CN105241853B - 一种全内反射荧光成像*** - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种全内反射荧光成像***，包括第一成像***和第二成像***，所述第一成像***包括N个第一光源和N个第一二向色镜，所述N个光源与所述N个二向色镜一一对应，即相当于共用某些光学元件的N条独立的激光光路，所述第二成像***通过第二接收装置获取到第二像的位置的不同判断样品高度的变化，根据样品高度的变化进行自动补偿，以保证样品始终处于聚焦的位置。本发明实施例可通过第二成像***分别对N条独立的激光光路进行光路调节，以实现N条独立的激光光路具有相同的穿透深度，进而无需在切换不同光源时，再进行光路调节，从而节省了实验当中费时的光路调节。

Description

一种全内反射荧光成像***
技术领域
本发明涉及光学技术领域，尤其涉及一种全内反射荧光成像***。
背景技术
随着单分子成像技术的发展，研究人员可以观察到单个碱基在DNA/RNA链上的延伸，这大大促进了第三代基因测序技术-单分子测序技术的发展。通过在待测对象互补序列上每次添加一个碱基，互补链得到不断延伸，最终我们将获得整条待测链的基因序列。与目前流行的第二代基因测序技术相比，单分子测序技术不需要聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)扩增，从而降低了测序错误率。
为了实现单分子测序，人们尝试了很多方法，例如色谱柱分离、放射性同位素标记等。但是这些方法都不具备单分子测序所需要的分辨率。荧光显微成像由于其较高的分辨率、较低的成本以及操作的简单性成为了单分子测序的主要方法。常见的荧光显微成像方法有三种：落射荧光显微成像(epi-fluoresence)、共聚焦荧光显微成像(confocal)以及全内反射荧光显微成像(TIRF)。其中共聚焦和全内反射成像的分辨率高于落射荧光成像，而共聚焦成像则需要长时间的扫描才能形成图像，因此不适用与单分子测序。目前，全内反射荧光显微成像为单光路全内反射荧光显微成像，单光路全内反射荧光显微成像在实验中在切换不同光源时，需要针对切换后的光源进行光路调节，操作较繁琐。
发明内容
本发明实施例提供一种多光路全内反射荧光成像***，针对现有技术的缺陷，提供一种操作便捷的全内反射荧光成像***。
本发明提供一种多光路全内反射荧光成像***，包括：包括第一成像***和第二成像***；
所述第一成像***包括N个第一光源、反射镜、N个第一二向色镜、物镜、第一接收装置，所述N个第一光源与所述N个第一二向色镜一一对应，所述N为大于1的整数；所述第一光源发出的光通过所述反射镜反射进入所述第一二向色镜，所述第一二向色镜将光反射进入所述物镜，通过所述物镜的光聚焦于样品上以激发所述样品发出荧光，所述荧光通过所述物镜和所述二向色镜进入所述第一接收装置，形成第一像；
所述第二成像***包括第二光源、补偿透镜、第二二向色镜、所述物镜、第二接收装置；所述第二光源发出的光通过所述补偿透镜进入所述第二二向色镜，所述第二二向色镜将光反射进入所述物镜，通过所述物镜的光聚焦于所述样品上反射，反射光通过所述物镜和所述二向色镜进入所述第二接收装置，形成第二像；
其中，所述物镜、所述第一二向色镜、所述第二二向色镜以及所述第一接收装置沿着单一直线光轴配置。
在本发明所述的全内反射荧光成像***中，所述第一光源包括激光器、发散透镜、准直透镜、第一带通滤波片、视场光阑以及第三二向色镜；
其中，构成上述第一光源的全部光学元件沿着单一直线光轴配置。
在本发明所述的全内反射荧光成像***中，所述N个第一光源中包括的激光器为不同工作波长的激光器。
在本发明所述的全内反射荧光成像***中，所述N个第一光源中包括的光学元件与所述N个第一光源中包括的不同工作波长的激光器一一对应。
在本发明所述的全内反射荧光成像***中，，所述第一接收装置包括镜筒透镜、第二带通滤波片以及电子倍增照相机EMCCD；
其中，构成上述第一接收装置的全部光学元件沿着单一直线光轴配置。
在本发明所述的全内反射荧光成像***中，所述第一二向色镜以及第三二向色镜均与水平方向成45°。
在本发明所述的全内反射荧光成像***中，所述第二二向色镜与水平方向成135°。
在本发明所述的多光路全内反射荧光成像***中，所述物镜为全内反射物镜。
在本发明所述的全内反射荧光成像***中，所述第二光源为LED光源。
本发明实施例提供的全内反射荧光成像***，包括第一成像***和第二成像***，所述第一成像***包括N个第一光源和N个第一二向色镜，所述N个光源与所述N个二向色镜一一对应，即相当于共用某些光学元件的N条独立的激光光路，所述第二成像***通过第二接收装置获取到第二像的位置的不同判断样品高度的变化，根据样品高度的变化进行自动补偿，以保证样品始终处于聚焦的位置。本发明可通过第二成像***分别对N条独立的激光光路进行光路调节，以实现N条独立的激光光路具有相同的穿透深度。相较于现有技术，本发明无需在切换不同光源时，再进行光路调节，从而节省了实验当中费时的光路调节。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例的全内反射荧光成像***结构示意图；
图2为本发明一个实施例的全内反射荧光成像***的第一成像***结构示意图；
图3为本发明一个实施例的全内反射荧光成像***的第二成像***结构示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，应对理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1示出了本发明一个实施例的全内反射荧光成像***100结构示意图。如图1所示，全内反射荧光成像***100，包括第一成像***10(如图2所示)和第二成像***20(如图3所示)，所述第一成像***包括N个第一光源11、反射镜12、N个第一二向色镜13、物镜14、第一接收装置15，所述N个第一光源11与所述N个第一二向色镜13一一对应，所述N为大于1的整数；所述第一光源11发出的光通过所述反射镜12反射进入所述第一二向色镜13，所述第一二向色镜13将光反射进入所述物镜14，通过所述物镜14的光聚焦于物品放置区中的样品上以激发所述样品发出荧光，所述荧光通过所述物镜14和所述二向色镜13进入所述第一接收装置15，形成第一像；所述第二成像***20包括第二光源21、补偿透镜22、第二二向色镜23、所述物镜14、第二接收装置24；所述第二光源21发出的光通过所述补偿透镜22进入所述第二二向色镜23，所述第二二向色镜23将光反射进入所述物镜14，通过所述物镜14的光聚焦于所述样品上反射，反射光通过所述物镜14和所述二向色镜23进入所述第二接收装置24，形成第二像；其中，所述物镜14、所述第一二向色镜13、所述第二二向色镜23以及所述第一接收装置15沿着单一直线光轴配置。
其中，二向色镜又称为双色镜，二向色镜具有对一定波长的光几乎完全透射，而对另一些波长的光几乎完全反射，因此光通过反射镜12反射进入第一二向色镜时可将光完全反射进入所述物镜14中，所述荧光通过所述物镜和所述第一二向色镜时可将光完全透射进入所述第一接收装置15。
其中，所述物镜14为全内反射物镜，以使得物品放置区中的样品受全内反射产生的消逝波激发样品，从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受到激发，而发出荧光。
本发明实施例中，所述第一成像***，请参见图2所示，N个第一光源11中的其中一个第一光源11包括的激光器被开启，第一光源11发出的光经过一系列光学元件到达第一二向色镜13(第一二向色镜13为与被开启的激光器对应的第一二向色镜)，激光被第一二向色镜13反射进入所述物镜14，激光经过所述物镜14，产生消逝波以激发放置于样品放置区中的样品，从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受到激发，以产生荧光，产生的荧光经过物镜进入第一二向色镜13透射，进而进入第一接收装置，以实现单分子测序。
其中，不同的第一二向色镜13之间的切换由机械转轮完成。激光的开启与第一二向色镜13的切换为协同关系，均可由软件自动完成。
本发明实施例中，所述第二成像***为自动聚焦***，请参见图3所示，第二光源21为LED光源，第二光源21发出的光经过补偿透镜22进入第二二向色镜23，被所述第二二向色镜23反射进入所述物镜14，光通过所述物镜14聚焦于所述样品上，被所述样品反射，反射光经过相同的路径(即通过物镜进入第二二向色镜23，被第二二向色镜反射)进入第二接收装置24，形成第二像。自动聚焦***通过在接收装置24形成的第二像的位置的不同可判断样品高度的变化，自动聚焦***根据样品高度的变化进行自动补偿以保证样品始终处于聚焦的位置。
进一步的，所述第一光源11包括激光器111、发散透镜112、准直透镜113、第一带通滤波片114、视场光阑115以及第三二向色镜116；其中，构成上述第一光源11的全部光学元件沿着单一直线光轴配置。
其中，第一光源的工作原理为：激光器111发射出激光，经过发散透镜112使得激光的光斑变大，再经过准直透镜113将发散激光重新平行，平行后的激光通过第一带通滤波片114过滤掉波长偏离激光中心较多的光，又经过视场光阑11使得光斑大小得到优化，最后通过第三二向色镜116将激光反射进入所述反射镜12。
进一步的，所述N个第一光源中包括的激光器为不同工作波长的激光器。
进一步的，所述N个第一光源中包括的光学元件与所述N个第一光源中包括的不同工作波长的激光器一一对应。
本发明实施例中，由于N个第一光源包括的激光器为不同工作波长的激光器，第一带通滤波片114用于过滤掉波长偏离激光中心较多的光，第三二向色镜116用于对一定波长的光几乎完全透射，因此不同工作波长的激光器需要的第一带通滤波片114和第三二向色镜116也均不同。比如589mm激光器和1064mm激光器，带通滤波片为对特定的一部分光透过其他一部分的光截止，589mm激光器对应的第一带通滤波片114用于过滤掉偏离589mm较多的光，即只允许589±预设纳米的光通过，1064mm激光器对应的第一带通滤波片114用于过滤掉偏离1064mm较多的光，即只允许1064±预设纳米的光通过，其中，预设纳米可以是10mm、20mm、40mm、55mm或是其他值，可见适用于589mm激光器对应的第一带通滤波片114不适用于1064mm激光器，因此，N个第一光源包括第一带通滤波片114不相同。当然N个第一光源包括第一带通滤波片114也可以相同，比如激光器中心波长非常接近的激光器等等。又如，589mm激光器和1064mm激光器，589mm激光器对应的第三二向色镜116用于对589mm±预设纳米的光完全透射，1064mm激光器对应的第三二向色镜116用于对1064mm±预设纳米的光完全透射，因此，N个第一光源包括第三二向色镜116不相同。当然N个第一光源包括第三二向色镜116也可以相同，比如激光器中心波长非常接近的激光器等等。
发散透镜112使得激光的光斑变大，和准直透镜113将发散激光重新平行，未限定工作波长，则不同工作波长的激光器中的发散透镜112和准直透镜113可以相同也可以不同。
进一步的，所述第一接收装置15包括镜筒透镜151、第二带通滤波片152以及电子倍增照相机(Electron-Multiplying CCD，EMCCD)153，其中，构成上述第一接收装置15的全部光学元件沿着单一直线光轴配置。
进一步的，所述第一二向色镜13以及第三二向色镜116均与水平方向成45°
进一步的，所述第二二向色镜23与水平方向成135°
本发明实施例提供的全内反射荧光成像***，优势在于引入了N条独立激光光路。这N条独立激光光路均可独立调节全内反射角以达到相同的穿透深度，从而省去了实验当中费时的光路调节步骤。根据实验需要，N条独立激光光路可以交替成像，给实验设计带来很大的灵活性。在本发明实施例中，采用切换第一二向色镜13的方法来实现交替成像(比如当某一路激光被开启，经由一系列棱镜之后到达第一二向色镜13，根据激光的工作波长，选择与该工作波长对应的第一二向色镜13，从而将激光反射进入所述物镜13当中。不同的第一二向色镜13之间的切换由机械转轮完成。激光的开启与第一二向色镜13的切换为协同关系，均可由软件自动完成)，使得在信号收集阶段只需采用一个EMCCD相机，既达到了单分子测序的目的又节约了成本。此外本发明的光路设计相对于现有技术更简洁、紧凑以及操作便捷，为操作者提供了很大便利。
本发明实施例提供的全内反射荧光成像***，N条独立激光光路也可以同时成像，N条独立激光光路同时成像需要与N条独立激光光路对应的N个EMCCD照相机，比如当N条激光被开启，N条激光经由一系列棱镜之后到达反射镜12(偏振分光片)被分为N条激光后，分别到达与N条激光对应的第一二向色镜13，从而将N条激光反射进入所述物镜14当中，通过所述物镜14被激发成N条荧光，N条荧光分别进入N个EMCCD照相机，以实现同时成像。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明。本领域技术人员可以理解的是，本发明的多光路全内反射荧光成像***不仅适用于实现单分子测序，还适用于其它分子测序。因而凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种全内反射荧光成像***，其特征在于，包括第一成像***和第二成像***；
所述第一成像***包括N个第一光源、反射镜、N个第一二向色镜、物镜、第一接收装置，所述N个第一光源与所述N个第一二向色镜一一对应，所述N为大于1的整数；所述第一光源发出的光通过所述反射镜反射进入所述第一二向色镜，所述第一二向色镜将光反射进入所述物镜，通过所述物镜的光聚焦于样品上以激发所述样品发出荧光，所述荧光通过所述物镜和所述二向色镜进入所述第一接收装置，形成第一像，所述物镜为全内反射物镜，所述荧光是受全内反射产生的消逝波激发所述样品产生的；
所述第二成像***包括第二光源、补偿透镜、第二二向色镜、所述物镜、第二接收装置；所述第二光源发出的光通过所述补偿透镜进入所述第二二向色镜，所述第二二向色镜将光反射进入所述物镜，通过所述物镜的光聚焦于所述样品上反射，反射光通过所述物镜和所述二向色镜进入所述第二接收装置，形成第二像，所述第二成像***通过在所述第二接收装置形成的所述第二像的位置不同判断样品高度的变化，根据样品高度的变化进行自动补偿以保证样品始终处于聚焦的位置；
其中，所述物镜、所述第一二向色镜、所述第二二向色镜以及所述第一接收装置沿着单一直线光轴配置；
所述第一光源包括激光器、发散透镜、准直透镜、第一带通滤波片、视场光阑以及第三二向色镜，其中，构成所述第一光源的全部光学元件沿着单一直线光轴配置，所述第一光源的工作原理为：所述激光器发射出激光，经过所述发散透镜使得激光的光斑变大，再经过所述准直透镜将发散激光重新平行，平行后的激光通过所述第一带通滤波片过滤掉波长偏离激光中心较多的光，又经过所述视场光阑使得光斑大小得到优化，最后通过所述第三二向色镜将激光反射进入所述反射镜；
所述N个第一光源中包括的激光器为不同工作波长的激光器；激光器的开启与第一二向色镜的切换为协同关系。
2.根据权利要求1所述的成像***，其特征在于，所述N个第一光源中包括的光学元件与所述N个第一光源中包括的不同工作波长的激光器一一对应。
3.根据权利要求1所述的成像***，其特征在于，所述第一接收装置包括镜筒透镜、第二带通滤波片以及电子倍增照相机EMCCD；
其中，构成上述第一接收装置的全部光学元件沿着单一直线光轴配置。
4.根据权利要求1～3任一项所述的成像***，其特征在于，所述第一二向色镜以及第三二向色镜均与水平方向成45°。
5.根据权利要求1～3任一项所述的成像***，其特征在于，所述第二二向色镜与水平方向成135°。
6.根据权利要求1～3任一项所述的成像***，其特征在于，所述物镜为全内反射物镜。
7.根据权利要求1～3任一项所述的成像***，其特征在于，所述第二光源为LED光源。
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