CN105232548B - 小檗碱作为金属β‑内酰胺酶抑制剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小檗碱的一种新用途，可作为金属β‑内酰胺酶抑制剂用于防止对金属β‑内酰胺酶敏感的化合物被酶解，特别是防止金属β‑内酰胺酶对β‑内酰胺类抗生素的水解，对该类抗生素起到保护作用。

Description

小檗碱作为金属β-内酰胺酶抑制剂的用途

技术领域

本发明涉及小檗碱的一种新用途，作为金属β-内酰胺酶抑制剂，用于防止对金属β-内酰胺酶敏感的化合物被酶解，优选防止金属β-内酰胺酶对β-内酰胺类抗生素的水解，对该类抗生素起到保护作用。通过在青霉素等β-内酰胺类抗生素的各类制剂中添加小檗碱，以抑制产金属β-内酰胺酶的微生物对β-内酰胺类抗生素的水解，从而提高β-内酰胺类抗生素的稳定性，维持抗生素的疗效。或者作为预防用药，在使用β-内酰胺类抗生素之前，先用小檗碱抑制金属β-内酰胺酶的活性，提高β-内酰胺类抗生素的作用效果。

背景技术

β-内酰胺类抗生素疗效好而毒性小，是目前治疗感染性疾病的重要药物。该类药物包括青霉素类、头孢菌素类、青霉烯类、头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类抗生素等，它们结构上都具有一个发挥抗菌活性不可缺少的β-内酰胺环。

β-内酰胺酶是细菌产生的一类耐药酶，它可催化β-内酰胺类抗生素中的内酰胺环水解开环而破坏，从而使细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性。基于DNA序列相似性，β-内酰胺酶分为4类：A-D。其中，A,C,D三类酶依赖于活性中心的Ser发挥催化作用，可以被克拉维酸、他唑巴坦和舒巴坦等临床上使用的抗生素所抑制；而B类酶需要依赖活性中心的Zn发挥催化作用酶，被称为金属β-内酰胺酶(MBL)，该类酶临床上尚无有效的抑制剂。

2010年8月11日出版的英国《柳叶刀-传染病》期刊报道了一种新的超级细菌，该菌能产生NDM-1型金属β-内酰胺酶(新德里金属β-内酰胺酶1)，携带这一耐药因子的新型细菌对几乎包括碳氢霉烯在内的几乎所有抗生素都具有抗药性，患者死亡率很高。由于这一耐药因子的基因是存在质粒上的，可以独立于染色体之外自主复制，并可以转移到不同种属的细菌内，病菌拥有传播和变异的惊人潜能。NDM-1超级细菌的出现引起全球的关注和紧张,世界卫生组织呼吁各国加强监控,敦促各国采取措施抗击耐药性细菌,积极减少细菌对抗生素产生抗药的机会。NDM-1的出现也使得金属β-内酰胺酶及其抑制剂的研究成为全球关注的热点。

发明内容

本发明公开了小檗碱的新用途，其可以抑制金属β-内酰胺酶的活性，可作为金属β-内酰胺酶抑制剂用于提高β-内酰胺类抗生素的稳定性，延长作用时间，提高抗生素的活性。

本发明具体技术方案如下：

小檗碱及其盐、水合物或溶剂合物在制备金属β-内酰胺酶抑制剂中的用途。

小檗碱化合物原型结构如下：

本发明所述的小檗碱可以为季铵式、醛式或醇式的小檗碱。优选季铵式的小檗碱。所述小檗碱的盐优选盐酸小檗碱或硫酸小檗碱。

小檗碱来源简单，原材料是常见中药，可以从植物中提取，也可以从原料商业来源购买得到。

本发明所述金属β-内酰胺酶包括IMP-1、VIM-2或NDM-1型金属β-内酰胺酶。所述金属β-内酰胺酶包括从自然界中提取或用基因工程菌制备的金属β-内酰胺酶。

本发明所述的用途，可以将小檗碱及其盐、水合物或溶剂合物作为金属β-内酰胺酶抑制剂，抑制β-内酰胺类抗生素被金属β-内酰胺酶水解。所述β-内酰胺类抗生素为分子结构中包括β-内酰胺环的抗生素。优选的，包括青霉素类、头孢菌素类、青霉烯类、头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类抗生素。进一步优选，青霉素类的氨苄西林，阿莫西林，替卡西林，哌拉西林；头孢类的头孢氨苄、头孢拉定，头孢呋辛，头孢克洛，头孢他啶；头霉素；单环β-内酰胺类的氨曲南，碳氢霉烯类的亚胺培南，美罗培南，比阿培南等。

本发明公开了小檗碱作为金属β-内酰胺酶抑制剂方面的应用，小檗碱可以通过固体粉末、颗粒以及溶液等形式与β-内酰胺类抗生素混合，以保护抗生素不被金属β-内酰胺酶水解，提高β-内酰胺类抗生素的稳定性。或者作为预防用药，在使用β-内酰胺类抗生素之前，先用小檗碱抑制金属β-内酰胺酶的活性，提高β-内酰胺类抗生素的作用效果。

小檗碱是一种异喹啉生物碱，又称黄连素，存在于小檗科等4科10属的许多植物中。小檗碱对溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、***和弗氏、志贺氏痢疾杆菌均有抗菌作用，并有增强白血球吞噬作用。小檗碱的盐酸盐(俗称盐酸黄连素)多用于治疗胃肠炎、细菌性痢疾等，对肺结核、猩红热、急性扁桃腺炎和呼吸道感染也有一定疗效。随着临床耐药菌、超级细菌的出现，很多抗生素的临床效果并不理想，甚至是毫无作用。目前尚未有小檗碱在抗耐药菌，尤其是超级细菌作用方面有新的报道，也未见盐酸小檗碱作为MBL抑制剂，尤其是对超级细菌产生的NDM-1型金属β-内酰胺酶的抑制活性方面的报道，本发明公开了盐酸小檗碱这一新的活性，可用于抑制产MBL微生物对β-内酰胺类抗生素的水解，提高抗生素的稳定性，作为β-内酰胺类抗生素的保护剂以及抗超级细菌的潜在药物，而具有良好的开发应用前景。

具体实施方式

结合以下具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

实施例1 小檗碱对金属β-内酰胺酶抑制活性的检测

使用60μM头孢呋辛钠为底物，所用缓冲液为50mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，200mM NaCl，100μM ZnCl₂，pH＝7.2，反应温度为30℃，使用的金属β-内酰胺酶终浓度为10nM，检测波长为260nm,具体过程如下：

1.首先将金属β-内酰胺酶用缓冲液配置成浓度10nM的溶液，置于30℃孵育10min，使得Zn²⁺充分占据活性中心；

2.将小檗碱溶于缓冲液中，配置成不同的浓度，加入到酶液中，30℃孵育6min，使抑制剂与酶充分结合；

3.取1ml上述溶液加入石英比色皿中，加入3μL头孢呋辛钠(终浓度60μM)摇匀，立即测定体系吸光度的变化，记录数据。

由于底物头孢呋辛钠被酶水解后其吸光度下降，因而通过测定吸光度的变化可以表征底物的水解程度。计算不同浓度的小檗碱对β-内酰胺酶水解底物的抑制率，以化合物的浓度对抑制率拟合曲线，计算IC₅₀值，并以已知的NDM-1酶抑制剂L-卡托普利作为阳性对照，结果表明小檗碱抑制NDM-1型金属β-内酰胺酶的IC₅₀为6.77±0.45μM，抑制VIM-2型金属β-内酰胺酶的IC₅₀为12.21±1.30μM，抑制IMP-1型金属β-内酰胺酶的IC₅₀为10.12±0.57μM(表1)。

表1对金属β-内酰胺酶的抑制活性(μmol/L)

化合物	NDM-1	VIM-2	IMP-1
				小檗碱	6.77±0.45	12.21±1.30	10.12±0.57
L-卡托普利(阳性对照)	304±23.5	ND*	ND*

*注ND:未检测

实施例2盐酸小檗碱对β-内酰胺类抗生素的保护作用

试验所用的产MBLs菌株为基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1菌，该菌株可以胞内可溶性表达NDM-1型β-内酰胺酶，水解β-内酰胺类抗生素，使抗生素失活。以E.coli BL21(DE3)/pET28a菌株作为阴性对照。采用二倍稀释法测定，通过保护指数反映小檗碱对抗生素的保护作用。

保护指数定义为，达到相同活性效果(如抑菌)时，未添加保护剂时抗生素所使用的浓度，与添加保护剂时抗生素所用浓度的比值，如下式：该值大于1时，表明加入保护剂后，抗生素需要使用的量可减少，该值越大，表明保护剂的效果越强。

具体方法如下：

将超低温冰箱中保存的工程菌菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1(产酶菌)以及对照菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(对照菌)分别接种于灭菌的Luria-Bertani(LB)固体培养基中，于37℃恒温培养箱中倒置培养12小时。用接种环挑取单菌落分别转接到灭菌的液体LB培养基中，于37℃，200rpm条件下震荡培养至对数生长期。用紫外分光光度计测定600nm波长处菌液的吸光度值(OD₆₀₀)，根据1OD＝1×10⁹CFU/mL的换算关系，分别将表达金属β-内酰胺酶的工程菌菌株以及对照菌株用无菌LB培养基稀释至1×10⁶CFU/mL，加入到无菌96孔板中，分别测定单独使用抗生素、抗生素+小檗碱对细菌的抑制能力，测定小檗碱对抗生素的保护指数。

(1)盐酸小檗碱对头孢呋辛钠的保护作用

精密称取盐酸小檗碱32mg，加入灭菌的蒸馏水10mL，加热溶解作为储备液。将抗生素头孢呋辛钠用无菌生理盐水(0.9％NaCl)溶解配置成512μg/mL溶液，取100μl加入到96孔板的第1列孔中，然后从该孔中取50μl转入第2列孔中，加入无菌生理盐水50μl，用移液枪小心吹吸几次混匀，再取50μl转入第3列孔中，同法加入无菌生理盐水进行二倍比稀释。然后在各孔中分别加入50μl菌液，使抗生素终浓度为256～1μg/mL。试验组分别加入1μl盐酸小檗碱储备液，对应盐酸小檗碱终浓度为32μg/mL；对照组加入1μl无菌蒸馏水。以上各组于37℃恒温培养箱培养12-16小时，观察各孔细菌的生长情况，结果如表2所示，其中“+”代表菌生长，“—”代表菌不生长：

表2.盐酸小檗碱对头孢呋辛钠的保护指数测定结果

从表2结果可得，单独使用头孢呋辛钠对产NDM-1型金属β-内酰胺酶的E.coli菌MIC为128μg/mL，加入盐酸小檗碱后，头孢呋辛钠对该产酶菌的MIC为16μg/mL；相对应不含头孢呋辛钠，仅加入32μg/mL盐酸小檗碱的对照组中，耐药菌正常生长，表明在该浓度下，单独使用盐酸小檗碱对产酶菌的生长没有抑制作用，盐酸小檗碱是通过抑制NDM-1对头孢呋辛钠的水解，从而增强了头孢呋辛钠的抗产酶菌活性。计算得到盐酸小檗碱对头孢呋辛钠的保护指数为8。

(2)硫酸小檗碱对美罗培南的保护作用

精密称取硫酸小檗碱24mg，加入灭菌的蒸馏水10mL，加热溶解作为储备液。将抗生素美罗培南用无菌生理盐水(0.9％NaCl)溶解配置成512μg/mL溶液，取100μl加入到96孔板的第1列孔中，然后从该孔中取50μl转入第2列孔中，加入无菌生理盐水50μl，用移液枪小心吹吸几次混匀，再取50μl转入第3列孔中，同法加入无菌生理盐水进行二倍比稀释。然后在各孔中分别加入50μl菌液，使抗生素终浓度为256～1μg/mL。试验组分别加入1μl硫酸小檗碱储备液，对应硫酸小檗碱终浓度为24μg/mL；对照组加入1μl无菌蒸馏水。以上各组于37℃恒温培养箱培养12-16小时，观察各孔细菌的生长情况，结果如表1所示，其中“+”代表菌生长，“—”代表菌不生长(表3)。

表3.硫酸小檗碱对美罗培南的保护指数测定结果

从表3结果可得，单独使用美罗培南对产NDM-1型金属β-内酰胺酶的E.coli菌MIC为64μg/mL，加入硫酸小檗碱后，美罗培南对该产酶菌的MIC为16μg/mL；相对应不含美罗培南，仅加入24μg/mL硫酸小檗碱的对照组中，耐药菌正常生长，表明在该浓度下，单独使用硫酸小檗碱对产酶菌的生长没有抑制作用，硫酸小檗碱是通过抑制NDM-1对美罗培南的水解，从而增强了美罗培南的抗产酶菌活性。计算得到硫酸小檗碱对美罗培南的保护指数为4。

Claims (8)

1.小檗碱及其盐在制备金属β-内酰胺酶抑制剂中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述小檗碱为季铵式、醛式或醇式的小檗碱。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述小檗碱的盐为盐酸小檗碱或硫酸小檗碱。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述金属β-内酰胺酶包括IMP-1、VIM-2或NDM-1型金属β-内酰胺酶。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述金属β-内酰胺酶包括从自然界中提取或用基因工程菌制备的金属β-内酰胺酶。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于将小檗碱及其盐作为金属β-内酰胺酶抑制剂，抑制β-内酰胺类抗生素被金属β-内酰胺酶水解。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于所述β-内酰胺类抗生素为分子结构中包括β-内酰胺环的抗生素。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于所述β-内酰胺类抗生素包括青霉素类、头孢菌素类、青霉烯类、头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类抗生素。