CN105241972A - 层叠的转基因蛋白质的多重分析 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及层叠的转基因蛋白质的多重分析。具体地，本发明涉及供使用质谱法多重分析来自植物的复杂蛋白质样品的方法。在一些实施方案中，本公开涉及供维持转基因植物品种的方法，例如通过就多重的转基因蛋白质的存在和浓度来分析转基因植物品种的世代。

Description

层叠的转基因蛋白质的多重分析
本申请是2010年6月3日提交的申请号2010800224557.9(PCT申请号PCT/US2010/037192)、发明名称为“层叠的转基因蛋白质的多重分析”的发明专利申请的分案申请。
本申请要求于2009年6月3日在美国专利商标局提交的临时申请系列号61/183,777的优先权，将其通过提述并入本文。
技术领域
本发明一般性涉及植物性状的高通量分析。在某些实施方案中，本发明涉及高通量分析的方法和通过用单次注入来源于植物和植物组织的复杂蛋白样品的质谱法确定植物蛋白的量。某些实施方案进一步涉及分析转基因植物的基因型以及在那些具有所需植物性状的植物中维持表达的方法。
背景技术
正在增加的使用重组DNA技术以产生供商业和产业用途的转基因植物需要开发高通量的分析转基因植物品系的方法。需要此类方法在后续世代中维持转基因植物品种，防止转基因逃逸至环境中，和协助快速开发具有所需或优化表型的转基因植物。而且，目前对于提出供人类消费的GM植物的安全性评估的指南需要在亲本和转化的作物之间在DNA和蛋白质水平的表征。Sesikeran和Vasanthi(2008)AsiaPac.J.Clin.Nutr.17Suppl.1:241-44。开发的新植物品种包含越来越复杂的遗传修饰，包括但不限于层叠的(stacked)基因和性状。
本领域优选的供分析转基因植物的现行方法为：基于DNA的技术(例如PCR)；RT-PCR；报道基因的使用；Southern印迹法；和免疫化学。所有这些方法遭受多种不利之处，需要可广泛地从来自转基因植物的有限样品以高通量方式快速和廉价地鉴定并量化多重转基因基因产物的优秀方法。
供转基因植物分析的基于DNA的技术遭受几种明显的缺陷。尽管土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化是最优选的遗传植物转化方法的事实，土壤杆菌转化的植物的基因型难以通过基于PCR的方法分析。参见Nain等(2005)PlantMol.Biol.Rep.23:59-65。转化组织中甚至痕量的土壤杆菌的存在导致误导性PCR结果。见上文。DNA扩增形式还需要基因特异性引物和热循环仪条件的经验性测试。最重要的是，供筛选转基因植物的基于DNA的方法实际上没有确定基因产物蛋白的表达。类似地，RT-PCR或Northern印迹分析可用于确证转基因转录物在转基因植物材料中的存在。Alwine等(1977)Proc.Nat.Acad.Sci.74:5350-54；Toplak等(2004)PlantMol.Biol.Rep.22:237-50。这些方法均无法确证来源植物材料中存在实际的蛋白表达。这些技术还需要使用放射性材料和/或大量组织和处理时间。
报道基因，如编码荧光蛋白的基因，亦可共转化入转基因植物以提供鉴定转化体的工具。然而，报道基因仅为遗传重组的间接报道者。报道基因构建体的表达没有确证相伴的转基因的表达。此外，报道基因或转基因之任一可在宿主植物的后续世代中丧失，由此使得报道子的存在和目标转基因的偶联解除。类似地，转基因可从宿主植物逃逸至邻近植物，例如通过异花授粉，而报道基因并不随之逃逸。当多重基因层叠于转基因植物中时，必须导入相同数量的报道基因以分析转基因蛋白质组，且因为报道基因功能仅为转基因功能的间接报道子，无法检测出一种转基因的表达响应于其他转基因的存在的改变。
与上文概述的方法不同，免疫化学可用于在转基因植物中鉴定转基因表达的产物。尽管免疫化学可用于该目的，该方法需要高度纯化的蛋白质样品以供抗体产生。必须就特异性测试所得的抗体，且必须开发试剂特异性测定条件。进行免疫化学所需的表达和纯化的高水平，以及相关的从植物组织去除污染物的问题，限制该方法的有用性(utility)。
质谱法亦可用于分析转基因植物的蛋白质组。然而，本领域通行的质谱技术需要植物蛋白的复杂混合物首先通过二维凝胶电泳分离。Rajagopal和Ahern(2001)Science294(5551):2571-73；亦参见Domon和Aebersold(2006)Science312(5771):212-17,214。然后可用蛋白酶消化来自凝胶分离的蛋白样品的单个条带并对其进行质谱法以鉴定最初存在于未消化条带中的独特蛋白。参见例如Chang等(2000)PlantPhysiol.122(2):295-317。该方法中的凝胶分离步骤是耗费时间的工艺，其妨碍质谱法在高通量应用中的使用。
本领域需要供检测和量化植物中转基因表达产物存在的高通量方法，所述方法无需纯化的或高度表达的蛋白质，或方法特异性的试剂。该方法对于帮助转基因植物的培养者(cultivator)和栽培者(grower)在有性和/或无性繁殖的后续世代中维持目标转基因植物品种的基因型会是有用的。该方法对于迅速分析转化方法所得的植物以鉴定为转基因植物并在所需组织中表达导入蛋白的那些所得的植物亦会是有用的。此外，本方法可用于迅速筛选有受来自转基因植物的转基因污染的风险的植物，从而实现转基因植物的生物限制(bioconfinement)。
发明内容
本发明的一个具体实施方案包括在基于植物的样品中检测并量化两种或更多种具有已知氨基酸序列的目标蛋白的存在的高通量方法。该方法包括包含蛋白质的复杂的基于植物的样品的第一注入，并将该复杂的基于植物的样品蛋白质消化为肽。或者，该方法包括预备步骤，其中将所述复杂的基于植物的样品蛋白质消化为肽，接着提供该肽的第一注入。然后将肽分离并电离。对于所述肽获得了同时质谱数据(simultaneousmassspectraldata)，并确定所述两种或更多种目标蛋白的存在与否。
本发明的另一个实施方案包括在基于植物的样品中检测两种或更多种具有已知氨基酸序列的目标蛋白质的存在的高通量方法。该方法包括对于两种或更多种目标蛋白提供质谱数据，并提供包含蛋白质的复杂的基于植物的样品的第一注入。将该复杂的基于植物的样品蛋白质消化为肽，然后将所述肽分离并电离。对于所述肽获得同时质谱数据。将该同时质谱数据与对于所述两种或更多种目标蛋白给出的质谱数据相比较，由此确定所述两种或更多种目标蛋白的存在与否。
本发明的另一种实施方案包括维持转基因植物品种的基因型的方法。该方法包括：(i)对于所述转基因植物品种中转基因表达的一种或多种预期产物提供质谱数据；(ii)提供复杂样品的第一注入，所述样品包含来自所述转基因植物品种的第一世代的蛋白质；(iii)将所述复杂的基于植物的样品蛋白质消化为肽；(iv)分离所述肽；(v)电离所述肽；(vi)对于所述肽获得同时质谱数据，并将该同时质谱数据与对于转基因表达的所述预期产物给出的质谱数据相比较，由此确定转基因表达的所述预期产物在所述转基因植物品种的第一世代中存在与否；(vii)提供复杂样品的第一注入，所述样品包含来自所述转基因植物品种的第二世代的蛋白质；(viii)用包含来自所述转基因植物品种的第二世代的蛋白质的复杂样品重复步骤(iii)-(vi)；和(ix)若在对于来自所述转基因植物品种的第二世代的复杂蛋白质样品所得的肽的质谱数据中无法确证转基因表达的预期产物的存在，则无法繁殖所述转基因植物品种的第二世代，由此维持所述转基因植物品种的基因型。
具体而言，本公开提供下列各项：
1.一种在基于植物的样品中检测两种或更多种具有已知氨基酸序列的目标蛋白质的存在的高通量方法，该方法包括：
(i)提供通过消化基于植物的样品蛋白质获得的肽；
(ii)分离所述肽；
(iii)电离所述肽；和
(iv)对于所述肽获得同时质谱数据，并确定所述两种或更多种目标蛋白质存在与否。
2.项1的方法，其中步骤(ii)中分离的肽是通过柱层析分离的。
3.项1的方法，其中所述柱层析为液相柱层析。
4.项1的方法，其中步骤(i)中消化的蛋白质是在注入之前的单一步骤中消化的。
5.项1的方法，其中步骤(ii)中分离的肽是在单一步骤中分离的。
6.项1的方法，其中步骤(iii)中电离的肽是在单一步骤中电离的。
7.项1的方法，其中对于对应于两种或更多种目标蛋白质的肽的同时质荷比数据是在单一步骤中获得的。
8.项1的方法，其中所述两种或更多种目标蛋白质是两种目标蛋白质。
9.项1的方法，其中所述两种或更多种目标蛋白质是四种目标蛋白质。
10.项1的方法，其中所述基于植物的样品来自转基因植物。
11.项1的方法，其中基于植物的样品来自转基因植物，且所述两种或更多种目标蛋白质为该转基因植物中转基因表达的预期产物。
12.一种在基于植物的样品中检测两种或更多种具有已知氨基酸序列的目标蛋白质的存在的高通量方法，该方法包括：
(i)对于两种或更多种目标蛋白质提供质谱数据；
(ii)提供包含蛋白质的复杂的基于植物的样品的第一注入；
(iii)将所述复杂的基于植物的样品蛋白质消化为肽；
(iv)分离所述肽；
(v)电离所述肽；
(vi)对于所述肽获得同时质谱数据，和
(vii)将该同时质谱数据与对于所述两种或更多种目标蛋白质提供的质谱数据相比较，由此确定所述两种或更多种目标蛋白质的存在与否。
13.项12的方法，其中步骤(iii)中消化的蛋白质是在单一步骤中消化的。
14.项12的方法，其中步骤(iv)中分离的肽是在单一步骤中分离的。
15.项12的方法，其中步骤(v)中电离的肽是在单一步骤中电离的。
16.项12的方法，其中所述基于植物的样品来自转基因植物。
17.一种维持转基因植物品种的基因型的方法，该方法包括：
(i)对于转基因植物品种中转基因表达的一种或多种预期产物提供质谱数据；
(ii)提供复杂样品的第一注入，所述样品包含来自所述转基因植物品种的第一世代的蛋白质；
(iii)将所述复杂的基于植物的样品蛋白质消化为肽；
(iv)分离所述肽；
(v)电离所述肽；
(vi)对于所述肽获得同时质谱数据，并将该同时质谱数据与对于转基因表达的所述预期产物提供的质谱数据相比较，由此确定转基因表达的所述预期产物在所述转基因植物品种的第一世代中存在与否；
(vii)提供复杂样品的第一注入，所述样品包含来自所述转基因植物品种的第二世代的蛋白质；
(viii)用包含来自所述转基因植物品种的第二世代的蛋白质的复杂样品重复步骤(iii)-(vi)；和
(ix)若在对于来自所述转基因植物品种的第二世代的复杂蛋白质样品所得的肽的质谱数据中无法确证转基因表达的预期产物的存在，则无法繁殖所述转基因植物品种的第二世代，由此维持所述转基因植物品种的基因型。
18.项17的方法，其中步骤(iii)中消化的蛋白质是在单一步骤中消化的。
19.项17的方法，其中步骤(iv)中分离的肽是在单一步骤中分离的。
20.项17的方法，其中步骤(v)中电离的肽是在单一步骤中电离的。
附图说明
图1显示AAD-1的LC\MS\MS多重检测。具体显示了AAD-1蛋白的多重肽/碎片离子的检测。
图2显示AAD-12的LC\MS\MS多重检测。具体显示了AAD-12蛋白的多重肽/碎片离子的检测。
图3显示Cry1F的LC\MS\MS多重检测。具体显示了Cry1F蛋白的多重肽/碎片离子的检测。
图4显示Cry34的LC\MS\MS多重检测。具体显示了Cry34蛋白的多重肽/碎片离子的检测。
图5显示Cry35的LC\MS\MS多重检测。具体显示了Cry35蛋白的多重肽/碎片离子的检测。
图6显示PAT的LC\MS\MS多重检测。具体显示了PAT蛋白的多重肽/碎片离子的检测。
图7显示在近交玉米组织中表达的Cry1F的LC\MS\MS多重检测。具体显示了在近交5XH751XT中Cry1F的检测。
图8显示在近交玉米组织中表达的Cry34的LC\MS\MS多重检测。具体显示了在近交5XH751XT中Cry34的检测。
图9显示在近交玉米组织中表达的Cry35的LC\MS\MS多重检测。具体显示了在近交5XH751XT中Cry35的检测。
图10显示在近交玉米组织中表达的PAT的LC\MS\MS多重检测。具体显示了在近交5XH751XT中PAT的检测。
具体实施方式
在质谱方法中对于从复杂样品鉴定单个蛋白质所允许的特异性的独特之处在于仅需要目标蛋白的序列以鉴定目标蛋白。与其他形式的多重方法(multiplexing)相比，质谱法的独特之处在于能够利用蛋白质初级氨基酸序列的全长以靶向蛋白质初级氨基酸序列独特的标识类型部分以实际上消除非特异性检测。在本发明的一些实施方案中，使用独特地鉴定目标蛋白的蛋白水解片段或蛋白水解片段组以在复杂蛋白质样品中检测目标蛋白。
泛言之，本发明的具体方法允许直接监视并从目标组织量化任何蛋白质，仅需要事先知晓所述蛋白质氨基酸序列。该方法可以以高通量方式实施而无需开发/测试方法特异性检测试剂。拥有纯化的蛋白质作为供方法开发的试剂总是有益的，但对于该分析仅能纯化至例如60％的蛋白质对于方法开发仍为充分的。本公开的方法可使本领域技术人员消除开发用来制备高度纯化的蛋白样品以用于抗体产生的常常具挑战性的方法的需要。因此，本公开的方法可节约时间和资源。而且，该方法提供了更多种类的适用于多重分析的蛋白质试剂，因为可能无需移除例如最后30-40％污染物的努力。公开的方法亦代表了相对于基于DNA扩增的多重方法的亟需改善，所述方法需要经验性测试基因特异性引物和热循环仪条件，并且由于DNA检测所需的指数扩增而导致了其中欠缺任何靶特异性可显著地降低方法的准确性的情况。
在具体实施方案中，本发明的方法使得蛋白质反向工程能够确定为何具体蛋白质具有其独特性质而无需实际蛋白质以起始研究。举例而言，可从来自表达需要或不需要的性状的植物的复杂蛋白质样品所得的质谱数据鉴定与需要或不需要的植物性状相关的靶蛋白序列修饰和/或翻译后修饰。
在一些实施方案中，公开的方法使得能够通过单次质谱分析在复杂蛋白质样品中量化或确定多种蛋白质的比例，而非多次单独测量每种目标蛋白，并将单独的结果汇编至一个样品结果。
还在其他实施方案中，本公开亦提供了可用于转基因植物技术的开发和使用的方法。具体而言，公开的方法可用于在后续世代中维持转基因植物的基因型。同样，本文中公开的方法的一些实施方案可用于提供有从邻近植物例如通过交叉授粉而受转基因污染风险的非转基因植物的高通量分析。通过这些实施方案，可促进和/或实现转基因的生物限制。在其他实施方案中，本文中公开的方法可用于以高通量方式筛选植物转化方法的结果以鉴定显示所需表达特征的转化体。
I.缩写
对本发明参照下述缩写加以描述：
AAD-1(R)-2,4-二氯苯氧基丙酸双加氧酶(dichlorophenoxypropionatedioxygenase)
AAD-12(S)-2,4-二氯苯氧基丙酸/α-酮戊二酸双加氧酶(dichlorophenoxypropionate/alpha-ketoglutaratedioxygenase)
CID碰撞诱导的解离(Collision-induceddissociation)
Cry1F杀虫晶体蛋白(Pesticidalcrystalprotein)cry1Fa(杀昆虫的delta-内毒素(Insecticidaldelta-endotoxin)Cry1F(a))
Cry34晶体蛋白(crystalprotein)ET79(苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis))
Cry35Cry35Ab类似物(Cry35Ab-like)(苏云金芽孢杆菌)
CE毛细管电泳
DNA脱氧核糖核酸
ELISA酶联免疫吸附分析
EPI增强的产物离子(enhancedproduction)
GM经遗传修饰的
IDA基于信息的采集(information-dependentacquisition)
LC\MS\MS液相层析-串联质谱法(liquidchromatography-tandemmassspectrometry)
MRM多反应监视(multiplereactionmonitoring)
MS质谱法
MSMS串联质谱法
PAT草胺膦N-乙酰转移酶(PhosphinothricinN-acetyltransferase)(PPTN-乙酰转移酶)
PCR聚合酶链式反应
RT-PCR逆转录聚合酶链式反应
II.术语
为了便于审视本公开的多种实施方案，下述给出了具体术语的解释：
生物限制(Bioconfinement)：如用于本文，术语“生物限制”指将经遗传修饰的植物或其遗传材料的移动限制于指定区域。该术语包括防止经遗传修饰的植物在自然环境或人工生长条件中存活、散布或复制的物理、物理化学、生物学限制，以及任何其他形式的限制。
复杂蛋白质样品：如用于本文，术语“复杂蛋白质样品”是用于将样品区别于纯化的蛋白质样品。复杂蛋白质样品包含多种蛋白质，且还可包含其他污染物。
质谱法：如用于本文，通用术语“质谱法”指任何合适的质谱方法、装置或结构(configuration)，包括例如电喷射电离(ESI)、基质辅助激光解吸/电离(MALDI)MS，MALDI-飞行时间(TOF)MS，大气压(AP)MALDIMS，真空MALDIMS，串联MS，或其任意组合。质谱装置通过测量分子通过一组磁场和电场的飞行路径来测量分子的分子量(作为该分子的质荷比的函数)。质荷比是广泛用于带电粒子的电动力学的物理量。特定肽的质荷比可由本领域技术人员先验地计算。当施以相同的电场和磁场时，具有不同质荷比的两个粒子在真空中不会以相同路径移动。本发明包括使用高效液相层析(HPLC)继以对肽的串联MS分析，但不限于此。
质谱仪器由三个模块组成：离子源，其将样品分子裂解为离子；质量分析器，其通过施加电磁场根据离子质量将它们归类；和检测器，其测量指示量(indicatorquantity)的值，并从而对于计算每种存在的离子的丰度提供数据。该技术同时为定性和定量用法。这包括鉴定未知化合物，确定分子中元素的同位素组成，通过观察其碎片来确定化合物结构，和对样品中化合物的量定量。
质谱方法学和装置的详细综述可见于下述文献：Carr和Annan(1997)Overviewofpeptideandproteinanalysisbymassspectrometry.In:Current ProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等编辑NewYork:Wiley,p.10.21.1-10.21.27；Paterson和Aebersold(1995)Electrophoresis16:1791-1814；Patterson(1998)Proteinidentificationandcharacterizationbymassspectrometry.In:CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等编辑NewYork:Wiley,p.10.22.1-10.22.24；以及Domon和Aebersold(2006)Science312(5771):212-17，其通过提述并入本文。
多重：如该术语用于本文，当两种或更多种目标蛋白质和/或肽存在于相同样品中时，则所述蛋白质和/或肽是“多重的”。
植物性状：如用于本文，“植物性状”可指植物的任何单个特征或可量化的量度。
肽：肽为由α氨基酸以限定顺序连接而形成的短聚合物。肽亦可通过用蛋白酶消化多肽例如蛋白质来生成。
蛋白质：蛋白质为由氨基酸以直链排列并通过邻接氨基酸残基的羧基和氨基基团之间的肽键结合在一起而构成的有机化合物。蛋白质中氨基酸序列是由基因序列定义的，而基因是在遗传密码中编码的。一般而言，遗传密码限定20个标准氨基酸，然而在某些生物中，遗传密码可包括硒代半胱氨酸(selenocysteine)，(和在某些古菌中)吡咯赖氨酸(pyrrolysine)。常常观察到蛋白质中的残基经翻译后修饰而化学修饰，所述修饰可发生于在细胞中使用所述蛋白质之前，或作为调控机制的一部分。蛋白质残基亦可根据本领域技术人员熟悉的技术而经设计修饰。如用于本文，术语“蛋白质”涵盖包含天然存在的氨基酸、合成氨基酸、修饰氨基酸或上述任何或全部的组合的直链。
单次注入：如用于本文，术语“单次注入”指MS或LC-MS装置操作中的起始步骤。当将蛋白质样品以单次注入导入该装置时，全部样品在单一步骤中导入。
层叠的(Stacked/stacking)：如用于本文，术语“层叠的”指存在多个异源多核苷酸组入植物基因组。
串联质谱法：在串联质谱法中，可将从目标分子生成的母离子在MS仪器中过滤，并接着使该母离子碎片化以得到一种或多种子离子，然后在第二MS步骤中分析(检测和/或定量)所述子离子。
转基因植物：如用于本文，术语“转基因植物”包括指代在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。一般而言，所述异源多核苷酸稳定地整合在基因组内从而使得该多核苷酸传递至后续世代。异源多核苷酸可单独或作为重组表达盒的一部分整合入所述基因组。“转基因”用于本文中包括任何其基因型受异源核酸的存在而改变的细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些开始即如此改变的转基因植物以及那些从起始转基因植物通过有性杂交或无性繁殖构建的转基因植物。
III.选择供多重分析的转基因蛋白质
可使用本发明的方法分析任何通过转基因表达技术导入植物的蛋白质。根据本发明适用于多重分析的蛋白质可赋予输出性状，该性状使得所述转基因植物比其非转基因同类(counterpart)优越。可赋予的所需性状的非限定性实例包括除草剂抗性，对环境应激的抗性，增加的产量，改善的营养价值，改善的贮藏期限，改变的油含量，改变的油组成，改变的糖含量，改变的淀粉含量，基于植物的药物的产生，工业产品(例如聚羟基链烷酸酯类(polyhydroxyalkanoates)：被视为石油衍生的塑料的理想替代品的高分子聚酯)的产生和供生物治理(bioremediation)的潜能。而且，可使用本公开的方法分析在单个植物物种内一种或多种转基因蛋白质的表达。将两种或更多种基因或所需性状添加或调节于单个目标物种称作基因层叠。此外，可在用一种或多种内源植物蛋白质的本文公开的多重分析中同时分析一种或多种转基因蛋白质的表达。
对于具体待分析的蛋白质的偏好属于本领域技术人员的选择。此类蛋白质可为，但不限于，那些来自植物、动物、酵母等的蛋白质，且可为未见于非转化细胞中或见于转化细胞中两者择一的蛋白质。在转基因植物中表达的特别适合的蛋白质为那些赋予对除草剂、昆虫或病毒的耐受性，和提供改善的营养价值、增加的产量、干旱耐受性、氮利用、有用的工业化合物的产生、植物的加工特征或供生物治理的潜能的基因。有用的蛋白质的实例包括供赋予昆虫抗性的来自苏云金芽孢杆菌的杀昆虫基因，和供赋予对草甘膦(glyphosate)除草剂耐受性的5’-烯醇丙酮酰-3’-磷酸莽草酸合酶(5’-enolpyruvyl-3’-phosphoshikimatesynthase，EPSPS)基因及其任何变体。如本领域技术人员容易理解的，可在植物细胞中使用重组DNA技术表达任何赋予所需性状的蛋白质。
IV.肽片段的选择
可根据本公开通过确定在来自植物蛋白质的复杂混合物的MS谱中靶蛋白的蛋白水解肽片段的存在来鉴定靶蛋白。蛋白酶在可在靶蛋白的全序列内容易地确定的特定氨基酸序列处切割蛋白质。因此，可先验地推出通过用一种或多种蛋白酶消化会产生的肽片段的集合。然后具体推出的肽的独特质荷比可通过其初级氨基酸序列确定。
亦可从消化的靶蛋白的MS谱经验地确定肽片段。本发明的具体实施方案可为选择其序列在预期的蛋白水解切割位点内侧的肽。对于经验性选择供靶蛋白鉴定的肽片段，可对消化的蛋白质样品进行质谱法以确定为多重蛋白质鉴定提供所需的检测敏感度和特异性的肽片段。一般而言，优选最丰富的电离肽。具体电离肽的丰度是肽丰度和该肽电离效率的函数。
在层叠产物中的目标蛋白质会在相对于彼此不同的水平表达。检测的肽会来源于以不同的且之前未知浓度表达的各个蛋白质。肽和蛋白质的检测的范围可为阿托摩尔(attomolar)至微摩尔浓度。待测试的样品的纯度的范围会为纯化的标准蛋白质的缓冲溶液，至从多种目标组织提取的粗植物基质。会在粗植物基质中鉴定肽片段，以及若靶检测需要在检测之前减少样品基质的复杂度，在部分纯化的组织样品基质中鉴定。
V.靶向MRM分析
一旦鉴定了在多重分析中待确定的一种或多种靶蛋白的肽片段，则对所述靶蛋白开发靶向MRM分析。优选地，对于给定靶蛋白的靶向MRM分析会鉴定那些之前选择的为最丰富的片段离子的肽。因此，对在多重分析中待确定的每种靶肽会进行特定的MRM分析，开发该分析是为了鉴定该靶肽的独特片段离子。所述多重分析是通过同时MRM分析进行的，所述同时MRM分析包括对于植物组织样品中的两种或更多种靶蛋白具特异性的独特的标识类型的肽片段。优选地，所述多重分析会同时鉴定那些当在复杂基质存在或不存在下分析时表现出有效电离和碎片化(fragmentation)的靶蛋白特异性肽。包括在所述多重分析中的靶蛋白可用一种或多种特异性母/子离子转换对(transitionpair)鉴定。
然后对于复杂蛋白质混合物中的多个靶蛋白进行了单次MS/MS多重分析。由于质谱法的敏感度和选择性，待进行MS/MS多重分析的复杂蛋白质样品无需与待通过常规技术如免疫化学或PCR分析的样品一样纯或丰富。然而，待进行MS/MS多重分析的复杂蛋白质样品可根据对于多重方法的鲁棒性(robust)分析性能优化的提取条件来制备。蛋白质样品可根据如盐提取(例如碳酸氢铵)，在尿素存在下的盐提取和去污剂提取(例如CHAPS)或其他富集类型的方法，但不限于此的技术来制备。
多重蛋白质样品可制备自的植物材料可由本领域技术人员选择。合适的材料可包括例如来自转基因植物的组织或细胞，来自遗传转化方法所得的细胞或植物组织，来自待就污染转基因的存在进行分析的非转基因植物的组织或细胞，或可疑来源的转基因植物的植物来源材料。
对复杂蛋白质样品进行MS多重分析。将所述复杂蛋白质样品注入MS的电离室，其中产生第一(母)离子。所述母离子可在第一MS中直接检测，或其可通过第一MS分离，碎片化为特征性子离子，并在第二MS(MS/MS)中检测一个或多个所述子离子。
可使用几种检测模式检测离子。举例而言，可使用选择性离子监视模式(SIM)检测选定的离子，所述模式包括多重反应监视(MRM)或选定反应监视(SRM)。或者，可使用扫描模式检测离子。
可使用四极分析仪确定质荷比。举例而言，在“四极”或“四极离子阱”装置中，在振荡射频场中的离子受与电极之间施加的DC电势、RF信号的振幅和m/z成比例的力。可选择电压和振幅使得仅具有特定m/z的离子通过四极的长度，而使所有其他离子偏斜。因此，四极装置对于注入装置的离子可作为“质量滤器”和“质量检测器”而起作用。
常常使用碰撞诱导的解离(“CID”)来生成子离子以供进一步检测。在CID中，母离子通过与惰性气体如氩的碰撞来获取能量，并随后通过称作“单分子分解(unimoleculardecomposition)”的过程而碎片化。必须在母离子中蓄积充足的能量从而使得离子内的某些键可由于增加的振荡能量而断裂。
在MS/MS中，在第一MS分析中选择母离子。然后将那些选定的母离子传至碰撞小室(collisioncell)以生成肽特异性子离子以供鉴定和定量。在给定组的电离/碎片化条件下，母离子和子离子以可重复的方式产生，赋予MS/MS技术极其强力的分析能力。
质谱法通常提供给用户离子扫描；即，在给定范围(例如10至1200amu)中每种m/z的相对丰度。分析物测定的结果，即质谱，可通过多种本领域已知方法与原始样品中的分析物的量相联系。举例而言，只要谨慎地控制取样和分析参数，可将给定离子的相对丰度与将相对丰度转换为原始分子的绝对量的表相比较。或者，可与样品一同运行分子标样(例如内标和外标)，并基于从这些标样生成的离子构建标准曲线。使用此种标准曲线，可将给定离子的相对丰度转换为原始分子的绝对量。多种用于将离子的存在或量与原始分子的存在或量相联系的其他方法对于本领域一般技术人员是公知的。
电离方法的选择可基于待测量的分析物、样品类型、检测器类型、正对负模式的选择等来确定。可使用多种方法来产生离子，所述方法包括但不限于电子电离、化学电离、快原子轰击、场解吸和基质辅助激光解吸电离(MALDI)、表面增强激光解吸电离(surfaceenhancedlaserdesorptionionization，SELDI)、解吸电喷射电离(DESI)、光子电离、电喷射电离和电感耦合等离子体。电喷射电离指下述方法，其中使溶液经过短程长度的毛细管，对毛细管末端施加高的正或负电势。将抵达管末端的溶液蒸汽化(雾化)为溶剂蒸汽中溶液非常小滴的喷射或喷雾。该小滴的雾飞经蒸发室，其经加热以防止凝结并蒸发溶剂。随着小滴变得更小，电表面电荷密度(electricalsurfacechargedensity)增加直至类似电荷之间的天然排斥导致释放离子以及中性分子之时。
LC的流出物可直接并自动地(即“连线(in-line)”)注入电喷射装置。在一些实施方案中，包含在LC流出物中的蛋白质首先通过电喷射电离为母离子。将MSMS的第一个四极调适为针对多重靶蛋白的母离子的质量滤器。
然后将经过第一个四极的母离子在其经过第二个四极之前电离和/或碎片化。在一些实施方案中，在碰撞诱导的解离(CID)过程中将所述离子与惰性气体分子碰撞。合适的惰性气体包括例如氩、氦、氮等。理想地，将多重靶蛋白的母离子碎片化为子离子，然后检测所述子离子。
VI.维持转基因植物品种
本公开的方法可用于维持转基因植物品种的基因型。可对从转基因植物的下一世代制备的复杂蛋白质样品进行MSMS多重分析以确定目标蛋白质的存在与否。所述复杂蛋白质样品可包含在所述转基因植物中表达的转基因蛋白质。通过繁殖那些其中确证了目标转基因蛋白质存在的植物，确保了目标转基因蛋白质在后续世代中的表达。类似地，可能不繁殖那些其中无法确证目标转基因蛋白质的存在的下一世代植物。
VII.筛选植物转化方法的结果
本公开的方法亦可用于以高通量方式迅速地筛选植物转化方法的结果。由于由DNA重组产生的GE植物和植物细胞中基因型和表达特征的差异，由植物转化方法产生的植物和植物细胞并不必然包含导入的转基因蛋白质例如异源蛋白质的相同或类似的表达分布。此外，内源蛋白质可展示不同形式改变的表达分布。在本公开的一些实施方案中，从通过植物转化方法产生的植物、植物组织或植物细胞制备复杂蛋白质样品。然后可对所述制备的复杂蛋白质样品进行多重MS/MS分析。然后分析来自不同样品的MS谱以鉴定那些显示所需表达特征的样品。然后可繁殖鉴定出的样品的来源植物、植物组织或植物细胞以选择所需的表达特征。
VIII.实现转基因的生物限制
转基因可逃离转基因植物并变得例如通过异花授粉而整合入环境中周围的非转基因植物的基因组。在多数情况下，这是不希望的。在一些实施方案中，使用本公开的方法以实现将转基因生物限制于转基因植物。在这些和其他实施方案中，可从有受来自转基因植物的遗传材料污染风险的植物、植物组织或植物细胞制备复杂蛋白质样品。可对制备的复杂蛋白质样品进行多重MS/MS分析。然后分析来自不同样品的MS谱以确定那些含有靶转基因蛋白质，例如，表达于转基因植物中的转基因蛋白质的样品。在样品中靶蛋白的存在与所述转基因逃至来源植物、植物组织或植物细胞相关。通过销毁、限制范围(confine)或者其他方式限制污染的植物、植物组织或植物细胞的生长，可实现生物限制。
除了本文中具体描述的那些具体实施例，实施方案可有多种修饰和替代形式。因此，实施方案并不限于公开的特定形式。相反，本公开的范围涵盖所附权利要求中记载的所有修饰、等同和替代形式。
实施例
实施例I
选择六种不同的转基因蛋白质(Cry1F、Cry34、Cry35、AAD-1、AAD-12和PAT)以供开发LC\MS\MS多重分析。通过质谱法在复杂蛋白质混合物的单次注入中检测并鉴定各蛋白质。
多重分析的第一种型式是通过分别蛋白水解消化所述六种蛋白质，然后将所得的蛋白质肽补强至经蛋白水解消化的植物组织提取物，并使用LC\MS\MS以供在单次注入中检测所述六种蛋白质的每一个的特定前体/碎片离子来进行的。然后将在该第一种多重型式过程中开发的方法学应用于在现行的自交玉米育种材料中表达的四种蛋白质的多重检测。
实施例II
植物中的LC\MS\MS多重检测
表1列出了接收的每种单个储备蛋白质的浓度，和进行胰蛋白酶消化时每种蛋白质所得的稀释。在用蛋白酶胰蛋白酶消化之前，将所有蛋白质缓冲液交换至25mM碳酸氢铵，pH7.9(SIGMA)以确保有效的消化条件。将来自每种储备蛋白质(参见表1)的等分试样转移至无菌的1.5mLeppendorf管，并使用25mM碳酸氢铵，pH7.9补足至100μL。将ZebaDesaltSpinColumn(Pierce#89882)根据制造商的推荐用于每种蛋白质的缓冲液交换。进行Zeba柱的三次旋转洗涤，每次洗涤使用300μL的25mM碳酸氢铵，pH7.9，并在1500g旋转1分钟。然后将每个样品蛋白质的100μL等分试样施于Zeba柱树脂的表面，并在1500g旋转2分钟。然后将经缓冲液交换的材料直接用于胰蛋白酶消化以供生成蛋白质肽片段。六种蛋白质的起始胰蛋白酶消化并不包括烷基化半胱氨酸氨基酸残基的方法步骤。该烷基化步骤可在之后添入，但以高通量分析作为目标，排除烷基化步骤可为最终分析节约显著的时间和努力。添加1μL的0.5MDTT使每个100μL经缓冲液交换的蛋白质样品成为5mMDTT，然后在95℃热变性20分钟，并冷却至室温(25℃)。将测序级的修饰的胰蛋白酶重悬于25mM碳酸氢铵，pH7.9至0.4μg/μL的浓度。将胰蛋白酶添加至每个蛋白质样品至1:20至1:50的最终酶对底物比的范围。使用下述温度分布在热循环仪中进行胰蛋白酶消化：37℃进行16小时，然后冷却至4℃。在胰蛋白酶消化之后，将3μL的10％甲酸添加至每个蛋白质消化物。
表1：对于每个LC\MS\MS多重-6蛋白质胰蛋白酶消化物的蛋白质浓度和稀释
首先，通过ESI-LC\MS\MS分别分析六个经胰蛋白酶消化的蛋白质样品的每一个以确定会提供用于在单次分析中同时多重鉴定所有六种蛋白质的检测敏感度和特异性的胰蛋白酶肽片段。用于方法开发的质谱仪为AppliedBiosystemsMDSSciex4000QTrapHybridTripleQuad,(FosterCity,CAmodel#1004229-V)，其利用配有TSI探针的TurboVESI源套。将样品通过Agilent1100HPLC***导入质谱仪。表2包括对于不同装置组件的具体模型号和固件版本信息。
表2：对于装置组件的模型/固件版本信息
反向层析是使用装配PhenomenexJupiterProteo50X2.0mm4μM柱的Agilent1100HPLC***用下述上样条件进行的：95％A(H2O/0.1％甲酸)/5％B(乙腈/0.1％甲酸)进行1分钟，然后20分钟梯度至90％B。将柱以90％B的2分钟维持来再生，然后以5分钟重新平衡至5％。对于各蛋白质肽的最初筛选，将每种蛋白质大约10-50fmol加载至柱以供分析。
对六种待进行多重分析的蛋白质的每一种进行纳入了两个EPI扫描的IDA采集方法，该扫描是对来自对于每种蛋白质具特异性的MRM列表转换检测出的两种最丰富的离子进行的。该碎片化数据对于从每种检测出的肽选择表现最高丰度的碎片离子提供了信息。一般而言，选择来自检测出的前体肽的三种最多的碎片离子以供进一步方法开发。对于该IDA采集，Sciex4000QTRAP纳入了下述条件：IS电压5500、DP75、EP10、CXP12、CUR10、CADHIGH、TEM450、GS135、GS235、RESQ1单元和RESQ3单元。对于每种肽的CE值是用对每个肽使用的最优值经验地测试的。使用从对于六种蛋白质的每一种进行的单独IDA分析累积的肽碎片化数据，然后对每种单独的蛋白质进行MRM分析以鉴定来自每种蛋白质的具有良好电离效率的前体离子。对于每种多重蛋白质，使用所有胰蛋白酶肽(trypticpeptides)的MRM列表以构建单独的MRM分析方法。使用单个蛋白质MRM分析数据作为电离效率的量度，在多重形式中对于每种蛋白质选择肽作为前体离子。多重肽列于表3。
表3：选用于起始多重-6LC\MS\MS方法的肽
实施例III
然后使用从单个蛋白质分析生成的前体/碎片离子数据构建了对于所有六种DAS蛋白质的单个LC\MS\MS多重靶向MRM分析。这些肽首先通过用来自六种蛋白质的每一种的胰蛋白酶消化材料补强碳酸氢铵缓冲液(25mM，pH7.9)来进行LC\MS\MS多重检测。将大约5-20fmol的每种蛋白质注入柱上以供补强的缓冲液的起始多重-6分析。
图1-6显示了在单次注入中检测出的六种蛋白质的每一种的提取离子层析图。具体而言，图1显示AAD-1的LC\MS\MS多重检测。该数据为对于AAD-1((R)-2,4-二氯苯氧基丙酸双加氧酶)的提取的LC\MS\MS离子层析图，在玉米种子提取物中在含AAD-12、Cry1F、Cry34、Cry35和PAT的单次注入中检测出。
图2显示AAD-12的LC\MS\MS多重检测。该数据为对于AAD-12((S)-2,4-二氯苯氧基丙酸/α-酮戊二酸双加氧酶)的提取的LC\MS\MS离子层析图，在玉米种子提取物中在含AAD-1、Cry1F、Cry34、Cry35和PAT的单次注入中检测出。
图3显示Cry1F的LC\MS\MS多重检测。该数据为对于Cry1F(杀虫晶体蛋白cry1Fa(杀昆虫delta-内毒素Cry1F(a)))的提取的LC\MS\MS离子层析图，在玉米种子提取物中在含AAD-1、AAD-12、Cry34、Cry35和PAT的单次注入中检测出。
图4显示Cry34的LC\MS\MS多重检测。该数据为对于Cry34(晶体蛋白ET79[苏云金芽孢杆菌])的提取的LC\MS\MS离子层析图，在玉米种子提取物中在含AAD-1、AAD-12、Cry1F、Cry35和PAT的单次注入中检测出。
图5显示Cry35的LC\MS\MS多重检测。该数据为对于Cry35(Cry35Ab类似物[苏云金芽孢杆菌])的提取的LC\MS\MS离子层析图，在玉米种子提取物中在含AAD-1、AAD-12、Cry1F、Cry34和PAT的单次注入中检测出。
图6显示PAT的LC\MS\MS多重检测。该数据为对于Cry35(草胺膦N-乙酰基转移酶(PPTN-乙酰基转移酶))的提取的LC\MS\MS离子层析图，在玉米种子提取物中在含AAD-1、AAD-12、Cry1F、Cry34和Cry35的单次注入中检测出。
在确证了所有六种蛋白质的LC\MS\MS多重检测之后，将碳酸氢铵肽混合物稀释至来自玉米种子组织的蛋白酶消化的提取物以供在种子基质中进行检测。使用的种子组织是来自现行的近交材料。将补强的样品在碳酸氢铵中1:10稀释，然后在玉米种子提取物中1:2稀释，使得大约0.2至1fmol的每种蛋白质注入柱并使用LC\MS\MS多重方法检测。
实施例IV
通过质谱法在来自近交植物材料(5XH751XT)的复杂蛋白质样品的单次注入中检测并鉴定了四种不同的转基因蛋白质(Cry1、Cry34、Cry35和PAT)。在叶和种子组织中均检测出了蛋白质。
使用上文所列的多重-6方法以在来自近交系植物材料(5XH751XT)的复杂蛋白质样品的单次注入中检测四种不同的转基因蛋白质(Cry1、Cry34、Cry35和PAT)的存在。在该尝试中，开发了单次注入多重-4方法以测量四种蛋白质在玉米种子和玉米叶组织中的存在。实验对照涉及与在消化之前掺入完整转基因蛋白质的空白(null)5XH751提取物的比较，以及与消化的空白5XH751提取物的比较。
对于该实验，亦考虑到了多重方法鲁棒性分析性能所需的提取方法。因为多重检测是同时测量来自每种单个样品的多种蛋白质，使用的蛋白质提取方法需要对于所有蛋白质均有效以供准确测量。如图11所示，对于玉米叶和种子组织均测试了提取条件。在开始理解这四种不同的蛋白质会如何表现的尝试中，测试了三种不同的提取条件，以寻找单一的提取方法以满足如蛋白质稳定性、溶解性和疏水性等因素。
简单的碳酸氢铵蛋白质提取的吸引力在于能够直接从提取步骤进行至蛋白酶消化而无需在MS分析过程中考虑由于缓冲液组成所致的信号抑制。这可减少成本，但是更重要的是减少准备时间和在缓冲液交换中可能招致的差异。测试了8M尿素缓冲液以确定是否需要严酷的增溶方法以供检测植物组织中所有四种蛋白质。使用PBS-T是因为其对于ELISA检测方法是常规的。
5XH751XT叶组织：从V6-V7温室植物收集叶组织，并在液氮下磨碎。每个叶样品测试重量为1.5g。每种提取缓冲液(图11)以2:1缓冲液/样品比例(3mL)测试。将样品涡旋振荡2分钟，然后旋转2分钟，并收集上清。
5XH751XT种子组织：获得成熟的种子组织，并将其在球磨机中粉碎。每个种子样品测试重量为1.5g。每种提取缓冲液(图11)以2:1缓冲液/样品比例(3mL)测试。将样品涡旋2分钟，然后旋转2分钟，并收集上清。
将在8M尿素或PBS-T中提取的样品使用PierceZeba旋转滤器缓冲液交换至25mM碳酸氢铵。对于所有样品，将50μL组织提取物用110μL总体积的碳酸氢铵中的10μg胰蛋白酶(去除)进行胰蛋白酶消化。蛋白质消化在37℃进行16小时，然后冷却至4℃。作为对于四种待多重检测的蛋白质的每一个的阳性对照，使用纯化的蛋白质标样制备含大约50μg/mL每种单独完整蛋白质的混合液(cocktailmix)。将混合液的最终1:10稀释掺入空白叶提取物样品和空白种子提取物样品至基质阳性对照浓度为大约5μg/mL。这些补强的空白充当阳性对照，当与空白组织对照(阴性对照)和5XH751XT玉米组织提取物相比时，得到准确的肽LC保留时间和MS/MS序列碎片数据。因为所有四种待在5XH751XT中多重检测的蛋白质为同样用于开发上述多重-6LC/MS/MS方法的蛋白质，无需进一步的开发以确定要检测何种蛋白质特异性肽/碎片离子以及在何种装置条件下进行。
将上述的多重-6方法用于分析5XH751XT叶和种子组织提取物。图7-10为使用多重-4LC-MS/MS单次注入分析以检测在近交玉米叶和种子组织中表达的Cry1F、Cry34、Cry35和PAT蛋白质而采集的部分数据。
具体而言，图7显示表达于近交玉米组织中的Cry1F的LC-MS/MS多重检测。该数据为对于用25mM碳酸氢铵提取的5XH751玉米叶组织中多重鉴定出的Cry1F具特异性的MS/MS谱。检测出了三种Cry1FT22特异性碎片离子，本文中仅显示了一种碎片。还显示了MS/MS转换的阳性和阴性对照。
图8显示了表达于近交玉米组织的Cry34的LC-MS/MS多重检测。该数据为对于用25mM碳酸氢铵提取的5XH751玉米叶组织中多重鉴定出的Cry34具特异性的MS/MS谱。还显示了MS/MS转换的阳性和阴性对照。检测出了五种Cry34T7特异性碎片离子，本文中仅显示一种。5XH751XT样品和Cry34补强的阳性对照之间保留时间的微小变化对于在反相梯度的早期、更加亲水性区域洗脱的蛋白质而言并非意料之外。在空白叶对照小图中显示的峰如由来自柱的保留时间的巨大(～7分钟)移动所确定，为非特异性峰。其他四种Cry34碎片离子均无非特异性峰。
图9显示了表达于近交玉米组织中的Cry35的LC-MS/MS多重检测。该数据为对于在玉米叶组织中多重鉴定出的Cry35具特异性的MS/MS谱。还显示了MS/MS转换的阳性和阴性对照。显示的数据来自用25mM碳酸氢铵提取的5XH751叶组织。检测出了三种Cry35T9特异性碎片离子，本文中仅显示一种。
图10显示了表达于近交玉米组织的PAT的LC-MS/MS多重检测。该数据为对于在玉米叶组织中多重鉴定出的PAT具特异性的MS/MS谱。还显示了MS/MS转换的阳性和阴性对照。
对于每种蛋白质，检测并碎片化特异性前体肽，其中检测三至五种相应的碎片离子以确保蛋白质序列确证。图7、8、9和10分别显示了对玉米组织中多重鉴定的四种蛋白质中的一种具特异性的MS/MS谱。每个图还显示了对于具体MS/MS转换的适当阳性和阴性对照。四种蛋白质中的两种在种子组织中检测出。无法检测出四种蛋白质中的两种可能是由于低表达，因为历史数据表明这四种蛋白质在种子中与叶组织相比表达较低。
实施例V
通过在转基因植物品种的下一世代中确证两种目标蛋白质的存在来维持该转基因植物品种。选择了转基因植物，其中所述转基因植物包含两种目标转基因蛋白质(A和B)。制备了蛋白质A和B的样品，并对其进行LC/MS/MS分析。根据所得的MS谱，选择母蛋白质的碎片肽离子以供靶向MS/MS分析。
从转基因植物的第一世代制备了复杂蛋白质样品，并对所述复杂蛋白质样品进行多重LC/MS/MS分析，其中通过在MS谱中确定选定的碎片肽离子的存在来鉴定蛋白质A和B的选定的碎片肽离子。然后从转基因植物的下一世代的植物制备复杂蛋白质样品。对这些下一世代植物的复杂蛋白质样品进行多重LC/MS/MS分析。繁殖下述下一世代的植物以维持转基因植物品种：从这些植物制备的复杂蛋白质样品产生其中根据选定碎片肽离子的存在鉴定出了蛋白质A和B均存在的MS谱。为了维持转基因植物品种，不繁殖下述下一世代的植物：从这些植物制备的复杂蛋白质样品产生其中蛋白质A或蛋白质B的存在均未鉴定出的MS谱。
实施例VI
筛选从植物转化方法中获得的转化体以确定两种目标靶蛋白的存在。对两种靶蛋白(A和B)进行LC/MS/MS分析。根据所得的MS谱，选择母靶蛋白的碎片肽离子以供靶向MS/MS分析。
从植物转化方法获得推定的转化体。从每个推定的转化体制备复杂蛋白质样品。将这些推定的转化体的复杂蛋白质样品进行多重LC/MS/MS分析，其中靶蛋白的表达是通过明确选定碎片肽离子的存在来确定的。繁殖下述转化体，从这些转化体制备的复杂蛋白质样品产生其中根据选定的碎片肽离子的存在确定了蛋白质A和B所需的表达特征的MS谱。
实施例VII
实现了转基因在转基因植物中的生物限制。对两种由转基因植物表达的靶蛋白(A和B)进行LC/MS/MS分析。根据所得的MS谱，选择母靶蛋白的碎片肽离子以供靶向MS/MS分析。
收集来自在转基因植物周围环境中生长的植物的植物材料。从该植物材料制备了复杂蛋白质样品。对来自这些植物材料的复杂蛋白质样品进行多重LC/MS/MS分析，其中污染转基因的存在是通过明确所表达转基因蛋白质的选定碎片肽离子的存在来确定的。摧毁下述植物：从这些植物收集的材料通过多重LC/MS/MS分析显示包含污染的转基因蛋白质。
通过提述将以下文件以其整体并入本文：
Alwine等(1977)Proc.Nat.Acad.Sci.74:5350-54；Baldwin(2004)Mol.Cell.Proteomics3(1):1-9；Carr和Annan(1997)Overviewofpeptideandproteinanalysisbymassspectrometry.In:CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等编辑NewYork:Wiley,p.10.21.1-10.21.27；Chang等(2000)PlantPhysiol.122(2):295-317；Domon和Aebersold(2006)Science312(5771):212-17；Nain等(2005)PlantMol.Biol.Rep.23:59-65；Patterson(1998)Proteinidentificationandcharacterizationbymassspectrometry.In:CurrentProtocols inMolecularBiology,Ausubel等编辑NewYork:Wiley,p.10.22.1-10.22.24；PatersonandAebersold(1995)Electrophoresis16:1791-1814；Rajagopal和Ahern(2001)Science294(5551):2571-73；Sesikeran和Vasanthi(2008)AsiaPac.J.Clin.Nutr.17Suppl.1:241-44；以及Toplak等(2004)PlantMol.Biol.Rep.22:237-50。

Claims (5)

1.一种在来自转基因植物的基于植物的样品中检测两种或更多种具有已知氨基酸序列的目标蛋白质的存在的高通量方法，该方法包括：
(i)对于两种或更多种蛋白质提供质谱数据，所述两种或更多种目标蛋白质为该转基因植物中转基因表达的预期产物；
(ii)提供包含蛋白质的复杂的基于植物的样品的第一注入，其中所述样品是从目标组织提取的粗植物基质；
(iii)使所述粗植物基质与蛋白酶接触以将蛋白质消化成肽；
(iv)将经消化的粗植物基质注入液相层析-质谱装置；
(v)对于所述肽获得同时质谱数据，和
(vi)将v)的同时质谱数据与所述对于所述两种或更多种目标蛋白质提供的质谱数据相比较，由此确定所述两种或更多种目标蛋白质的存在与否。
2.权利要求1的方法，其中所述两种或更多种目标蛋白质为两种目标蛋白质或四种目标蛋白质。
3.权利要求1或2的方法，其中所述蛋白质是在注入之前的单一步骤中消化的。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述蛋白质是在单一步骤中电离的。
5.权利要求1-3中任一项的方法，其中对于对应于两种或更多种目标蛋白质的肽的质谱数据是在单一步骤中获得的。
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