型来提供，例如，可以提供为溶液、凝胶、固体、糊状无水生成物 在水相中分散油相而获得的乳液、悬浮液、微乳液、微胶囊、微细颗粒球或离子型(脂质体)及非离子型的小囊分散剂的形态，或霜、化妆水、洗剂、粉、软膏、喷雾剂或遮瑕棒的形态。并且，可以以泡沫(foam)形态或进一步包含压缩的推进剂的气雾剂组合物的形态使用。这些组合物可以根据本领域常用的方法制备。
尤其，本发明的皮肤外用剂组合物用于防止头皮屑、用于毛发生长或用于防止白发时，可以作为用于头皮及毛发的组合物而剂型化，剂型不受特别限定，例如可以被剂型化为生发油、毛发营养化妆水、头皮护理剂、头发护理剂、洗发水、护发素、头发洗剂或头皮毛发兼用护理剂等。
并且，根据本发明的组合物可以包括脂肪物质、有机溶剂、溶解剂、浓缩剂、胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂(foaming agent)、芳香剂、表面活性剂、水、离子型或非离子型乳化剂、填充剂、螯合剂、络合剂、保存剂、维生素、阻断剂、湿润剂、精油、染料、颜料、亲水性或亲油性活性剂、脂质小囊或常用于化妆品的任何其它成分等在化妆品学或皮肤科学领域中常用的辅助剂。所述辅助剂以在化妆品学或皮肤科学领域中通常使用的量导入。
并且，本发明的组合物，为了增加皮肤改善效果，可以含有促进皮肤吸收的物质。
具体实施方式
以下，将通过试验例及剂型例更具体地说明本发明的结构及效果。然而，这些试验例及剂型例仅是为了帮助理解本发明而作为例示的目的而提供的，本发明的范畴及范围并不限定于下述例。
[参考例1]人参皂苷Rf的准备
为了对本发明组合物的功效进行实验而使用的人参皂苷Rf购自安博(AMBO)研究所。
[剂型例1及比较剂型例1]
根据下述表1的组成，通过常规的方法来制备营养霜(单位：重量％)。
表1
[试验例1]血色改善效果
为了评价根据本发明的化妆品组合物对促进皮肤血液循环的效果，利用激光多普勒血流成像仪(Laser Doppler Perfusion Imager，LDPI；periscan PIM II，百灵威(Perimed)(斯德哥尔摩，瑞典))测定皮肤中的血液循环程度。已知LDPI是测定皮肤中的血液循环的仪器，并且其为目前广泛使用的仪器，是一种不仅可以测定皮肤毛细血管中的血液的速度及量，而且还可以测出小动脉和小静脉中的流动的非常灵敏的仪器。
在恒温恒湿室中，用香皂洗脸之后，适应30分钟，并利用LDPI测定了初期值。首先，用LDPI对平时手脚冰凉的30名女性的额头下方的初期血流量进行了测定。然后，使试验对象使用1周所述剂型例1及比较剂型例1之后测定血流量，然后将测定的血流量和所述初期测定值进行比较，并将其结果(皮肤血流量变化)示于下述表2中。
表2
从上述表2的结果中可以确认，根据本发明的化妆品组合物与不含有人参皂苷Rf的比较剂型例1相比，使得皮肤血流量显著增加，并通过这种血液循环促进而使血色得到改善。这最终表明根据本发明的含有人参皂苷Rf的化妆品组合物能够对有效传递皮肤营养成分，以及抑制并延缓皮肤老化做出贡献。
[试验例2]肤色改善效果
为了了解所述剂型例1及比较剂型例1的肤色改善效果，使30名测试对象分别使用(晚1次/日，共涂抹1周)之后，利用Facial Stage DM-3(茉莉特(Moritex)，日本)仪器评价肤色改善程度。采用皮肤的明度及色彩变化值，以及皮肤的明度及色彩测定值对肤色改善率进行了判断，并将其结果示于下述表3中。明度及色彩变化值越高表示肤色得到改善。
表3
从表3的结果中可以确认，不含有本发明的人参皂苷Rf的比较剂型例1，未显示出显著的肤色改善功效，相反，含有人参皂苷Rf作为有效成分的剂型例1，与使用前相比，使用后的肤色得到很大改善。
[试验例3]毛孔收缩效果
1.通过促进胶原蛋白合成的收缩毛孔的效果
将本发明的人参皂苷Rf对胶原蛋白的合成促进效果与转化生长因子-β(TGF-β)进行比较并进行了测定。首先，将成纤维细胞(fibroblast)以每孔105个细胞的量接种于24孔(well)中，并进行培养直至长到90％左右为止。将其用无血清细胞培养基(DMEM)培养24小时之后，分别使用10ng/ml的溶于无血清培养基中的本发明的人参皂苷Rf和TGF-β进行处理，并在CO2培养器中培养24小时。取出它们的上清液，并利用原骨胶原型(I)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(原骨胶原型(I)(procollagen type(I)；#MK101，TAK ARA(志贺，日本))，观察原骨胶原(procollagen)的增减与否，并将其结果示于下述表4中。对于胶原蛋白的合成能力，将非处理组设为100而进行了对比。
表4
试验物质 胶原蛋白合成能力(％)
非处理组 100
TGF-β 183.5
人参皂苷Rf 187.6
从上述表4的结果中可以确认，本发明的人参皂苷Rf与阳性对照组TGF-β相比，显示出更高水平的优异的胶原蛋白合成能力。因此，可以确认本发明的人参皂苷Rf通过增加毛孔周边的胶原蛋白生成量来收缩变宽的毛孔。
2.毛孔收缩效果
为了了解剂型例1及比较剂型例1的毛孔收缩效果，进行如下评价。选出20名毛孔大小宽的男女测试对象，按每组10名分成两组，并按照组别在脸上每天涂抹剂型例1及比较剂型例1的营养霜，共涂抹4周。毛孔收缩效果的判定按照以下方式实施。拍摄实验前和4周后的照片，并让专家通过肉眼进行评价。其结果示于下述表5中(评价等级：0-完全没有收缩；5-收缩很多)。
表5
试验物质 评价等级
剂型例1 4
比较剂型例1 0
从上述表5的结果中可知，比较剂型例1没有收缩毛孔的效果，然而剂型例1示出能够用肉眼确认的毛孔收缩效果，从而可知本发明的人参皂苷Rf对收缩毛孔大小的效果优异。
[试验例4]皮脂分泌抑制效果
1.通过抑制5α-还原酶活性的抑制皮肤分泌过多的效果
为了确认对5α-还原酶活性的抑制效果，在HEK293-5αR2细胞中测定了[14C]睾酮转化成[14C]二氢睾酮(DHT：dihydrotestosterone)的比率。在HEK293细胞上转染p3x FLAG-CMV-5αR2之后，并按每孔2.5×105个细胞的量接种于24孔板中，并进行培养(Park et al.，2003，JDS.Vol.31，pp.191-98)。第二天换成添加有酶底物和阻碍剂的新培养基。将0.05μCi[14C]睾酮(试剂盒(Amersham Pharmacia biotech)，英国)用作培养基底物。
为了确认对5α-还原酶活性的抑制程度，加入人参皂苷Rf，并在37℃，5％CO2培养器中培养2小时。此时，将没有加入人参皂苷Rf的用作阴性对照组，将加入非那雄胺(finasteride)的组用作阳性对照组。之后回收培养基，并用800μl乙酸乙酯提取类固醇之后，分离上部的有机溶剂层而晾干之后，用50μl乙酸乙酯再溶解剩余的残留物，并在硅塑料薄膜硅胶60 F254(Silica plastic sheet kieselgel60 F254)上，使用乙酸乙酯-己烷(1:1)作为溶剂来展开。
将塑料样本在空气中干燥之后，为了测定同位素的量而使用了淋浴***将干燥的塑料薄板和x射线薄膜一同加入到浴盒中，1周后测定留在薄膜上的睾酮和二氢睾酮的同位素量，然后根据下述数学式1及2，分别算出转化率及阻碍率，并将其结果示于下述表6中。
数学式1
转化率(％)＝DHT区域中的放射能/总放射能×100
数学式2
阻碍率(％)＝[对照组的转化率-试验物质的转化率]/对照组的转化率×100
表6
试验物质 转化率(％) 阻碍率(％)
阴性对照组 48 -
阳性对照组 27.6 42.5
人参皂苷Rf 15.4 67.9
从上述表6的结果中可以确认，人参皂苷Rf可以有效地抑制5α-还原酶的活性，从而阻断睾酮转化为二氢睾酮，并且显示出与已知的抑制5α-还原酶活性的非那雄胺相比更加优异的抑制效果。所述5α-还原酶使睾酮转化为二氢睾酮，从而与细胞质内的受体蛋白结合而进入核内，从而活性化皮脂腺细胞并促进分化，从而使皮脂腺内的皮脂过度分泌。因此，确认了人参皂苷Rf通过有效抑制5α-还原酶的活性来抑制皮脂的过多分泌。
2.皮脂分泌抑制效果
为了了解所述剂型例1及比较剂型例1的皮脂分泌抑制效果，进行了如下评价。选出30名觉得皮脂分泌多的男女测试对象，每天在脸部皮肤的指定部位涂抹剂型例1及比较剂型例1的营养霜，共涂抹4周。对于皮脂减少效果的判定，通过使用皮脂量测试仪(Sebumeter SM810，C+K电子有限公司(C+K Electronic Co.)，德国)分别测定经过2周及4周后的平均皮脂减少率(％)，并将其结果示于下述表7中。
表7
从上述表7的结果中可知，本发明的含有人参皂苷Rf作为有效成分的剂型例1与不含人参皂苷Rf的比较剂型例1相比，能够有效地抑制过多分泌的皮脂。
[剂型例2及比较剂型例2～3]
根据下述表8中显示的成分及含量(重量％)来制备剂型例2及比较剂型例2～3。具体说明如下。剂型例2为混合人参皂苷Rf的物质，比较剂型例2为完全没有包含改善痤疮皮肤的有效成分的物质，比较剂型例3为作为对于抗菌力的基准的标准物质，该物质含有多用作痤疮治疗剂的红霉素(erythromycin)。
剂型例2及比较剂型例2～3的制备方法如下所述。将下述表8中A项的成分完全溶解，并在其它的溶解槽中，将B项的成分完全溶解，之后将B项添加到A项中，使其混合可溶化。并且在其中，以根据表8中记载的混合比例添加C项的成分，并混合均匀后，进行过滤，从而制备本组合物。
表8
[试验例5]对痤疮菌的抗菌力试验
分别使用根据所述剂型例2及比较剂型例2～3的组成而制备的各化妆品组合物，对作为痤疮致病菌株的痤疮丙酸杆菌(ATCC6919：培养基-脑心浸液肉汤(BHI broth)))进行抗菌力试验。
对痤疮菌的抗菌力试验方法如下所述。
(1)试验菌液的准备
将痤疮丙酸杆菌接种于脑心浸液肉汤培养基中进行厌氧培养而得到的培养液作为试验菌液使用。
(2)稀释溶液的准备
在15ml的脑心浸液肉汤(pH6.8)或LB肉汤培养基(pH4.5)中添加0.15ml的所述试验菌液，并将混合好的混合液作为稀释溶液来使用。
(3)试料的准备
将从剂型例2及比较剂型例2～3中制备的化妆品组合物原液，直接作为试料来使用。
(4)抗菌力试验
1)在96孔的细胞培养板(96 well plate)1号排中加入试料，使得与起始浓度匹配，并加入稀释溶液使总量为200μl。
2)将1号排的混合液混合均匀后，取出100μl的混合液加入到2号排中，并混合均匀后，再次取出100μl的混合液加入到3号排中。通过这种方式进行二倍稀释(doubledilution)。
3)在32℃下静置培养24小时及48小时后，用悬浮程度判断菌的增殖与否，并将没有菌的增殖的最小浓度定为最小抑制浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)值。如果混合液不透明而难以判断菌的增殖与否，则通过显微镜观察来确认。
对痤疮菌的抗菌力试验结果示于下述表9中。对于最小抑制浓度，换算成剂型中含有的有效成分的浓度而标记。
表9
项目 pH 痤疮丙酸杆菌
剂型例2 5.7 >41ppm
比较剂型例2 5.7 最高浓度(没有抗菌力)
比较剂型例3 5.7 >100ppm
从上述表9的结果中可以确认，在最小抑制浓度中，ppm浓度越小，可以认为该物质对痤疮菌的抗菌力有效，使用剂型例2时，与使用作为公知的痤疮治疗剂的红霉素的比较剂型例3相比，显示出的ppm浓度显著低，从而可以确认含有人参皂苷Rf的组合物，对试验菌具有更优异的抗菌力。
[试验例6]对脂质合成(Lipogenesis)的抑制试验
将作为小鼠的成纤维细胞系(fibroblast cell line)的3T3-L1细胞，以1×105细胞/孔贴附于盛有含10％的牛胎儿血清(fetal Bovine Serum，FBS)的DMEM(Dulbecco′smodified eagle′s medium，GI BCO BRL，生活技术公司)培养基的6孔培养板(cultureplate)中。经过2天后，重新更换新的DMEM(含有10％的FBS)培养基，并培养2天。然后，用含有1μg/ml胰岛素(insulin)、0.5mM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)及0.25μm***(dexamethasone)的DMEM(含有10％的FBS)，重新对所述培养的细胞进行分化诱导，并用50μM的人参皂苷Rf及咖啡因处理，然后，经过2天后，重新更换包含胰岛素的DMEM，并培养5天。5天后，重新更换成正常培养基(DMEM，含有10％的FBS)，并对所述细胞进行培养至所述细胞从形态上变化成脂肪细胞。
为了评价人参皂苷Rf对抑制脂肪细胞内脂肪积累的功效，利用所述完成分化的3T3-L1脂肪细胞，实施苏丹三染色(S4136，西格玛奥德里奇)。在常温下，在磷酸盐缓冲液中，用4％多聚甲醛(pH7.2)固定脂肪细胞后，用磷酸盐缓冲液(phosphate bufferedsaline，PBS)进行冲洗，然后，用苏丹三进行染色后拍摄照片，并通过肉眼进行比较。将没有添加试验物质或比较物质而仅添加培养基的组作为对照组来使用，对于其它比较组，用50μM的咖啡因处理。脂肪积累抑制程度是通过将染色的程度分成+++、++、+、-，从而赋予等级，此时，越接近+++，表示染色程度大。其结果示于下述表10中。
表10
试料 阻碍率％
对照组 +++
比较组 +
人参皂苷Rf -
从上述表10中可知，本发明中使用的人参皂苷Rf，不仅脂肪细胞内积累的脂肪量少，而且与作为公知的脂质合成阻碍物质的咖啡因相比，还具有优异的阻碍脂质合成的效果。因此，通过抑制脂质合成来减少皮脂，从而能够抑制痤疮的发生。
[试验例7]改善痤疮和减少皮脂分泌及有无刺激的试验
将30名患有痤疮的人作为试验对象，以每组10名分为三组，并对对应于各组的试验对象使用通过所述剂型例2及比较剂型例2～3来制备的化妆品组合物1个月。对于痤疮改善标准，设成1分至5分，并标记成1分为“没有”，3分为“普通”，5分为“非常好”。将10名的平均分数作为实验结果标记于下述表11中。
对于痤疮消灭时期，以辨认出消灭的天数作为基准，对于痤疮复发，以1个月后复发与否作为基准。对于皮脂分泌的减少，设成1分至5分，并标记成1分为“没有”，3分为“普通”，5分为“非常好”。将10名的平均分数作为实验结果标记于下述表11中。用(显示出刺激反应的人数)/(总试验人数)来判断皮肤刺激的有无。
表11
从上述表11中可知，剂型例2与比较剂型例2相比，痤疮没有复发，并且整体上对痤疮改善具有优异的效果。另外，使用含有抗菌力标准物质的比较剂型例3时，显示出改善痤疮的效果，但是使用时对皮肤的刺激强，因此不适合长期使用，然而，根据本发明的组合物却没有刺激，因此显示出也适合长时间使用。
[剂型例3及比较剂型例4]
用下述表12的组成来制备洗发水。具体地，将表面活性剂和乙二醇二硬脂酸酯添加到精制水中，并加热至80℃，使其均匀溶解后，在搅拌下渐渐冷却至40℃，并且，在所述混合物中投入根据本发明的有效成分和防腐剂、粘度调节剂、香料及毛发调节剂并混合后，在搅拌下冷却至室温，从而制备洗发水。
表12
[试验例8]头皮屑减少效果试验
选定24名头皮屑较多的19至35岁的男性，以每组12名分为两组，并用以下方式分别使用剂型例3及比较剂型例4的洗发水1个月后，测定头皮屑减少率。
试验开始前，通常用常规的洗发水清洗头发，并且采集洗发后累积两天的头皮屑，并将采集的头皮屑的重量与分别用剂型例3及比较剂型例4的洗发水隔两天洗一次头发而试验结束后累积两天的头皮屑的重量进行比较而评价。此时，用真空吸入装置从头皮直接采集累积的头皮屑，并且依据下述方程式3求出头皮屑减少率，并将其结果示于下述表13中。
数学式3
头皮屑减少率(％)＝(试验开始前的头皮屑重量(mg)-一个月后的头皮屑重量(mg))/试验开始前的头皮屑重量(mg)×100
表13
从上述表13中可知，使用含有人参皂苷Rf的剂型例3时，显示出优异的头皮屑防止效果。
[试验例9]防止头皮瘙痒症的效果的试验
选定24名比较严重感觉到头皮瘙痒的25岁至45岁的男女，以每组12名分为两组，并分别以三天一次的频率使用剂型例3及比较剂型例4的洗发水两周后，通过下述评价基准对防止头皮瘙痒的效果进行评价，并将其结果示于下述表14中。
[评价基准]
非常优异-5分
优异-4分
一般-3分
不良-2分
非常不良-1分
表14
分类 剂型例3 比较剂型例4
头皮的瘙痒症的去除效果 4.5 2.3
从上述表14中可知，使用含有人参皂苷Rf的剂型例3时，对防止头皮瘙痒显示出更优异的效果。
[试验例10]增加钾离子通道活性的效果评价
作为脱发治疗剂的米诺地尔已知为潜在的线粒体钾离子通道开放剂(KATPchannel opener)，是在雄激素性脱发的治疗中使用的代表性药物。为了评价这种米诺地尔的机制，使用了下述试验法。所述试验法为使用组成头皮真皮的成纤维细胞中阻止KATP通道的甲苯磺丁脲(SIGMA AIDRICH，T0891)进行处理，从而抑制细胞增殖，并且再次打开钾离子通道而恢复细胞增殖。
为了评价作为本组合物的KATP通道开放剂的功能，本发明使用了作为成纤维细胞系的小鼠胚胎成纤维细胞系(Mouse embryonic fibroblast cell line，NIH3T3)细胞系。本细胞系为用3T3方案，对从NIH瑞士小鼠胚胎(Swiss mouse embryo)中分离的成纤维细胞系进行自然永生化而得到的细胞系。将所述细胞系在含有10％FBS的DMEM(Gibco BRL，盖瑟斯堡，MD，美国)中，在维持5％CO2，37℃的培养箱中培养24小时。将NIH3T3接种于96孔板中，并在37℃的培养箱中培养24小时后，用2.5mM的甲苯磺丁脲进行处理，并且在10分钟后，分别用作为阳性对照组的10μM的米诺地尔和2.5ppm、5ppm及10ppm浓度的人参皂苷Rf进行处理，并且药物处理后经过48小时，然后使用WST-1试剂盒(罗氏(Roche))测定细胞增殖能力。并将其结果示于下述表15中。
表15
分类 细胞增殖能力(％)
无处理对照组(对照) 100
米诺地尔 132
人参皂苷Rf(2.5ppm) 115
人参皂苷Rf(5ppm) 121
人参皂苷Rf(10ppm) 132
从上述表15中可知，用人参皂苷Rf处理时，成纤维细胞的增殖得到恢复，并且细胞增殖能力依赖于处理的人参皂苷Rf的浓度而增加，并且可以确认用10ppm的人参皂苷Rf处理时，细胞增殖恢复到用米诺地尔处理时的水平。
[试验例11]人参皂苷Rf的黑色素生成促进效果试验
在RPMI培养基中添加5％的牛胎儿血清、100IU的青霉素G及0.2μM的对苯二甲酸(TPA)的培养基中，将黑色素细胞以50,000细胞/孔接种于24孔板中。第二天，对接种的细胞，用10ppm或50ppm的最终浓度的作为试验物质的人参皂苷Rf进行处理。将用0.1％的DMSO处理的组作为组作为阴性对照组，将用100μM的IBMX处理的组作为阳性对照组，将上述各组在37℃温度下培养三天。培养后，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗孔板，并在每孔中加入100μl的1N NaOH后，溶解细胞中的黑色素。利用平板培养测定仪(microplate reader)，在405nm下测定被溶解的黑色素的吸光度(协同效应2，酶标仪(VT，美国))。将促进人参皂苷Rf的黑色素的生成的效果与对照组进行比较的结果示于下述表16中。
表16
试料 黑色素合成量(％)
DMSO(0.1％) 100
IBMX(100μM) 120
人参皂苷Rf(10ppm) 112
人参皂苷Rf(50ppm) 123
从上述表16中可知，人参皂苷Rf促进黑素细胞的黑色素合成，从而增加黑色素的生成，因此能够显示出优异的促进黑色素生成的效果。
[试验例12]人参皂苷Rf在黑素细胞中促进转录因子(MITF)及酪氨酸酶表达的效果
利用501mel细胞系，以500,000细胞/孔接种于6孔板中，并且在各孔中，用0.1％的二甲基亚砜(DMSO)处理的作为阳性对照组，用100μM的IBMX处理的作为阳性对照组，以及用10ppm人生皂苷Rf处理的作为实验组，并在37℃温度下培养24小时、48小时及72小时后，得到蛋白质。对于如此获得的蛋白质，利用MITF及酪氨酸酶抗体进行蛋白印迹(WesternBlot)法试验。蛋白质提取和蛋白印迹是通过本领域技术人员通常使用的标准方法来实施。实施蛋白印迹后，将其结果中的阴性对照组设为100，并与该值进行比较而示于下述表17中。
表17
从上述表17中可以确认，人参皂苷Rf在黑素细胞中提高MITF和酪氨酸酶蛋白质的表达。
[试验例13]人参皂苷Rf的抗菌力评价
为了评价人参皂苷Rf的抗菌力，实施抗菌实验。具体的试验方法如下。
实验中使用的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是在胰蛋白酶大豆肉汤培养基(Tryptic Soy Broth)中培养；白色念珠菌(Candida albicans)及黑曲霉(Aspergillus niger)是在沙氏葡萄糖肉汤培养基(Sabouraud Dextrose Broth)中培养。将培养液在各培养基中以1/100(白色念珠菌菌株是以1/10)进行稀释的稀释液作为试验菌液来使用。对于黑曲霉，将制备成2×108cfu/ml的孢子悬浮液作为试验菌液使用。
在15ml的各培养基中添加0.15ml的试验菌液而混合好的混合液作为稀释溶液来使用。
在96孔板1号排中，以每孔16μl的量分别加入10ppm人参皂苷Rf，并且以每孔184μl量加入稀释溶液。在其它的孔中以每孔100μl的量加入稀释溶液。将1号排的混合液混合均匀后，取出100μl的混合液加入到2号排中，并混合均匀后，再次取出100μl的混合液加入到3号排中。通过这种方式进行了二倍稀释。
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及铜绿假单胞菌是在32℃的恒温槽中培养；白色念珠菌及黑曲霉是在25℃的恒温槽中培养。
48小时后，通过悬浮率和显微镜来确认菌的增值与否，从而决定最小抑制浓度(MIC)值，并将其结果示于下述表18中。
表18
如上述表18中所示，可以确认人参皂苷Rf对多种菌株显示出抗菌力，并且通过这些可以预测人参皂苷Rf能够在组合物内作为天然防腐剂或抗菌剂而起作用。

Claims (1)

1.人参皂苷Rf作为唯一有效成分在制备用于改善痤疮的化妆品组合物中的用途。
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