CN105229156A - 用于利用提取发酵生产丁醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于从发酵培养基中回收丁醇的方法。所述方法包括提供发酵培养基,所述发酵培养基包含丁醇、水、以及含有丁醇生物合成途径的重组微生物,其中所述重组微生物产生丁醇;使所述发酵培养基与包含无水溶剂的与水不混溶的有机提取剂组合物接触以形成水相和含丁醇的有机相;以及从含丁醇的有机相中回收丁醇。
Description
交叉引用
本申请要求2013年3月15日提交的名称为“MethodforProductionofButanolUsingExtractiveFermentation”的美国临时专利申请号61/790,828的优先权,该文献全文以引用方式并入本文。另外,本专利申请以引用方式并入以下临时专利申请全文:2013年3月15日提交的名称为“MethodforProductionofButanolUsingExtractiveFermentation”的美国临时专利申请号61/788,213,以及2013年3月15日提交的名称为“MethodforProductionofButanolUsingExtractiveFermentation”的美国临时专利申请号61/790,401。
技术领域
本发明涉及工业微生物以及丁醇和其异构体的发酵生产的领域。更具体地讲,本发明涉及用于通过微生物发酵生产丁醇的方法,其中丁醇产品通过提取到与水不混溶的提取剂组合物中而被去除,该提取剂组合物包含无水溶剂。
背景技术
丁醇是一种重要的工业化学品,其可用作燃料添加剂、塑料工业中的化学原料以及食品和调味剂工业中的食品级提取剂。每年,通过石油化学手段生产100至120亿磅的丁醇,并且对该日用化学品的需求未来可能还会增加。
若干种化学合成方法是已知的;然而,这些生产丁醇的方法利用来源于石油化工产品的起始物质,并且普遍成本高昂且对生态环境有害。若干种通过发酵生产丁醇的方法同样是已知的,例如ABE方法,这种发酵方法产生丙酮、1-丁醇和乙醇的混合物。通过丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)进行的丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵是已知最古老的工业发酵之一;负责产生这些溶剂的途径和基因也同样如此。通过ABE方法进行的1-丁醇生产受1-丁醇对丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的毒性效应限制。已有报导称,利用对细菌无毒的特定提取剂的原位提取发酵方法提高了通过利用丙酮丁醇梭菌的发酵进行的1-丁醇生产(参见例如Roffler等人,Biotechnol.Bioeng.31:135-143,1998;Roffler等人,BioprocessEngineering2:1-12,1987;和Evans等人,Appl.Environ.Microbiol.54:1662-1667,1988)。
与上述野生型的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)不同,还描述了表达1-丁醇、2-丁醇和异丁醇的生物合成途径的重组微生物制备宿主。这些重组的宿主具有以比ABE方法更高的产量生产丁醇的潜能,因为它们不产生副产品诸如丙酮和乙醇。使用这些重组的宿主时,丁醇的生物生产似乎受限于丁醇对发酵中所用宿主微生物的毒性阈值。美国专利公布20090305370公开了从至少一种可发酵的碳源制备丁醇的方法,通过利用一种重组的微生物宿主进行发酵,其中在发酵过程中丁醇被提取至特定的有机提取剂中,该方法克服了毒性问题,导致丁醇生产的有效滴度、有效速率和有效收率的提升。
用于从发酵培养基生产和回收丁醇的改进的方法在不断地被寻求。同样期望找到低成本的方法和对工艺可操作性的改进。不断地需要鉴定用于发酵培养基的改进的提取剂,诸如表现出更高的分配系数、更低的粘度、更低的密度、商业上可用的沸点、和充分的微生物生物相容性的提取剂。另外,对丁醇的选择性先于水的提取剂提供某些优点。以举例的方式,对丁醇的选择性先于水的提取剂可减少丁醇发酵方法所需的能量。从提取剂中汽提丁醇所需的总能量减少可能是由于与提取剂相关的水的减少,因为从提取剂中汽提丁醇所需的能量与提取剂中存在的水量直接相关。
本发明满足了提供用于从发酵培养基中回收丁醇的方法的需要,该方法通过使发酵培养基与包含无水溶剂的有机提取剂组合物接触来进行,其中该无水溶剂从发酵培养基中选择性地提取丁醇。
发明内容
本文提供了用于从发酵培养基中回收丁醇的方法。该方法包括(a)提供发酵培养基,该发酵培养基包含丁醇、水以及含有丁醇生物合成途径的重组微生物,其中重组微生物产生丁醇;(b)使发酵培养基与包含无水溶剂的与水不混溶的有机提取剂组合物接触以形成水相和含丁醇的有机相;以及(c)从含丁醇的有机相中回收丁醇。
在某些实施例中,无水溶剂为饱和烃。饱和烃可为例如C7至C22烷烃或它们的混合物。C7至C22烷烃可为支链的C7至C22烷烃。在一些实施例中,烷烃包括至多C25烷烃。在另一个实施例中,烃为不饱和的烃或芳族烃。烃可为例如异丁醇的衍生物。异丁醇的衍生物可为例如三异丁烯、二异丁烯、四异丁烯、异辛烷、异十六烷、3,4,5,6,6-五甲基-2-庚醇、或异十二烷。
在一些实施例中,有机提取剂组合物还包含第二溶剂。第二溶剂可为例如C4至C22脂肪醇、C4至C28脂肪酸、C4至C28脂肪酸的酯、C4至C22脂肪醛、C7至C22醚、酰胺、磷酸酯、脲、苯酚(酚醛树脂)、次膦酸酯、氨基甲酸酯、磷酰胺、或它们的混合物。第二溶剂可为例如油醇、苯基醇、鲸蜡醇、月桂醇、肉豆蔻醇、硬脂醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、辛酸、癸酸、十一烷酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、1-壬醇、1-癸醇、2-十一醇、1-壬醛、1-十一烷醇、十一烷醛、异十二烷醇、月桂醛、2-甲基十一醛、油酰胺、亚油酰胺、棕榈酸酰胺、硬脂酰胺、2-乙基-1-己醇、2-己基-1-癸醇、2-辛基-1-十二烷醇、或它们的混合物。在实施例中,溶剂中的一种或多种包含磷、氮、硫或氧中的一者或多者。例如,因为溶剂是极性的或表现出氢键合,所以选择溶剂中的至少一种。第二溶剂可增加有机提取剂组合物的丁醇分配系数。
在一些实施例中,有机提取剂组合物与发酵培养基的接触在发酵罐中发生。在其它实施例中,有机提取剂组合物与发酵培养基的接触在发酵罐的外部发生。在一些实施例中,在发酵培养基的一部分从发酵罐转移到容器之后回收丁醇,其中有机提取剂组合物与发酵培养基的接触在容器中发生。在一些实施例中,丁醇为异丁醇。
在一些实施例中,回收的丁醇具有约20g/L至约50g/L的发酵培养基的有效滴度。在一些实施例中,回收的丁醇具有约22g/L至约80g/L的有效滴度。在一些实施例中,回收的丁醇具有约25g/L至约50g/L的有效滴度。在实施例中,回收的丁醇具有至少25g/L、至少30g/L、至少46g/L、至少50g/L、至少60g/L、或至少70g/L的发酵培养基的有效滴度。
在一些实施例中,回收的丁醇具有约20g/L至约80g/L的发酵培养基的有效滴度。在一些实施例中,回收的丁醇具有约25g/L至约50g/L的有效滴度。在一些实施例中,回收的丁醇具有约30g/L至约80g/L的有效滴度。在实施例中,回收的丁醇具有至少25g/L、至少30g/L、至少35g/L、至少37g/L、至少40g/L、或至少45g/L的发酵培养基的有效滴度。
还提供了组合物,该组合物包含与水不混溶的有机提取剂组合物中的丁醇,其中有机提取剂组合物包含溶剂,其中该溶剂为无水溶剂。
在某些实施例中,无水溶剂为饱和烃。该饱和烃可为例如C7至C22烷烃或它们的混合物。C7至C22烷烃可为支链的C7至C22烷烃。烃可为例如异丁醇的衍生物。异丁醇的衍生物可为例如三异丁烯、二异丁烯、四异丁烯、异辛烷、异十六烷、3,4,5,6,6-五甲基-2-庚醇、或异十二烷。
在一些实施例中,有机提取剂组合物还包含第二溶剂。第二溶剂可为例如C4至C22脂肪醇、C4至C28脂肪酸、C4至C28脂肪酸的酯、C4至C22脂肪醛、C7至C22醚、或它们的混合物。第二溶剂可为例如油醇、苯基醇、鲸蜡醇、月桂醇、肉豆蔻醇、硬脂醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、辛酸、癸酸、十一烷酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、1-壬醇、1-癸醇、2-十一醇、1-壬醛、十一烷醇、十一烷醛、异十二烷醇、月桂醛、2-甲基十一醛、油酰胺、亚油酰胺、棕榈酸酰胺、硬脂酰胺、2-乙基-1-己醇、2-己基-1-癸醇、2-辛基-1-十二烷醇、或它们的混合物。另外的示例包括氧化膦、四烷基脲、烷基酚、对羟基苯甲酸酯、水杨酸酯等。第二溶剂可增加有机提取剂组合物的丁醇分配系数。
在一些实施例中,丁醇为异丁醇。
在一些实施例中,从水性溶液中提取醇的方法包括:(A)通过基于第一溶剂和第二溶剂的相应特性识别第一溶剂和第二溶剂来选择待包含在溶剂混合物中的溶剂,其中第一溶剂和第二溶剂具有相似的化学结构;(B)基于溶剂混合物的疏水性设定待包含在溶剂混合物中的第一溶剂与第二溶剂的比率的极限,其中溶剂混合物的疏水性不由第一溶剂的疏水性和第二溶剂的疏水性的线性组合表示;(C)确定待包含在溶剂混合物中的第一溶剂与第二溶剂的比率在所述极限内以平衡溶剂混合物的总体特性,从而溶剂混合物表现出至少一种协同特性,该协同特性不由各自对应于至少一种协同特性的第一溶剂特性和第二溶剂特性的线性组合表示;以及(D)使包含醇的水性溶液与溶剂混合物接触以提取醇。在示例中,对于在辛醇存在下的第一溶剂与水的三元混合物而言,第一溶剂的疏水性是有机相中第一溶剂的量除以水相中第一溶剂的量的比率的以十为底的对数;其中对于在辛醇存在下的第二溶剂与水的三元混合物而言,第二溶剂的疏水性是有机相中第二溶剂的量除以水相中第二溶剂的量的比率的以十为底的对数;并且其中对于在辛醇存在下的溶剂混合物与水的混合物而言,溶剂混合物的疏水性是有机相中溶剂混合物的量除以水相中溶剂混合物的量的比率的以十为底的对数。在另外的示例中,疏水性包括生物相容性的指标。在另一个实施例中,方法包括针对溶剂混合物中待包含的每种溶剂的相互整合的步骤A、B和C,以基于第一溶剂的特性、第二溶剂的特性、以及另外包含在溶剂混合物中的每种溶剂考虑溶剂混合物的累积特性。在一个示例中,至少一种协同特性包括疏水性。在另外的示例中,疏水性表达为logP。在实施例中,至少一种协同特性包括溶剂混合物增溶水的能力。在一些示例中,至少一种协同特性包括溶剂混合物在具有丁醇与水的混合物中的分配系数(Kd)。在一些实施例中,至少一种协同特性包括与产生醇的微生物的生物相容性。另外,在一个示例中,微生物包括经基因修饰的微生物。在另一个实施例中,经基因修饰的微生物包括丁醇菌。在一些实施例中,第一溶剂或第二溶剂中的至少一者与丁醇菌基本上生物相容。另外,在一些实施例中,第一溶剂与丁醇菌比第二溶剂与丁醇菌相对更生物相容,并且表现出比第二溶剂大的醇选择性。在一些实施例中,至少一种协同特性包括对于从水性溶液中提取营养物质的低亲和力。在示例中,营养物质包括由微生物支持醇发酵的营养物质。在另一个示例中,丁醇菌包括具有工程化以相比于ABE过程产生高含量丁醇的生物合成途径的丁醇菌。在一些实施例中,水性溶液包含发酵液,发酵液包含经基因修饰以产生醇的微生物。在示例中,醇包括杂醇。在一些示例中,第一溶剂包含异丁醇的衍生物。另外,在示例中,异丁醇的衍生物包括下列中的至少一种:三异丁烯、二异丁烯、四异丁烯、异辛烷、异十六烷、3,4,5,6,6-五甲基-2-庚醇、或异十二烷。在根据本公开的实施例中,第一溶剂包含下列中的至少一种:C4至C22脂肪醇、C4至C28脂肪酸、C4至C28脂肪酸的酯、C4至C22脂肪醛、C7至C22醚、酰胺、磷酸酯、脲、苯酚(酚醛树脂)、次膦酸酯、氨基甲酸酯、磷酰胺、或它们的混合物。在本公开的实施例中,第一溶剂包含下列中的至少一种:油醇、苯基醇、鲸蜡醇、月桂醇、肉豆蔻醇、硬脂醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、辛酸、癸酸、十一烷酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、1-壬醇、1-癸醇、2-十一醇、1-壬醛、1-十一烷醇、十一烷醛、异十二烷醇、月桂醛、2-甲基十一醛、油酰胺、亚油酰胺、棕榈酸酰胺、硬脂酰胺、2-乙基-1-己醇、2-己基-1-癸醇、2-辛基-1-十二烷醇、或它们的混合物。
在一些实施例中,从水性溶液中提取醇的方法包括:将至少两种溶剂合并以形成溶剂混合物,该溶剂混合物表现出不由特性的线性组合表示的协同醇提取特性,其中所述特性各自对应于至少两种溶剂,所述至少两种溶剂通过基于各自对应于至少两种溶剂的特性识别所述至少两种溶剂来选择,其中所述至少两种溶剂中的两种具有相应化学结构;基于每种溶剂的疏水性相对于溶剂混合物中的每种溶剂设定所述至少两种溶剂的比率的极限,其中溶剂混合物的疏水性不由包含在溶剂混合物中的每种溶剂的疏水性的线性组合表示;以及以在极限内的比率将至少两种溶剂混合以平衡溶剂混合物的总体特性,从而溶剂混合物表现出协同醇提取特性。在实施例中,该方法还包括使含有醇的水性溶液与溶剂混合物接触以提取所述醇。在实施例中,协同醇提取特性包括溶剂混合物增溶水的能力。在另外的示例中,疏水性包括在至少两种溶剂或溶剂混合物中的至少一种溶剂在具有辛醇和水的混合物中的分配系数(logP)。在另外的示例中,协同醇提取特性包括溶剂混合物在具有丁醇和水的混合物中的分配系数(Kd)。在一个示例中,溶剂混合物中的至少一种溶剂包含表现出与能够产生醇的微生物的良好生物相容性的无水溶剂,并且溶剂混合物中的至少一种溶剂包括对所述醇表现出高亲和力的溶剂。在另外的示例中,醇包括杂醇。在示例中,杂醇包含丁醇。另外的示例还包括其中丁醇包含异丁醇的情况。在实施例中,水性溶液包含发酵液,该发酵液包含经基因修饰从而相比于ABE方法产生更多异丁醇的异丁醇菌。在一些实施例中,协同醇提取特性包括对由微生物消耗以产生醇的营养物质的差提取效率。在另外的示例中,存在其中疏水性包括生物相容性的指标的情况。在实施例中,极限是近似六(6)的logP。在一些示例中,极限对应于水性溶液中溶剂混合物的浓度,该浓度不足以明显地影响微生物的细胞膜的完整性。
在一些实施例中,一种干燥提取剂的方法包括:使包含含有丁醇生物合成途径的重组微生物以及经由丁醇生物合成途径产生的丁醇的发酵液与第一溶剂接触,以将丁醇的至少一部分提取到第一溶剂中;以及使包含丁醇的至少一部分和至少一些发酵液中的水的第一溶剂与第二溶剂接触以将第一溶剂中的水提取到第二溶剂中,从而干燥包含丁醇的第一溶剂。在根据这些实施例的方法中,使第一溶剂和第二溶剂接触在不存在发酵液的情况下进行。在另外的示例中,第一溶剂包含溶剂混合物,该溶剂混合物通过以下方法制备:将至少两种溶剂合并以形成溶剂混合物,该溶剂混合物表现出不由特性的线性组合表示的协同醇提取特性,其中所述特性各自对应于至少两种溶剂,所述至少两种溶剂通过基于各自对应于至少两种溶剂的特性识别所述至少两种溶剂来选择,其中所述至少两种溶剂中的两种具有对应的化学结构;基于每种溶剂的疏水性相对于溶剂混合物中的每种溶剂设定所述至少两种溶剂的比率的极限,其中溶剂混合物的疏水性不由包含在溶剂混合物中的每种溶剂的疏水性的线性组合表示;以及以在极限内的比率将至少两种溶剂混合以平衡溶剂混合物的总体特性,从而所述溶剂混合物表现出协同醇提取特性。在一些示例中,协同醇提取特性包括溶剂混合物阻隔水的能力。在一些实施例中,疏水性包括在至少两种溶剂或溶剂混合物中的至少一种溶剂在具有辛醇和水的混合物中的分配系数(logP)。另外,存在其中协同醇提取特性包括溶剂混合物在具有丁醇和水的混合物中的分配系数(Kd)的示例。另外,在一个示例中,溶剂混合物中的至少一种溶剂包括表现出与能够产生醇的微生物的良好生物相容性的无水溶剂,并且溶剂混合物中的至少一种溶剂包括对所述醇表现出高亲和力的溶剂。在另外的实施例中,醇包括杂醇。另外,在一些示例中,杂醇包含丁醇。在另外的示例中,丁醇包含异丁醇。在一些示例中,协同醇提取特性包括对由微生物消耗以产生醇的营养物质的差提取效率。在另外的实施例中,疏水性包括生物相容性的指标。在根据本公开的一些实施例中,极限为约六(6)的logP。所述方法还包括其中所述极限对应于水性溶液中溶剂混合物的浓度的情况,该浓度不足以明显地影响微生物的细胞膜的完整性。在示例中,第二溶剂包含甘油。另外,在示例中,使第一溶剂与第二溶剂接触以逆流提取方式进行,该逆流提取在所述第一溶剂与发酵液接触之后进行。在根据本公开的实施例中,第一溶剂包括无水溶剂。
附图说明
图1示意性地示出本发明的方法的一个实施例,其中在使发酵培养基与提取剂在发酵容器中接触之前,使第一与水不混溶的提取剂和任选的第二与水不混溶的提取剂在容器中混合。
图2示意性地示出本发明的方法的一个实施例,其中第一与水不混溶的提取剂和任选的第二与水不混溶的提取剂被分别添加到发酵容器中,发酵培养基在该发酵容器中与提取剂接触。
图3示意性地示出本发明的方法的一个实施例,其中第一与水不混溶的提取剂和任选的第二与水不混溶的提取剂被分别添加到不同的发酵容器中,以使发酵培养基与提取剂接触。
图4示意性地示出本发明的方法的一个实施例,其中对产物的提取在发酵罐的下游进行,并且在使发酵培养基与提取剂在不同容器中接触之前,使第一与水不混溶的提取剂和任选的第二与水不混溶的提取剂在容器中昆合。
图5示意性地示出本发明的方法的一个实施例,其中对产物的提取在发酵罐的下游进行,并且第一与水不混溶的提取剂和任选的第二与水不混溶的提取剂被分别添加到容器中,发酵培养基在该容器中与提取剂接触。
图6示意性地示出本发明的方法的一个实施例,其中对产物的提取在发酵罐的下游进行,并且第一与水不混溶的提取剂和任选的第二与水不混溶的提取剂被分别添加到不同的容器中,以使发酵培养基与提取剂接触。
图7示意性地示出本发明的方法的一个实施例,其中对产物的提取在至少一个分批发酵罐中进行,通过在发酵麦芽浆底部或接近底部处与包含第一溶剂和任选的第二溶剂的与水不混溶的提取剂并流以使发酵罐填充有提取剂,其中提取剂在该发酵罐的顶部或接近顶部处的一点流出该发酵罐。
图8示出用于将异丁醇转化成异丁醇的衍生物例如三异丁烯、二异丁烯、四异丁烯和异十二烷的方法的示意图。
图9为示出水含量和达到预热器出口温度的热需求之间关系的图。
图10为示出水含量和达到100℃换热器温度的热需求之间关系的图。
图11A为相比于COFA和异十二烷的线性组合模型,COFA和异十二烷的模型评估的图示说明。
图11B图示说明了异十二烷/异十二烷醇的各种摩尔浓度影响溶剂混合物的Kd的程度。
图11C图示说明了四丁基脲与异十二烷的各种摩尔浓度影响溶剂混合物的Kd的程度。
图12是多种烷基苯酚溶剂的Kd特性(丁醇的分配系数)相对于溶剂的logP(疏水性)的关系的图示说明。
图13是沸点相对于多种溶剂的logP(疏水性)的关系的图示说明,其包括关于溶剂中碳原子数的符号。
图14是logP相对于玉米油与百里酚的溶剂混合物以及三异丙基苯与百里酚的混合物的摩尔浓度关系的图示说明。
具体实施方式
除非另有定义,本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾,以包括定义的本专利申请为准。此外,除非上下文另外需求,单数术语将包括复数且复数术语将包括单数。本文提及的所有公布、专利和其它参考文献出于各种目的全文以引用方式并入本文,如同每一单独的公布或专利申请均特定且个别地以引用方式并入一样,除非仅专利或专利申请的特定部分被提及以引用方式并入本文。在本文档中施加标题以帮助读者理解本发明所公开的主题。这些标题仅出于读者的便利而提供并且不应当被理解为限制或将本公开分成多个部分。并且,结合一个部分所描述的技术、途径、方法、***和装置一般适用于本公开的其它部分。
为了进一步明确本发明,提供下列术语、缩写和定义。
如本文所用,术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或它们的任何其它变型将被理解为是指包括指定的整数或整数组但不排除任何其它整数或整数组并且旨在是非排他性的或端值开放性的。例如,包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素,而可以包括其它未明确列出的元素,或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外,除非明确指明相反,“或”是指包含性的“或”而非排他性的“或”。例如,条件A或B满足下列中的任一项:A为真实的(或存在的)且B为虚假的(或不存在的),A为虚假的(或不存在的)且B为真实的(或存在的),以及A和B均为真实的(或存在的)。
如本文所用,如整个说明书和权利要求中所使用的,术语“由…组成”或诸如“由…组成的”的变型指示包括任何列举的整数或整数组,但是没有另外的整数或整数组能够被加入到指定的方法、结构、或组合物中。
如本文所用,如整个说明书和权利要求中所使用的,术语“基本上由…组成”或诸如“基本上由…组成”的不同时态的变型表明包括任何列举的整数或整数组,并且任选地包括未显著改变指定的方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何列举的整数或整数组。参见,M.P.E.P.§2111.03。
同样,涉及元素或组分实例的数目(即次数)的在本发明的元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此,应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个,并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代,除非有数字明显表示单数。
如本文所用,术语“发明”或“本发明”是非限制性术语,并且不旨在指本发明的任何单独实施例,而是涵盖如(所提出的或以后所修订的和补充的)权利要求中或本说明书中所述的所有可能的实施例。
如本文所用,用术语“约”修饰本发明的成分或反应物的数量时是指数值量的变化,它们可能发生在,例如,典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序中;这些程序中的偶然误差中;制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中;等。术语“约”还涵盖由于对于起因于特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰,权利要求都包括量的等同量。在一个实施例中,术语“约”指在报告数值的10%范围内,或在报告数值的5%范围内。
如本文所用,术语“丁醇生物合成途径”是指产生1-丁醇、2-丁醇或异丁醇的酶途径。
术语“1-丁醇生物合成途径”是指产生1-丁醇的酶途径。“1-丁醇生物合成途径”可以指从乙酰-辅酶A(乙酰-CoA)产生1-丁醇的酶途径。例如,1-丁醇生物合成途径公开于美国专利申请公布2008/0182308和国际公布WO2007/041269中,它们以引用方式全文并入本文。
术语“2-丁醇生物合成途径”是指产生2-丁醇的酶途径。“2-丁醇生物合成途径”可以指从丙酮酸产生2-丁醇的酶途径。例如,2-丁醇生物合成途径公开于美国专利8,206,970、美国专利申请公布2007/0292927、国际公布WO2007/130518以及WO2007/130521中,它们以引用方式全文并入本文。
术语“异丁醇生物合成途径”是指产生异丁醇的酶途径。“异丁醇生物合成途径”可以指从丙酮酸产生异丁醇的酶途径。例如,异丁醇生物合成途径公开于美国专利7,851,188、美国专利申请公布2007/0092957和国际公布WO2007/050671中,它们以引用方式全文并入本文。有时“异丁醇生物合成途径”与“异丁醇生产途径”同义使用。
如本文所用,术语“丁醇”是指处于单独或其混合物形式的丁醇异构体1-丁醇(1-BuOH)、2-丁醇(2-BuOH)、叔丁醇(t-BuOH)和/或异丁醇(iBuOH或i-BuOH,也称为2-甲基-1-丙醇)。有时,如本文所用,术语“生物丁醇”可与“生物产生的丁醇”同义使用。
丁醇的用途可包括但不限于燃料(例如,生物燃料)、燃料添加剂、用于制备可被用作柴油或生物柴油燃料的酯的醇、塑料工业中的化学品、配制产品诸如化妆品中的成分以及化学中间体。丁醇还可被用作油漆、涂料、清漆、树脂、树胶、染料、脂肪、蜡类、树脂、紫胶、橡胶和生物碱的溶剂。
如本文所用,术语“生物产生的”是指由可再生源产生的分子(例如,丁醇)(例如,可在发酵过程中由可再生原料产生的分子)。因此,例如,生物产生的异丁醇可以为通过发酵过程由可再生原料产生的异丁醇。由可再生源产生的分子还可由14C/12C同位素比限定。在1∶0至大于0∶1范围内的14C/12C同位素比指示生物产生的分子,然而0∶1的比率指示分子是石化来源的。
如本文所用,“产物醇”是指在发酵过程中能够由微生物产生的任何醇,所述微生物利用生物质作为可发酵碳底物的来源。产物醇包括但不限于C1至C8烷基醇、以及它们的混合物。在一些实施例中,产物醇为C2至C8烷基醇。在其它实施例中,产物醇为C2至C5烷基醇。应当理解,C1至C8烷基醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、以及它们的混合物。同样地,C2至C8烷基醇包括但不限于乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。“醇”在本文中也用于指产物醇。
具有“工程化的醇生产途径”(诸如工程化的丁醇或异丁醇生产途径)的重组宿主细胞是指包含经修饰的途径的宿主细胞,该途径以与宿主细胞中通常存在的途径不同的方式生产醇。此类差异包括生产通常宿主细胞不生产的醇,或者提高产量或更有效地生产。
如本文所用,术语“异源生物合成途径”是指用于生产产物的酶途径,在其中酶中的至少一种不是对于包含该生物合成途径的宿主细胞而言内源性的。
如本文所用,术语“提取剂”是指能够用于提取产物醇的一种或多种有机溶剂。有时,如本文所用,术语“提取剂”可与“溶剂”同义使用。
如本文所用,术语“无水溶剂”是指从含水介质中先于水选择性地提取产物醇(例如异丁醇)的溶剂。以举例的方式,无水溶剂可先于水提取产物醇使得溶剂中的平衡水含量小于约0.05%。
如本文所用,术语“有效异丁醇产量”是指每克细胞产生的异丁醇总量,以克为单位。
如本文所用,术语“有效滴度”是指每升发酵培养基通过发酵产生的特定醇(例如丁醇)的总量。丁醇的总量包括:(i)发酵培养基中丁醇的量;(ii)从有机提取剂中回收的丁醇的量;和(iii)当采用汽提时从气相中回收的丁醇的量。
如本文所用,术语“有效产率”是指每升发酵培养基通过发酵每小时产生的丁醇总量。
如本文所用,术语“有效收率”是指生物催化剂消耗每单位可发酵碳底物产生的丁醇的量。
如本文所用,术语“分离”与“回收”同义,并且是指从初始混合物中去除化合物以获得纯度或浓度比初始混合物中的化合物的纯度或浓度更高的化合物。
如本文所用,术语“原位产物去除”(ISPR)是指在产物生成时从生物过程诸如发酵中选择性去除发酵产物以控制产物浓度。
如本文所用,术语“水相”是指通过使发酵液接触与水不混溶的有机提取剂而获得的两相混合物中的水相。在包括发酵提取的本文所述方法的实施例中,术语“发酵液”则具体地是指双相发酵提取中的水相,并且术语“贫溶剂相”可与“水相”和“发酵液”同义使用。
如本文所用,术语“有机相”是指通过使发酵液接触与水不混溶的有机提取剂而获得的双相混合物中的非水相。如本文所用,术语“富溶剂相”有时可与“有机相”同义使用。
如本文所用,术语“水相滴度”是指发酵液中产物醇(例如丁醇)的浓度。
如本文所用,术语“与水不混溶的”是指化学组分诸如提取剂或溶剂不能够以形成单一液相的形式与水性溶液诸如发酵液混合。
如本文所用,术语“含水量”是指无论产物醇例如异丁醇是否存在,溶剂所包含的水的平衡饱和度。有时,术语“平衡”与“含水量”一起使用以指示“含水量”与一组特定条件,例如温度、压力等相关。如将是显而易见的,含水量常常是指在给定一组特定条件下,可由溶剂/溶剂混合物溶解的最大水量。
如本文所用,术语“双相发酵培养基”是指包含发酵培养基(即水相)和适量不能与水混溶的有机提取剂的双相生长培养基。
术语“碳底物”或“可发酵的碳底物”是指能够被本发明的宿主生物体代谢的碳源,并且具体地讲选自:单糖、低聚糖、多糖、和单-碳底物或它们的混合物的碳源。本文提供了碳底物的非限制性示例,其包括但不限于单糖、二糖、低聚糖、多糖、乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、甘油、二氧化碳、甲醇、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、木糖、***糖、右旋糖、纤维素、甲烷、氨基酸、或它们的混合物。
如本文所用,“发酵液”是指水、糖(可发酵的碳源)、溶解的固体(当存在时)、产生醇的微生物、产物醇以及所有其它组分材料的混合物,其中产物醇通过由存在的微生物使糖反应生成醇、水和二氧化碳(CO2)而制备。有时,如本文所用,术语“发酵培养基”和“发酵混合物”可与“发酵液”同义使用。
如本文所用,“发酵罐”是指用于发酵底物的任何容器、多个容器或装置。发酵罐可包含发酵培养基和能够发酵的微生物。术语“发酵容器”是指在其中进行发酵反应,由此由糖制备醇诸如丁醇的容器。本文中“发酵罐”可与“发酵容器”互换使用。
术语“发酵产物”包括所关注的任何期望产物,包括但不限于1-丁醇、2-丁醇、异丁醇等。
如本文所用,术语“糖”指低聚糖、二糖、单糖、和/或它们的混合物。术语“糖类”还包括碳水化合物,包括淀粉、葡聚糖类、糖原、纤维素、戊聚糖、以及糖。
如本文所用,术语“可发酵的糖”是指能够被本文所公开的微生物代谢以产生发酵醇的一种或多种糖。
如本文所用,术语“不溶解的固体”是指原料的不可发酵部分,例如胚芽、纤维和谷蛋白。例如,原料的不可发酵的部分包括保持为固体并且可从发酵液吸收液体的原料的部分。
如本文所用,“生物质”是指包含可水解的淀粉的天然产物,其提供了可发酵的糖,包括任何纤维素或木质纤维素材料,以及包含纤维素的材料,并任选地还包括半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖、二糖、和/或单糖。生物质还可包含附加组分,诸如蛋白质和/或脂质。生物质能够来源于单一来源,或生物质可包括来源于多于一种来源的混合物。例如,生物质能够包括玉米棒和玉米秸秆的混合物,或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的示例包括但不限于:玉米粒、玉米棒、作物残余物诸如玉米皮、玉米秸秆、草、小麦、裸麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、获取自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及灌丛、蔬菜、水果、花、动物性杂肥、以及它们的混合物的研磨物的组分。
如本文所用,“原料”意为包含可发酵的碳源的产物。合适的原料包括但不限于裸麦、小麦、玉米、玉米醪、甘蔗、甘蔗醪、糖醪、大麦、纤维素材料、木质纤维素材料、以及它们的混合物。
如本文所用,术语“有氧条件”是指在氧气存在下的生长条件。
如本文所用,术语“微氧条件”是指具有低水平的氧气(即低于正常的大气氧气水平)的生长条件。
如本文所用,术语“厌氧条件”是指不存在氧气时的生长条件。
如本文所用,术语“基本培养基”是指包含能容许生长的最低限度的营养物质的生长培养基,而通常不含氨基酸。基本培养基典型地包含可发酵的碳源和多种可随微生物和生长条件的不同而不同的盐;这些盐通常提供了必需元素诸如镁、氮、磷和硫,从而允许微生物合成蛋白质和核酸。
如本文所用,术语“组合培养基”是指所有成分的量均已知的生长培养基,例如,微生物所需的碳源、氮源以及痕量元素和维生素均为确定的。
如本文所用,术语“生物相容性”是指在提取剂的存在下微生物利用葡萄糖的能力的量度。可生物相容的提取剂允许微生物利用葡萄糖。生物不相容的(即生物毒性的)提取剂不允许微生物利用葡萄糖,例如以比当该提取剂不存在时的速率高约25%的速率。
如本文所用,术语溶剂的“毒性”是指长期暴露于溶剂中,例如24小时之后,被杀死的产生醇的微生物的百分比。
如本文所用,术语“自由体积”是指不被溶剂分子占据的本体溶剂体积的比例。
如本文所用,术语“脂肪酸”是指具有C4至C28碳原子(最常见地为C12至C24碳原子)的羧酸(例如脂族一羧酸),其是饱和或不饱和的。脂肪酸还可以是支链的或非支链的。脂肪酸可以酯化的形式衍生自或包含于动物或植物的脂肪、油或蜡中。脂肪酸可以甘油酯形式在脂肪和脂肪油中天然存在,或可通过水解脂肪或通过合成获得。术语“脂肪酸”可描述单种化学物质或脂肪酸的混合物。此外,术语“脂肪酸”还可涵盖游离脂肪酸。
如本文所用,术语“脂肪醇”是指具有C4至C22碳原子的脂肪链的醇,其是饱和的或不饱和的。
如本文所用,术语“脂肪醛”是指具有C4至C22碳原子的脂肪链的醛,其是饱和的或不饱和的。
如本文所用,术语“脂肪酰胺”是指具有C4至C22碳原子的长脂肪链的酰胺,其是饱和的或不饱和的。
如本文所用,术语“脂肪酸酯”是指具有C4至C22碳原子的长脂肪链的酯,其是饱和的或不饱和的。
如本文所用,术语“羧酸”是指具有一般化学式-COOH的任何有机化合物,其中碳原子通过双键与氧原子键合形成羰基基团(-C=O),并且通过单键与羟基基团(-OH)键合。羧酸可为质子化羧酸的形式、羧酸盐形式(例如铵、钠盐、或钾盐)、或质子化羧酸与羧酸盐的混合物的形式。术语“羧酸”可描述单独的化学物质(例如油酸)或羧酸的混合物,其可通过例如水解生物质来源的脂肪酸酯或甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂产生。
如本文所用,术语“烃”是指包含氢和碳原子的分子。
如本文所用,术语“烷烃”是指饱和烃。
如本文所用,术语“烯烃”是指包含至少一个碳碳双键的不饱和烃。
如本文所用,术语“支链烷烃”是指具有烷基侧基团的烷烃。
如本文所用,术语“异十二烷”是指具有七个最长直链碳链的烷烃。“异十二烷”也可称为“五甲基庚烷”。
如本文所用,“部分”包括整体的一部分或该整体。例如,发酵液的一部分包括发酵液的部分以及全(或全部)发酵液。
“分配系数”是指化合物在两种不可混溶的溶剂的混合物的两相中平衡时的浓度的比率。分配系数是化合物在两种不可混溶的溶剂之间的不同溶解度的量度。如本文所用,分配系数与术语分布系数同义。
术语“基因”是指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段,其任选地包括编码序列前的调节序列(5′非编码序列)和编码序列后的调节序列(3′非编码序列)。“天然基因”是指天然存在的具有其自身的调控序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因,包含天然情况下不一起存在的调控序列和编码序列。因此,嵌合基因可包括源于不同来源的调节序列和编码序列,或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调节序列和编码序列。“内源性基因”是指在微生物基因组中处于其天然位置的天然基因。“外来基因”是指正常情况下不存在于宿主微生物中的基因,但通过基因转移引入宿主微生物内。外来基因可以包含***到非天然微生物体内的天然基因,或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法引入基因组内的基因。
如本文所用,“天然的”是指多核苷酸、基因或多肽的形式与天然存在的一样,带有其自身的调控序列(当存在时)。
如本文所用,术语“编码序列”或“编码区”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。
如本文所用,“内源性的”是指多核苷酸、基因或多肽在其在生物体中或生物体的基因组中的天然位置的天然形式。“内源性多核苷酸”包括在其在生物体的基因组中的天然位置的天然多核苷酸。“内源性基因”包括在其在生物体的基因组中的天然位置的天然基因。“内源性多肽”包括从位于生物体基因组内其天然位置的天然多肽或基因转录并翻译的、在生物体内位于其天然位置的天然多肽。
术语“异源性的”在用于提及多核苷酸、基因、或多肽时是指通常在宿主生物体中没有发现的多核苷酸、基因、或多肽。“异源性的”也包括原生的编码区域或其一部分,即以不同于对应的原生基因的形式重新引入源生物体,例如,不在所述生物体基因组中的原生位置中。异源性多核苷酸或基因能够通过例如基因转移的方式被引入宿主生物。异源性基因可包括具有被重新引入天然宿主的非天然调控区的天然编码区。例如,异源性基因可包括被重新引入天然宿主的天然编码区,其为包括非天然的调控区的嵌合基因的一部分。“异源性多肽”包括天然多肽,其以不同于对应的天然多肽的形式被重新引入源生物体。“异源性”多肽或多核苷酸还可包括工程化的多肽或多核苷酸,其包括“原生”多肽或多核苷酸的差异,例如内源性多核苷酸内的点突变可导致“异源性”多肽的产生。如本文所用,“嵌合基因”、“外来基因”和“转基因”全部均可以为“异源性”基因的示例。
“转基因”是已通过转化方法引入基因组的基因。
有机提取剂
可使用包括液-液提取在内的多种方法从发酵液中回收产物醇。在本文所述的方法和体系的一些实施例中,可使用提取剂以从发酵液中回收产物醇。本文所用的提取剂可以具有例如以下特性和/或特征中的一个或多个:(i)与微生物的生物相容性,(ii)与发酵培养基不可混溶,(iii)对于提取产物醇而言的高分配系数(Kd),(iv)对于提取营养物质和其它副产物而言的低分配系数,(v)低扩散系数,(vi)与水的高界面张力,(vii)低粘度(μ),(viii)与例如水相比时,对产物醇的高选择性,(ix)相对于发酵培养基的低密度(ρ),(x)适用于提取剂和产物醇的下游加工的沸点,(xi)小于环境温度的熔点,(xii)固体中的最小溶解度,(xiii)与发酵培养基形成乳液的低趋势,(xiv)发酵过程中的稳定性,(xv)低成本,(xvi)商业可用性,以及(xvii)无毒害。
在一些实施例中,可基于如上所述的某些特性和/或特征选择提取剂。例如,提取剂的粘度可影响体系的传质特性,即产物醇可从水相被提取至提取剂相(即有机相)的效率。提取剂的密度可影响相分离。在一些实施例中,在发酵过程的温度下提取剂可为液体。在一些实施例中,选择率是指提取剂所提取的产物醇对水的相对量。沸点能够影响成本和产物醇回收的方法。例如,在丁醇通过蒸馏而从提取剂相中被回收的情况下,提取剂的沸点应当充分地低,以在使提取剂的任何热降解或副反应、或在蒸馏过程中对真空的需求最小化的同时,能够使用可获得的蒸汽分离丁醇。
提取剂可为与微生物生物相容的,即,对微生物是无毒的,或者毒性仅至于这样的程度:微生物所受的损害为可接受的水平。在一些实施例中,生物相容性是指微生物在提取剂的存在下利用可发酵的碳源的能力的量度。提取剂的生物相容性的程度,可例如通过在提取剂和产物醇的存在下微生物的葡萄糖利用率来确定。在一些实施例中,非生物相容的提取剂是指妨碍微生物利用可发酵的碳源的能力的提取剂。例如,非生物相容的提取剂不允许微生物以一定速率利用葡萄糖,该速率大于当提取剂不存在时的速率的约25%,大于约30%,大于约35%,大于约40%,大于约45%,或大于约50%。
本领域技术人员可选择提取剂以使如上所述的期望特性和/或特征最大化并优化产物醇的回收。本领域技术人员还可理解,使用提取剂的混合物可能是有利的。例如,可使用提取剂混合物来提高产物醇的分配系数。此外,可使用提取剂混合物来调整或优化提取剂的物理特性,诸如密度、沸点和粘度。例如,适当的组合可提供以下提取剂,该提取剂具有对产物醇的足够的亲和力(对于丁醇的Kd)、疏水性(logP)、足够的生物相容性以使其能够经济地用于从发酵液中回收产物醇(表达为logP的疏水性可指示生物相容性),含水量(增溶水的趋势)以及足够的选择性以能够先于例如水选择性去除产物醇。
在一些实施例中,可用于本文所述的方法和体系的提取剂可为有机溶剂。在一些实施例中,可用于本文所述的方法和体系的提取剂可为无水溶剂。无水溶剂可例如由于吸引丁醇并对水提供较少亲和力或不提供亲和力而是有利的。不对水提供氢键合的无水溶剂例如可选择性地吸收醇。在一些实施例中,无水溶剂可包含C7至C22烃。在一些实施例中,无水溶剂可包含C7至C22烷烃或它们的混合物。在一些实施例中,无水溶剂可包含C7至C22烷烃或它们的混合物。C7至C22烷烃或烯烃可例如为支链的烷烃或烯烃(例如,烷烃或烯烃可包含烷基侧基团,诸如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基侧基团)。在一些实施例中,烃可为异丁醇的衍生物。异丁醇的衍生物可例如选自三异丁烯、异十二烷、二异丁烯、四异丁烯、异辛烷、3,4,5,6,6-五甲基-2-庚醇、或异十二烷。
无水溶剂的另一个优点是较低的粘度、较高的界面张力以及较高的热稳定性和化学稳定性,其有助于相分离和长期再利用。在一些实施例中,适应丁醇的烷基部分的无水溶剂可与以氢键合形式提供例如对丁醇的羟基部分的亲和力的另一种提取剂合并,使得所述混合物提供选择性和先于水的分配之间的最佳平衡。饱和烷烃的优点包括高界面张力、较高的热稳定性和化学稳定性、良好的生物相容性、较低的熔点、较低的沸点、低密度、低粘度、以及形成乳液的低趋势。另一个优点与较高分配系数相关,不希望受理论的束缚,一些示例指示具有氢键合特性和/或高自由体积的溶剂具有高丁醇分配系数(Kd)。增加的氢键合特性可通过每分子具有较大氢键合位点数来实现。在一些实施例中,使用包含氮、氧、磷和硫的化合物以提供氢键合位点。有机相中的自由体积可使用其分子具有高支化度且不紧密压实的溶剂来实现。
在一些实施例中,有机提取剂组合物还包含第二溶剂。该第二溶剂可例如为选自下列的有机溶剂:饱和的、单不饱和的、多不饱和的、支链的(以及它们的混合物)C12至C22脂肪醇、C12至C22脂肪酸、C12至C22脂肪酸的酯、C12至C22脂肪醛、C12至C22脂肪酰胺、C7至C22醚、以及它们的混合物。第二溶剂还可为选自下列的有机溶剂:饱和的、单不饱和的、多不饱和的、支链的(以及它们的混合物)C4至C22脂肪醇、C4至C28脂肪酸、C4至C28脂肪酸的酯、C4至C22脂肪醛以及它们的混合物。在一些实施例中,提取剂可包含第一无水溶剂和选自下列的第二溶剂:C12至C22脂肪醇、C12至C22脂肪酸、C12至C22脂肪酸的酯、C12至C22脂肪醛、C12至C22脂肪酰胺、C7至C22醚、C7至C11脂肪醇、C7至C11脂肪酸、C7至C11脂肪酸的酯、C7至C11脂肪醛、以及它们的混合物。在一些实施例中,第二溶剂可为羧酸。在一些实施例中,第二溶剂可为有机溶剂,诸如油醇、苯基醇、二十二烷醇(二十二醇)、鲸蜡醇、月桂醇(也称为1-十二烷醇)、肉豆蔻醇、硬脂醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、辛酸、癸酸、十一烷酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、1-壬醇、1-癸醇、2-十一醇、1-壬醛、1-十一烷醇、十一烷醛、异十二烷醇、月桂醛、2-甲基十一醛、油酰胺、亚油酰胺、棕榈酸酰胺、硬脂酰胺、2-乙基-1-己醇、2-己基-1-癸醇、2-辛基-1-十二烷醇、或它们的混合物。其它示例包括但不限于磷酸酯、膦、次膦酸酯、酰胺、烷基苯酚、水杨酸酯、以及对羟基苯甲酸酯。
在一些实施例中,提取剂可为生物相容的提取剂和非生物相容的提取剂的混合物。生物相容性的提取剂和非生物相容性的提取剂的混合物的示例包括但不限于异十二烷和2-乙基-1-己醇、异十二烷和丁基辛醇、异十二烷和壬醇、异十二烷和1-十一醇、异十二烷和2-十一醇、异十二烷和1-壬醛、异十二烷和癸醇、异十二烷和十二烷醇、油醇和壬醇、油醇和1-十一醇、油醇和2-十一醇、油醇和1-壬醛、油醇和癸醇、以及油醇和十二烷醇。生物相容性的提取剂和非生物相容性的提取剂的另外的示例描述于美国专利申请公布2009/0305370和美国专利申请公布2011/0097773中,它们每个均全文以引用方式并入本文。在一些实施例中,生物相容性的提取剂可具有高大气沸点。例如,生物相容性的提取剂可具有大于水的大气沸点的大气沸点。
在一些实施例中,可将亲水性溶质添加到与提取剂接触的发酵液中。亲水性溶质在含水发酵液相中的存在可改善相分离并可增加分配到有机提取剂相中的产物醇的分数。亲水性溶质的示例可包括但不限于多羟基化合物、多元羧酸化合物、多元醇化合物以及游离的离子盐。糖诸如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和低聚糖可用作亲水性溶质。其它多羟基化合物可包括甘油、乙二醇、丙二醇、聚甘油以及羟基化富勒烯。多元羧酸化合物可包括柠檬酸、酒石酸、马来酸、琥珀酸、聚丙烯酸以及它们的钠盐、钾盐、铵盐。可用作发酵液中的亲水性溶质的离子盐包含含有钠、钾、铵、镁、钙、锌的阳离子和含有硫酸根、磷酸根、氯离子、硝酸根的阴离子。本领域技术人员可选择发酵液中亲水性溶质的含量以使产物醇转移到发酵液相之外并且转移到接触有机提取剂相中的转移最大化,同时不会不利地影响产生产物醇的微生物的生长和/或产量。高含量的亲水性溶质可向发酵液中的微生物赋予渗透压和/或毒性。本领域技术人员可使用任意种已知的方法来确定亲水性溶质的最佳含量以使渗透压和/或毒性对微生物的影响最小化。
在一些实施例中,在提取剂与发酵液接触并与发酵液分离之后,可使疏水性溶质与提取剂接触,如将在下文标题为“样品溶剂混合物制备和提取的讨论”中进一步详细描述的。诸如这些的实施例可被认为是两步法,因为进行了两次不同的提取。
在一些实施例中,提取剂可包含芳族化合物。在一些实施例中,提取剂可包含烷基取代的苯,包括但不限于,异丙基苯、对甲基异丙基苯、间甲基异丙基苯、间二异丙基苯、对二异丙基苯、三异丙基苯、三仲丁基苯、三乙基苯、乙基丁基苯、叔丁基苯乙烯。使用烷基取代的苯的优点是相对于大多数其它烃的相对更高的丁醇亲和力。此外,异丙基或仲丁基或异丁基取代的苯可提供超过其它取代的苯在丁醇亲和力方面的特定优点。另一个优点是较低的粘度、较高的界面张力和较低的密度以及较高的热稳定性和化学稳定性,其有助于相分离和长期再利用。
在根据本公开的实施例中,使用溶剂混合物以从水性溶液诸如发酵液中提取醇诸如丁醇或其它杂醇。例如,溶剂混合物包含一种或多种溶剂,诸如第一溶剂和第二溶剂。可选择第一溶剂和第二溶剂,以及任何附加的溶剂以定制溶剂混合物的特性,但包含在溶剂混合物中的溶剂表现不理想。在示例中,当选择待合并的溶剂时,考虑特性诸如疏水性、含水量、醇亲和力、对微生物的毒性。在具体实施中,溶剂混合物可表现出不由单种溶剂的特性(例如,疏水性、含水量、醇亲和力、毒性)以及溶剂混合物中的单种溶剂的摩尔分数所表示的特性。例如,合并具有高疏水性的第一溶剂与第二溶剂(即相比于第一溶剂较不疏水的)可产生表现出超过基于第一溶剂的特性和在溶剂混合物中的摩尔分数以及第二溶剂的特性及在溶剂混合物中的其(第二溶剂的)摩尔分数对所述溶剂混合物所预期的协同醇提取能力。例如,玉米油脂肪酸(COFA)和异十二烷的溶剂混合物表现出比基于COFA和异十二烷的单独基础特性所预期的更低的平衡含水量。在诸如该实施例的实施例中,使包含醇的水性溶液与溶剂混合物接触以将醇提取到溶剂混合物中。
无水溶剂的蒸馏
可将包含丁醇(例如异丁醇)和水的提取剂汽提以形成贫丁醇的提取剂。在该三元体系中,可能不存在先于水选择性汽提丁醇的方法,因为两种组分形成被称为最低沸点共沸物的物质。因此,与汽提提取剂相关联的最小能量将包括蒸发丁醇的潜热连同共沸水蒸汽的潜热。因为以质量计,水蒸汽的潜热大于(例如,几乎多达4倍)丁醇的潜热,所以水共沸可导致从提取剂中去除丁醇所需的增加的能量。在汽提提取剂时产生的过热蒸汽可因此包含丁醇与水的混合物并可能需要冷凝、滗析和进一步蒸馏以分离适用于生物燃料应用的纯化的丁醇产物。在无水提取剂的情况下,含水量显著减小,从而对去除丁醇所需要的总汽提能量作出贡献的共沸能量也显著减小。另外,由从无水提取剂中汽提丁醇产生的过热蒸汽可在冷凝时形成丁醇产物,其具有在用于生物燃料应用的一些指定范围内的水含量,并且在所述情况下,可能不需要料流的进一步蒸馏。
在一些实施例中,包含丁醇的提取剂可与发酵液相分离并且在真空下在蒸馏柱操作中蒸馏。该蒸馏可在回流下操作,以便保持包含极少提取剂的高纯度丁醇的馏出物。底物可包含蒸馏进料中所包含的丁醇的一部分,使得真空下的再沸温度适用于从可用蒸汽间接递送热。蒸馏可用部分冷凝器进行,其中仅将回流液体冷凝,并且可将基本上丁醇组合物的蒸汽馏出物引导到精馏柱的底部中,所述精馏柱同时被供入从蒸汽顶部的冷凝啤酒柱塔顶部蒸汽滗出的丁醇料流。该类型蒸馏的优点在于通过热整合由将丁醇汽提出提取剂而产生的蒸汽,来消除对于纯化滗出丁醇料流的再沸器的需要。
异丁醇至异十二烷的转化
在一些实施例中,可利用产生的高纯度丁醇(例如异丁醇)的料流来制备异丁醇的衍生物。异丁醇的衍生物可例如为三异丁烯或异十二烷。可在蒸馏到容器中之后获取高纯度丁醇的料流。在容器中,可将异丁醇催化转化成三异丁烯和/或异十二烷。
可如图8所示将异丁醇转化成三异丁烯和/或异十二烷。图8示出用于将异丁醇转化成主要包含2,2,4,6,6-五甲基庚烷的更高级烷烃的典型的工艺配置。将异丁醇预热并经由料流1供入反应容器中,所述反应容器包含2.5%对甲苯磺酸并在160℃和50psig下操作。产生蒸汽流,并且向上通过精馏柱,然后在35℃和45psig下被部分冷凝并滗出到两个液相中。上层相为包含大部分异丁烯的有机物并在回流时返回到蒸馏柱的顶部,同时将下部水相作为料流2去除。未冷凝的蒸汽释放压力穿过阀并通过蒸汽交换器重新加热以形成异丁烯蒸汽流3,所述流被供入管式低聚反应器中,所述反应器装有为0.5mm珠形式的Amberlyst-15催化剂,在100℃和近大气压下操作。在1g异丁烯/g催化剂/小时的重时空速下,8.6%的异丁烯被转化成二异丁烯,81.6%的异丁烯被转化成三异丁烯,并且5.8%的异丁烯被转化成四异丁烯,同时4%的异丁烯保持未转化。在转筒中将反应器流出物料流4闪蒸以安全地排出未反应的异丁烯,并且经由料流5将异丁烯低聚物的混合异构体连同过量的源自气瓶储存的氢气流6的进料一起泵入滴流床反应器。烯烃的转化是定量的,并且氢化反应器流出物料流7在滚筒中闪蒸以安全地排出未反应的氢气并产生主要包含2,2,4,6,6-五甲基庚烷的液体产物流8。将异丁醇转化成三异丁烯和异十二烷(2,2,4,6,6-五甲基庚烷)的步骤是本领域已知的,参见例如Alcantara等人,ReactiveFunct.Polymers45:19-27(2000);Ludwig等人,J.Catalysis284:148-56(2011);以及美国专利5,625,109。
重组微生物
虽然不希望受理论的束缚,但据信本文所述的方法可结合任何产生醇的微生物来使用,具体地讲产生醇的重组微生物。
产生醇的重组微生物也是本领域已知的(例如,Ohta等人,Appl.Environ.Microbiol.57:893-900(1991);Underwood等人,Appl.Envrion.Microbiol.68:1071-81(2002);Shen和Liao,Metab.Eng.10:312-20(2008);Hahnai等人,Appl.Environ.73:7814-8(2007);美国专利5,514,583;美国专利5,712,133;国际公布WO1995/028476;Feldmann等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:354-61(1992);Zhang等人,Science267:240-3(1995);美国专利公布2007/0031918A1;美国专利7,223,575;美国专利7,741,119;美国专利公布2009/0203099A1;美国专利公布2009/0246846A1;以及国际公布WO2010/075241,所述文献以引用方式并入本文)。
例如,微生物的代谢途径可经基因修饰以产生丁醇。这些途径也可经修饰以减少或消除不期望的代谢物,从而改善产物醇的收率。由微生物产生丁醇公开于例如美国专利7,851,188;7,993,889;8,178,328、8,206,970;美国专利公布2007/0292927;2008/0182308;2008/0274525;2009/0305363;2009/0305370;2011/0250610;2011/0313206;2011/0111472;2012/0258873;以及美国专利申请13/428,585中,每个专利均全文以引用方式并入本文。在一些实施例中,微生物包含丁醇生物合成途径或丁醇异构体诸如1-丁醇、2-丁醇或异丁醇的生物合成途径。在一些实施例中,生物合成途径将丙酮酸转化成发酵产物。在一些实施例中,生物合成途径将丙酮酸以及氨基酸转化成发酵产物。在一些实施例中,微生物中的异源性多核苷酸编码至少一个、至少两个、至少三个、或至少四个多肽,该多肽催化途径中底物至产物的转化。在一些实施例中,微生物中的异源性多核苷酸编码所有多肽,它们催化途径中底物至产物的转化。
在一些实施例中,微生物可为细菌、蓝细菌、丝状真菌、或酵母。能够经由生物合成途径产生产物醇(例如丁醇)的合适的微生物包括下列属中的成员:梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Lactobacillus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、酵母菌(Kluveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属(Candida)、酒香酵母属(Brettanomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、汉逊酵母属(Hansenula)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、毛孢子菌属(Trichosporon)、Yamadazyma或酵母属(Saccharomyces)。在一个实施例中,重组微生物可选自大肠杆菌(Escherichiacoli)、真养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)、地衣芽孢杆菌属(Bacilluslichenifonnis)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillusmacerans)、红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarium)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、萨纳瑞西斯假丝酵母(Candidasonorensis)、methanosorbosa假丝酵母(Candidamethanosorbosa)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromycesthermotolerans)、东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。在一个实施例中,经基因修饰的微生物为酵母。在一个实施例中,经基因修饰的微生物为克拉布特里阳性酵母,其选自酵母属(Saccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、德克酵母属(Dekkera)、球拟酵母属(Torulopsis)、酒香酵母属(Brettanomyces)、以及假丝酵母属(Candida)的一些菌种。克拉布特里阳性酵母的菌种包括但不限于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、克鲁维酵母(Saccharomyceskluyveri)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、贝酵母(Saccharomycesbayanus)、mikitae酵母(Saccharomycesmikitae)、奇异酵母(Saccharomycesparadoxus)、葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)、芽殖酵母(Saccharomycescastelli)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomycesbailli)和光滑假丝酵母(Candidaglabrata)。
在一些实施例中,宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)为本领域所已知并可购自多种来源,包括但不限于美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MD)、CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS)真菌生物多样性中心、LeSaffre、GertStrandAB、FermSolutions、NorthAmericanBioproducts、Martrex和Lallemand。酿酒酵母(S.cerevisiae)包括但不限于BY4741、CEN.PK113-7D、Ethanol酵母、FermProTM酵母、XR酵母、GertStrandPrestigeBatchTurboalcohol酵母、GertStrandPotDistillers酵母、GertStrandDistillersTurbo酵母、FerMaxTMGreen酵母、FerMaxTMGold酵母、酵母、BG-1、PE-2、CAT-1、CBS7959、CBS7960和CBS7961。
在一些实施例中,微生物可被固定或封装。例如,微生物可使用藻酸酯、藻酸钙或聚丙烯酰胺凝胶来固定或封装,或通过在多种高表面积载体基质诸如硅藻土(diatomite)、硅藻土(celite)、硅藻土(diatomaceousearth)、硅胶、塑料或树脂上诱导生物膜形成来固定或封装。在一些实施例中,ISPR可与固定的或封装的微生物组合使用。该组合可提高生产能力诸如比体积生产能力、代谢率、产物醇收率、产物醇耐受性。此外,固定和封装可使工艺条件诸如剪切对微生物的影响最小化。
用于生产可使用的异丁醇的生物合成途径可包括由Donaldson等人在美国专利7,851,188;美国专利7,993,388;和国际公布WO2007/050671中所述的那些,它们以引用的方式并入本文。在一个实施例中,异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化:
a)丙酮酸至乙酰乳酸,其可被例如乙酰乳酸合酶催化;
b)来自步骤a)的乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸,其可被例如乙酰羟酸还原异构酶催化;
c)来自步骤b)的2,3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸,其可被例如乙酰羟酸脱水酶催化;
d)来自步骤c)的α-酮异戊酸至异丁醛,其可被例如支链α-酮酸脱羧酶催化;以及
e)来自步骤d)的异丁醛至异丁醇,其可被例如支链醇脱氢酶催化。
在另一个实施例中,异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化:
a)丙酮酸至乙酰乳酸,其可被例如乙酰乳酸合酶催化;
b)来自步骤a)的乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸,其可被例如酮醇酸还原异构酶催化;
c)来自步骤b)的2,3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸,其可被例如二羟酸脱水酶催化;
d)来自步骤c)的α-酮异戊酸至缬氨酸,其可被例如转氨酶或缬氨酸脱氢酶催化;
e)来自步骤d)的缬氨酸至异丁胺,其可被例如缬氨酸脱羧酶催化;
f)来自步骤e)的异丁胺至异丁醛,其可被例如ω转氨酶催化;以及
g)来自步骤f)的异丁醛至异丁醇,其可被例如支链醇脱氢酶催化。
在另一个实施例中,异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化:
a)丙酮酸至乙酰乳酸,其可被例如乙酰乳酸合酶催化;
b)来自步骤a)的乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸,其可被例如乙酰羟酸还原异构酶催化;
c)来自步骤b)的2,3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸,其可被例如乙酰羟酸脱水酶催化;
d)来自步骤c)的α-酮异戊酸至异丁酰-CoA,其可被例如支链酮酸脱氢酶催化;
e)来自步骤d)的异丁酰-CoA至异丁醛,其可被例如酰化乙醛脱氢酶催化;以及
f)来自步骤e)的异丁醛至异丁醇,其可被例如支链醇脱氢酶催化。
用于生产可使用的1-丁醇的生物合成途径包括在美国专利申请公布2008/0182308和WO2007/041269中所述的那些,所述文献以引用的方式并入本文。在一个实施例中,1-丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化:
a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA,其可被例如乙酰-CoA乙酰转移酶催化;
b)来自步骤a)的乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酸-CoA,其可被例如3-羟丁酸-CoA脱氢酶催化;
c)来自步骤b)的3-羟丁酸-CoA至巴豆酰-CoA,其可被例如巴豆酸酶催化;
d)来自步骤c)的巴豆酰-CoA至丁酰-CoA,其可被例如丁酰-CoA脱氢酶催化;
e)来自步骤d)的丁酰-CoA至丁醛,其可被例如丁醛脱氢酶催化;以及
f)来自步骤e)的丁醛至1-丁醇,其可被例如丁醇脱氢酶催化。
用于生产可使用的2-丁醇的生物合成途径包括由Donaldson等人在美国专利8,206,970;美国专利申请公布2007/0292927和2009/0155870;国际公布WO2007/130518和WO2007/130521中所述的那些,所述专利文献全部以引用方式并入本文。在一个实施例中,2-丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化:
a)丙酮酸至α-乙酰乳酸的转化,其可被例如乙酰乳酸合酶催化;
b)来自步骤a)的α-乙酰乳酸至乙偶姻,其可被例如乙酰乳酸脱羧酶催化;
c)来自步骤b)乙偶姻至3-氨基-2-丁醇,其可被例如乙偶姻胺化酶催化;
d)来自步骤c)的3-氨基-2-丁醇至3-氨基-2-丁醇磷酸,其可被例如氨基丁醇激酶催化;
e)来自步骤d)的3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮,其可被例如氨基丁醇磷酸磷酸化酶催化;以及
f)来自步骤e)的2-丁酮至2-丁醇,其可被例如丁醇脱氢酶催化。
在另一个实施例中,2-丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转化:
a)丙酮酸至α-乙酰乳酸,其可被例如乙酰乳酸合酶催化;
b)来自步骤a)的α-乙酰乳酸至乙偶姻,其可被例如乙酰乳酸脱羧酶催化;
c)来自步骤b)的乙偶姻至2,3-丁二醇,其可被例如丁二醇脱氢酶催化;
d)来自步骤c)的2,3-丁二醇至2-丁酮,其可被例如丁二醇脱水酶催化;以及
e)来自步骤d)的2-丁酮至2-丁醇,其可被例如丁醇脱氢酶催化。
用于生产可使用的2-丁酮的生物合成途径包括在美国专利8,206,970和美国专利申请公布2007/0292927和2009/0155870中描述的那些,它们以引用的方式并入本文。在一个实施例中,2-丁酮生物合成途径包括下列底物至产物的转化:
a)丙酮酸至α-乙酰乳酸,其可被例如乙酰乳酸合酶催化;
b)来自步骤a)的α-乙酰乳酸至乙偶姻,其可被例如乙酰乳酸脱羧酶催化;
c)来自步骤b)乙偶姻至3-氨基-2-丁醇,其可被例如乙偶姻胺化酶催化;
d)来自步骤c)的3-氨基-2-丁醇至3-氨基-2-丁醇磷酸的转化,其可被例如氨基丁醇激酶催化;以及
e)来自步骤d)的3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮,其可被例如氨基丁醇磷酸磷酸化酶催化。
在另一个实施例中,2-丁酮生物合成途径包括下列底物至产物的转化:
a)丙酮酸至α-乙酰乳酸,其可被例如乙酰乳酸合酶催化;
b)来自步骤a)的α-乙酰乳酸至乙偶姻,其可被例如乙酰乳酸脱羧酶催化;
c)来自步骤b)的乙偶姻至2,3-丁二醇,其可被例如丁二醇脱氢酶催化;
d)来自步骤c)的2,3-丁二醇至2-丁酮,其可被例如二醇脱水酶催化。
术语“乙酰羟酸合酶”、“乙酰乳酸合酶”和“乙酰乳酸合成酶”(缩写为“ALS”)本文互换使用,是指催化丙酮酸转化成乙酰乳酸和CO2的酶。已知乙酰乳酸合酶的示例为EC编号2.2.1.6(EnzymeNomenclature1992,AcademicPress,SanDiego)。这些酶可得自多种来源,包括但不限于:枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(基因库编号(GenBankNo):CAB07802.1,Z99122,分别是NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)氨基酸序列、NCBI核苷酸序列)、CAB15618、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)(基因库编号:AAA25079,M73842)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)(基因库编号:AAA25161,L16975)
术语“酮醇酸还原异构酶”(“KARI”)、“乙酰羟酸异构还原酶”和“乙酰羟酸还原异构酶”将互换使用并且是指能够催化(S)-乙酰乳酸转化成2,3-二羟基异戊酸的反应的酶。KARI酶的示例可归类为EC编号EC1.1.1.86(EnzymeNomenclature1992,AcademicPress,SanDiego),并且得自多种微生物,包括但不限于大肠杆菌(Escherichiacoli)(基因库编号:NP_418222,NC_000913)、酿酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)(基因库编号:NP_013459,NC_001144)、海沼甲烷球菌(Methanococcusmaripaludis)(基因库编号:CAF30210,BX957220)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(基因库编号:CAB14789,Z99118)以及Anaerostipescaccae。酮醇酸还原异构酶(KARI)描述于美国专利7,910,342和8,129,162;美国专利申请公布2008/0261230、2009/0163376、2010/0197519、PCT申请公布WO/2011/041415、PCT申请公布WO2012/129555;以及2012年9月26日提交的美国临时申请61/705,977中,其全部以引用方式并入本文。本文所公开的KARI的示例是来源于乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、霍乱弧菌(Vibriocholera)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PAO1和荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)PF5突变体的那些。在一些实施例中,KARI利用NADH。在一些实施例中,KARI利用NADPH。在一些实施例中,KARI利用NADH或NADPH。
术语“乙酰羟酸脱水酶”和“二羟基酸脱水酶”(“DHAD”)是指催化2,3-二羟基异戊酸转化成α-酮异戊酸的酶。已知乙酰羟酸脱水酶的示例为EC编号4.2.1.9。此类酶可得自多种微生物,包括但不限于大肠杆菌(E.coli)(基因库编号:YP_026248,NC000913)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(基因库编号:NP_012550,NC001142)、海沼甲烷球菌(M.maripaludis)(基因库编号:CAF29874,BX957219)、枯草芽孢杆菌(基因库编号:CAB14105,Z99115)、乳酸乳球菌(L.lactis)和粗糙脉孢菌(N.crassa)。美国专利申请公布2010/0081154、美国专利7,851,188和美国专利8,241,878(上述文献全文以引用的方式并入本文)描述了二羟酸脱水酶(DHAD),包括来自变异链球菌(Streptococcusmutans)的DHAD及其变异体。
术语“支链α-酮酸脱羧酶”、“α-酮酸脱羧酶”、“α-酮异戊酸脱羧酶”或“2-酮异戊酸脱羧酶”(“KIVD”)是指催化α-酮异戊酸转化成异丁醛和CO2的酶。已知支链α-酮酸脱羧酶的示例为EC编号4.1.1.72,并且得自多种来源,包括但不限于乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)(基因库编号:AAS49166,AY548760,CAG34226,AJ746364)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)(基因库编号:NP_461346,NC_003197),丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)(基因库编号:NP_149189,NC_001988),溶酪大球菌(M.caseolyticus)和格雷氏李斯特菌(L.grayis)。
术语“支链醇脱氢酶”(“ADH”)是指催化异丁醛转化成异丁醇的酶。已知支链醇脱氢酶的示例是EC编号1.1.1.265的酶,但是所述酶也可被归类为其它醇脱氢酶(具体地讲,EC1.1.1.1或1.1.1.2)。醇脱氢酶可为NADPH依赖型或NADH依赖型。这些酶可得自多种来源,包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)(基因库编号:NP_010656,NC_001136,NP_014051,NC_001145)、大肠杆菌(基因库编号:NP_417484,NC_000913),丙酮丁醇梭菌(基因库编号:NP_349892,NC_003030,NP_349891,NC_003030)。美国专利申请公布2009/0269823描述了来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)的醇脱氢酶(ADH)SadB。醇脱氢酶还可包括马肝脏ADH和印度拜耶林克氏菌(Beijerinkiaindica)ADH,如美国专利申请公布2011/0269199所述,该文献全文以引用方式并入本文。
术语“丁醇脱氢酶”是指多肽(或多种多肽),其具有催化异丁醛转化成异丁醇或催化2-丁酮和2-丁醇的转化的酶活性。丁醇脱氢酶是醇脱氢酶大家族中的一个子集。丁醇脱氢酶可为NAD依赖型或NADP依赖型。已知NAD依赖型酶为EC1.1.1.1并且可得自例如赤红球菌(Rhodococcusruber)(基因库编号:CAD36475,AJ491307)。已知NADP依赖型酶为EC1.1.1.2并且可得自例如强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)(基因库编号:AAC25556,AF013169)。另外,丁醇脱氢酶得自大肠杆菌(Escherichiacoli)(基因库编号:NP417484,NC_000913),并且环己醇脱氢酶可得自不动杆菌属(Acinetobactersp.)(基因库编号:AAG10026,AF282240)。术语“丁醇脱氢酶”也指催化丁醛转化成1-丁醇的酶,其使用NADH或NADPH作为辅因子。丁醇脱氢酶得自例如丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(基因库编号:NP_149325,NC_001988;注意:这种酶同时具有醛脱氢酶和醇脱氢酶活性);NP_349891,NC_003030;以及NP_349892,NC_003030)和大肠杆菌(E.coli)(基因库编号:NP_417-484,NC_000913)。
术语“支链酮酸脱氢酶”是指催化α-酮异戊酸转化为异丁酰-CoA(异丁酰-辅酶A)的酶,通常使用NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作为电子受体。已知支链酮酸脱氢酶的示例为EC编号1.2.4.4。此类支链酮酸脱氢酶由四个亚基构成,并且来自所有亚基的序列可得自多种微生物,包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(基因库编号:CAB14336,Z99116;CAB14335,Z99116;CAB14334,Z99116;以及CAB14337,Z99116)和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)(基因库编号:AAA65614,M57613;AAA65615,M57613;AAA65617,M57613;以及AAA65618,M57613)。
术语“酰化乙醛脱氢酶”是指催化异丁酰-CoA转化成异丁醛的酶,其通常使用NADH或NADPH作为电子供体。已知乙酰化醛脱氢酶的示例为EC编号1.2.1.10和1.2.1.57。此类酶得自多种来源,包括但不限于拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)(基因库编号:AAD31841、AF157306)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(基因库编号:NP_149325,NC_001988;NP_149199,NC_001988)、恶臭假单胞菌(P.putida)(基因库编号:AAA89106,U13232)、和嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)(基因库编号:YP_145486,NC_006461)。
术语“转氨酶”是指催化α-酮异戊酸转化成L-缬氨酸的酶,其使用丙氨酸或谷氨酸作为胺供体。已知转氨酶的示例为EC编号2.6.1.42和2.6.1.66。这些酶可得自多个来源。依赖丙氨酸的酶的来源的示例包括但不限于大肠杆菌(E.coli)(基因库编号:YP_026231,NC_000913)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(基因库编号:YP_093743,NC_006322)。依赖谷氨酸的酶的来源的示例包括但不限于大肠杆菌(E.coli)(基因库编号:YP_026247,NC_000913)、酿酒酵母(Saccharomyecescerevisiae)(基因库编号:NP_012682,NC_001142)和嗜热碱甲烷杆菌(methanobacteriumthermoautotrophicum)(基因库编号:NP_276546,NC_000916)。
术语“缬氨酸脱氢酶”是指催化α-酮异戊酸转化成L-缬氨酸的酶,其通常使用NAD(P)H作为电子供体并使用氨作为胺供体。已知缬氨酸脱氢酶的示例为EC编号1.4.1.8和1.4.1.9并且此类酶可得自多个来源,包括但不限于天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)(基因库编号:NP_628270,NC_003888)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(基因库编号:CAB14339、Z99116)。
术语“缬氨酸脱羧酶”是指催化L-缬氨酸转化成异丁胺和CO2的酶。已知缬氨酸脱羧酶的示例为EC编号4.1.1.14。此类酶存在于链霉菌属(Streptomyces)中,诸如例如生绿链霉菌(Streptomycesviridifaciens)(基因库编号:AAN10242、AY116644)。
术语“ω转氨酶”是指催化异丁胺转化成异丁醛的酶,其使用合适的氨基酸作为胺供体。已知ω转氨酶的示例为EC编号2.6.1.18,并且得自许多来源,包括但不限于反硝化产碱菌(Alcaligenesdenitrificans)(AAP92672,AY330220)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)(基因库编号:YP_294474,NC_007347)、沙雷菌(Shewanellaoneidensis)(基因库编号:NP_719046,NC_004347)和恶臭假单胞菌(P.putida)(基因库编号:AAN66223,AE016776)。
术语“乙酰-CoA乙酰转移酶”是指催化两分子乙酰-CoA转化成乙酰乙酰-CoA和辅酶A(CoA)的酶。示例性乙酰-CoA乙酰转移酶是具有对短链酰基-CoA和乙酰-CoA的底物偏好(在正向上反应)的乙酰-CoA乙酰转移酶,并且该酶归类为E.C.2.3.1.9[EnzymeNomenclature1992,AcademicPress,SanDiego];但具有更宽底物范围的酶(E.C.2.3.1.16)也将具有功能。乙酰-CoA乙酰转移酶得自多种来源,例如,大肠杆菌(Escherichiacoli)(基因库编号:NP_416728,NC_000913;NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)氨基酸序列,NCBI核苷酸序列)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)(基因库编号:NP_349476.1,NC_003030,NP_149242和NC_001988)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(基因库编号:NP_390297,NC_000964)、和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(基因库编号:NP_015297,NC_001148)。
术语“3-羟丁酰-CoA脱氢酶”是指催化乙酰乙酰-CoA转化成3-羟丁酰-CoA的酶。3-羟丁酰-CoA脱氢酶的示例可为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)-依赖型的、具有对(S)-3-羟丁酰-CoA或(R)-3-羟丁酰-CoA的底物偏好的酶。示例可分别归类为E.C.1.1.1.35和E.C.1.1.1.30。另外,3-羟丁酰-CoA脱氢酶可为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)-依赖型的、具有对(S)-3-羟丁酰-CoA或(R)-3-羟丁酰-CoA的底物偏好的酶,并且其可分别归类为E.C.1.1.1.157和E.C.1.1.1.36。3-羟丁酰-CoA脱氢酶得自多种来源,例如丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(基因库编号:NP_349314,NC_003030)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(基因库编号:AAB09614,U29084)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)(基因库编号:YP_294481,NC_007347)和真养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)(基因库编号:AAA21973,J04987)。
术语“巴豆酸酶”是指催化3-羟丁酰-CoA转化成巴豆酰-CoA和H2O的酶。示例性巴豆酸酶可具有对(S)-3-羟丁酰-CoA或(R)-3-羟丁酰-CoA的底物偏好性,并且分别被分类为E.C.4.2.1.17和E.C.4.2.1.55。巴豆酸酶得自多种来源,例如,大肠杆菌(E.coli)(基因库编号:NP_415911,NC_000913),丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(基因库编号:NP_349318,NC_003030)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(基因库编号:CAB13705,Z99113)、和豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)(基因库编号:BAA21816,D88825)。
术语“丁酰-CoA脱氢酶”是指催化巴豆酰-CoA转化成丁酰-CoA的酶。示例性丁酰-CoA脱氢酶可为NADH-依赖型的、NADPH-依赖型的、或黄素-依赖型的,并且可分别归类为E.C.1.3.1.44、E.C.1.3.1.38、和E.C.1.3.99.2。丁酰-CoA脱氢酶得自多种来源,例如丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(基因库编号:NP_347102,NC_003030)、小眼虫(Euglenagracilis)(基因库编号:Q5EU90,AY741582)、山丘链霉菌(Streptomycescollinus)(基因库编号:AAA92890,U37135)、和天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)(基因库编号:CAA22721,AL939127)。
术语“丁醛脱氢酶”是指催化丁酰-CoA转化成丁醛的酶,该酶使用NADH或NADPH作为辅因子。丁醛脱氢酶具有对NADH的偏好性,该酶已知为E.C.1.2.1.57并且得自例如拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)(基因库编号:AAD31841,AF157306)和丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(基因库编号:NP_149325,NC_001988)。
术语“异丁酰-CoA变位酶”是指催化丁酰-CoA转化成异丁酰-CoA的酶。这种酶使用辅酶B12作为辅因子。已知示例性的异丁酰-CoA变位酶为EC编号5.4.99.13。这些酶存在于多个链霉菌属(Streptomyces)中,包括但不限于肉桂地链霉菌(Streptomycescinnamonensis)(基因库编号:AAC08713,U67612;CAB59633,AJ246005)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)(基因库编号:CAB70645,AL939123;CAB92663,AL939121)、和阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)(基因库编号:NP_824008,NC_003155;NP_824637,NC_003155)。
术语“乙酰乳酸脱羧酶”是指具有催化α-乙酰乳酸转化成乙偶姻的酶活性的多肽(或多种多肽)。已知示例性乙酰乳酸脱羧酶为EC4.1.1.5并且可例如来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(基因库编号:AAA22223,L04470)、土生克雷伯氏菌(Klebsiellaterrigena)(基因库编号:AAA25054,L04507)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)(基因库编号:AAU43774,AY722056)。
术语“乙偶姻胺化酶”或“乙偶姻转氨酶”是指具有催化乙偶姻转化成3-氨基-2-丁醇的酶活性的多肽(或多种多肽)。乙偶姻胺化酶可利用辅因子5′-磷酸吡哆醛或NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)。所得产物可在3-位点处具有(R)或(S)立体化学构型。依赖磷酸吡哆醛的酶可使用氨基酸诸如丙氨酸或谷氨酸作为氨基供体。依赖NADH的酶和依赖NADPH的酶可使用氨作为第二底物。NADH依赖的乙偶姻胺化酶的适宜示例也称为氨基醇脱氢酶,由Ito等人(美国专利6,432,688)进行了描述。吡哆醛依赖型乙偶姻胺化酶的示例是胺:丙酮酸氨基转移酶(也称为胺:丙酮酸转氨酶),如由Shin和Kim所述(J.Org.Chem.,67:2848-2853,2002)。
术语“乙偶姻激酶”指具有催化乙偶姻转化成磷酸乙偶姻的酶活性的多肽(或多种多肽)。乙偶姻激酶可利用ATP(三磷酸腺苷)或磷酸烯醇式丙酮酸作为反应中的磷酸供体。对类似底物二羟基丙酮催化类似反应的酶包括例如被称为EC2.7.1.29的酶(Garcia-Alles等人,Biochemistry43:13037-13046,2004)。
术语“乙偶姻磷酸胺化酶”是指具有催化磷酸乙偶姻转化成3-氨基-2-丁醇邻位磷酸的酶活性的多肽(或多种多肽)。乙偶姻磷酸胺化酶可利用辅因子5′-磷酸吡哆醛、NADH或NADPH。所得产物可在3-位点处具有(R)或(S)立体化学构型。依赖磷酸吡哆醛的酶可使用氨基酸诸如丙氨酸或谷氨酸。依赖NADH的酶和依赖NADPH的酶可使用氨作为第二底物。虽然没有对催化这种磷酸乙偶姻反应的酶的报道,但是存在一种吡哆醛磷酸依赖型的酶,提出其对相似的底物丝氨醇磷酸进行相似的反应(Yasuta等人,Appl.Environ.Microbial.67:4999-5009,2001)。
术语“氨基丁醇磷酸磷酸裂解酶”,也称为“氨基醇邻位磷酸裂解酶”,是指具有催化3-氨基-2-丁醇邻位磷酸转化成2-丁酮的酶活性的多肽(或多种多肽)。磷酸氨基丁醇磷酸裂解酶可利用辅因子5′-磷酸吡哆醛。存在对催化相似底物磷酸-1-氨基-2-丙醇的类似反应的酶的报道(Jones等人,Biochem.J.134:167-182,1973)。美国专利申请公布2007/0259410描述了来自生物胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)的磷酸氨基丁醇磷酸裂解酶。
术语“氨基丁醇激酶”是指具有催化3-氨基-2-丁醇转化成3-氨基-2-丁醇邻位磷酸的酶活性的多肽(或多种多肽)。氨基丁醇激酶可利用ATP作为磷酸供体。虽然没有催化这种3-氨基-2-丁醇反应的酶的报道,但是报道了催化对相似底物胆胺和1-氨基-2-丙醇的相似反应的酶(Jones等人,参见上文)。美国专利申请公布2009/0155870在实例14中描述了胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种(Erwiniacarotovorasubsp.Atroseptica)的氨基醇激酶。
术语“丁二醇脱氢酶”也称为“乙偶姻还原酶”,是指具有催化乙偶姻转化成2,3-丁二醇的酶活性的多肽(或多种多肽)。丁二醛脱氢酶是醇脱氢酶大家族中的一个子集。丁二醇脱氢酶对于在醇类产物中的(R)-或(S)-立体化学构型产生可具有特异性。已知(S)-特异性丁二醇脱氢酶为EC1.1.1.76并且可例如来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)(基因库编号:BBA13085,D86412)。已知(R)-特异性丁二醇脱氢酶被为EC1.1.1.4并且可例如得自蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)(基因库编号:NP830481,NC_004722;AAP07682、AE017000),以及乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)(基因库编号:AAK04995,AE006323)。
术语“丁二醇脱水酶”也称为“二醇脱水酶”或“丙二醇脱水酶”,是指具有催化2,3-丁二醇转化成2-丁酮的酶活性的多肽(或多种多肽)。丁二醇脱水酶可利用辅因子腺苷钴胺素(也被称为辅酶Bw或维生素B12;但维生素B12也可指不是辅酶B12的钴胺素的其它形式)。已知腺苷钴胺素依赖型酶为EC4.2.1.28并且可得自例如产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)(基因库编号:AA08099(α亚型),D45071;BAA08100(β亚型),D45071;和BBA08101(γ亚基),D45071(注意:所有三个亚基都是活性所需的)、和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)(基因库编号:AAC98384(α亚基),AF102064;基因库编号:AAC98385(β亚基),AF102064,基因库编号:AAC98386(γ亚基)、AF102064)。其它合适的二醇脱水酶包括但不限于B12依赖型二醇脱水酶,其得自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)(基因库编号:AAB84102(大亚基),AF026270;基因库编号:AAB84103(中亚基),AF026270;基因库编号:AAB84103(小亚基),AF026270);以及丘状乳杆菌(基因库编号:CAC82541(大亚基),AJ297723;基因库编号:CAC82542(中亚基),AJ297723;基因库编号:CAD01091(小亚基),AJ297723);和来自短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)(具体地讲菌株CNRZ734和CNRZ735,Speranza等人,J.Agric.FoodChem.45:3476-3480,1997),以及编码对应酶的核苷酸序列。二醇脱水酶基因分离的方法是本领域所熟知的(例如美国专利5,686,276)。
术语“丙酮酸脱羧酶”是指催化丙酮酸脱羧成乙醛和二氧化碳的酶。已知丙酮酸脱氢酶为EC编号4.1.1.1。这些酶存在于多种酵母中,包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(基因库编号:CAA97575,CAA97705,CAA97091)。
应当理解,包含如本文所提供的异丁醇生物合成途径的宿主细胞可进一步包含一个或多个附加的修饰。美国专利申请公布2009/0305363(以引用方式并入)公开了通过工程化酵母以表达定位于胞质的乙酰乳酸合酶和基本去除丙酮酸脱羧酶活性而提高丙酮酸至乙酰乳酸的转化。在一些实施例中,宿主细胞包括如美国专利申请公布2009/0305363(以引用的方式并入本文)所述的修饰以降低甘油-3-磷酸脱氢酶活性和/或破坏至少一个编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的基因或破坏至少一个编码控制丙酮酸脱羧酶基因表达的调控元件的基因,宿主细胞包括如美国专利申请公布2010/0120105(以引用的方式并入本文)所述对宿主细胞的修饰以提供通过恩特纳-道德洛夫途径(Entner-DoudoroffPathway)的提高的碳流量或降低的等效平衡。其它的修饰包括整合至少一种多核苷酸,其编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中一个步骤的多肽。
其它的修饰包括编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的内源性多核苷酸中的至少一个缺失、突变、和/或替换。如本文所用,“乙酰乳酸还原酶活性”是指具有催化乙酰乳酸转化成DHMB的能力的任意多肽的活性。此类多肽能够通过本领域熟知的和本文所公开的方法来确定。如本文所用,“DHMB”是指2,3-二羟基-2-丁酸甲酯。DHMB包括具有2S,3S构型的“快DHMB”,以及具有2S,3R构型的“慢DHMB”。参见Kaneko等人,Phytochemistry39:115-120(1995),该文献全文以引用方式并入本文,并将快DHMB称为angliceric酸,将慢DHMB称为tigliceric酸。在实施例中,具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽为酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)的YMR226C或其同源物。
附加的修饰包括编码具有醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的多肽的内源性多核苷酸中的缺失、突变、和/或替换。如本文所用,术语“醛脱氢酶活性”是指任何具有醛脱氢酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化醛氧化(脱氢)的多肽。此类多肽包括催化异丁醛转化成异丁酸的多肽。此类多肽也包括对应于酶学委员会编号EC1.2.1.3、EC1.2.1.4或EC1.2.1.5的多肽。此类多肽能够通过本领域熟知的和本文所公开的方法来确定。如本文所用,术语“醛氧化酶活性”是指任何具有醛氧化酶的生物学功能的多肽。此类多肽包括催化由醛制备羧酸的多肽。此类多肽包括催化异丁醛转化成异丁酸的多肽。此类多肽还包括对应于酶学委员会编号EC1.2.3.1的多肽。此类多肽能够通过本领域熟知的和本文所公开的方法来确定。在一些实施例中,具有醛脱氢酶活性的多肽是来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的ALD6或其同源物。
其中酵母生产宿主细胞是pdc-的具有减少葡萄糖阻遏效应的基因修饰在美国专利申请公布2011/0124060中有所描述,该文献以引用的方式并入本文。在一些实施例中,缺失或下调的丙酮酸脱羧酶选自:PDC1、PDC5、PDC6、以及它们的组合。在一些实施例中,丙酮酸脱羧酶选自:来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的PDC1丙酮酸脱羧酶、来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的PDC5丙酮酸脱羧酶、来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的PDC6丙酮酸脱羧酶、来自光滑假丝酵母(Candidaglabrata)的丙酮酸脱羧酶、来自毕赤酵母(Pichiastipites)的PDC1丙酮酸脱羧酶、来自毕赤酵母(Pichiastipites)的PDC2丙酮酸脱羧酶、来自酵母菌(Pichiastipites)的丙酮酸脱羧酶、来自耶氏酵母(Yarrowialipolytica)的丙酮酸脱羧酶、来自粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的丙酮酸脱羧酶、以及来自鲁氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)的丙酮酸脱羧酶。在一些实施例中,宿主细胞含有缺失或下调的多核苷酸,其编码催化3-磷酸甘油醛转化成3-二磷酸甘油酸的多肽。在一些实施例中,催化这种反应的酶是3-磷酸甘油醛脱氢酶。
相比之下,在异丁醇菌(PDC-)菌株中,缺失PDC,PDH途径保持完整,并且引入异丁醇生产途径酶。常常,在异丁醇生产途径中起作用的第一酶为乙酰乳酸合酶(ALS)。在异丁醇菌中,在有氧条件下用于生物质生长和异丁醇途径的碳通量分配取决于ALS而不是PDH酶的相对活性。重组异丁醇菌的生理行为不同于未修饰的酿酒酵母(S.cerevisiae),这是由于缺失PDC基因和引入异源异丁醇途径酶的效应。为使有氧生长阶段在重组异丁醇菌中的生物质产生最大化,碳通量必须有效通过PDH途径的通道以改善生物质收率并使碳通量对异丁醇途径渗漏最小化。途径渗漏产物可包括异丁醇和异丁酸,其可不利地影响生物质生长速率和获得的最终生物质。在生产阶段,异丁醇收率和产量可受途径中间体(例如,甘油和异丁酸)积聚的不利影响。因此,乙醇菌的最佳操作方案(生长和生产)可能不是异丁醇菌的最佳操作方案。
WIPO公布号WO2001/103300公开了重组宿主细胞,其包含:(a)至少一种编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的异源性多核苷酸;以及(b)(i)编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一个缺失、突变和/或替换;(ii)至少一种编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的异源性多核苷酸。在实施例中,影响Fe-S簇生物合成的多肽是由AFT1、AFT2、FRA2、GRX3或CCC1编码的。在实施例中,影响Fe-S簇生物合成的多肽为组成型突变体AFT1L99A、AFT1L102A、AFT1C291F、或AFT1C293F。
此外,宿主细胞可包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸和/或编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸。
在一些实施例中,任何特定核酸分子或多肽可与本文所述的核苷酸序列或多肽序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。如本领域所熟知的,术语“百分比同一性”是两个或更多个多肽序列之间或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系,该关系通过对序列进行比较确定。在本领域中,“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度,根据具体情况,它由这些序列的序列串之间的匹配程度确定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来,所述的方法包括但不限于下列文献中所公开的那些:1.)ComputationalMolecularBiology(Lesk,A.M.编辑)OxfordUniversity:NY(1988);2.)Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects(Smith,D.W.编辑)Academic:NY(1993);3.)ComputerAnalysisofSequenceData,部分I(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humania:NJ(1994);4.)SequenceAnalysisinMolecularBiology(vonHeinje,G.编辑)Academic(1987);和5.)SequenceAnalysisPrimer(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton:NY(1991)。
标准重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知,并且由Sambrook等人(Sambrook,J.、Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,1989,本文中称为Maniatis)和Ausubel等人(Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,由GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience出版,1987)进行描述。用于构造包含丁醇生物合成途径的微生物的方法的示例公开于例如美国专利7,851,188,以及美国专利申请公布2007/0092957;2007/0259410;2007/0292927;2008/0182308;2008/0274525;2009/0155870;2009/0305363和2009/0305370中,每个专利文献均全文以引用方式并入本文。
用于生产的生长
本文所公开的重组宿主细胞通常在发酵培养基中与合适的碳底物接触。附加的碳底物可包括但不限于单糖诸如果糖、低聚糖诸如乳糖、麦芽糖、半乳糖、或蔗糖、多糖诸如淀粉或纤维素或它们的混合物、和来自可再生的原料诸如干酪乳清渗透物、玉米浆、糖用甜菜糖蜜、和大麦芽的未纯化的混合物。其它碳底物可包括乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、或甘油。
另外,碳底物也可为已被证明可以被代谢转化成关键生化中间体的一碳底物诸如二氧化碳或甲醇。除了一碳底物和二碳底物之外,甲基营养生物体也已知可以利用多种其它含碳化合物,诸如甲胺、葡糖胺和用于代谢活动的多种氨基酸。例如,已知甲基营养酵母可利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油(Bellion等人,Microb.GrowthC1Compd.,[Int.Symp.],第7版(1993),415-32,编辑:Murrell、J.Collin;Kelly、DonP.;出版社:Intercept,Andover,UK)。类似地,假丝酵母属的多种菌种将代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人,Arch.Microbiol.153:485-489(1990))。因此,预期本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并且将仅受限于生物体的选择。
尽管预期以上提及的所有碳底物以及它们的混合物均适用于本发明,但是在一些实施例中,对于经过修饰以利用C5糖的酵母细胞,碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖,或者是它们与C5糖如木糖和/或***糖的混合物。蔗糖可衍生自可再生的糖源诸如甘蔗、糖用甜菜、木薯、甜高粱、以及它们的混合物。葡萄糖和右旋糖可通过淀粉基原料的糖化来源于可再生的谷物来源,淀粉基原料包括谷物诸如玉米、小麦、裸麦、大麦、燕麦、以及它们的混合物。此外,可发酵的糖类可通过预处理和糖化过程来源于可再生的纤维素的或木质纤维素的生物质,例如,如美国专利申请公布2007/0031918A1中所述,该专利以引用方式并入本文。当提及碳底物使用时,生物质是指任何纤维质或木质纤维质材料,并包括含有纤维素的材料、以及任选地还含有半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。生物质还可包含附加组分诸如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源,或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物;例如,生物质可包含玉米棒和玉米秸秆的混合物,或草和叶的混合物。生物质包括但不限于:生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的示例包括但不限于:玉米粒、玉米棒、作物残余如玉米皮、玉米秸秆、玉米纤维、草、小麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、蔗渣、高粱、大豆、获取自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及矮树丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物的研磨物的组分。
除适合的碳源之外,发酵液体培养基还必须包含本领域的技术人员已知的适合培养物的生长和促进本文所述的酶途径的适合的矿物、盐、辅因子、缓冲液和其它组分。
培养条件
通常,使细胞在约20℃至约40℃的温度范围内在合适的培养基中生长。本发明中的合适的生长培养基是普通的商业制备的培养基,诸如LuriaBertani(LB)液体培养基、沙氏葡糖(SD)液体培养基或酵母培养基(YM)液体培养基、或包含酵母氮源基础、硫酸铵和右旋糖(作为碳源/能源)的液体培养基,或YPD培养基——蛋白胨、酵母提取物和右旋糖以大多数酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株生长的最适比例混合的共混物。也能够使用其它确定的或合成的生长培养基,并且微生物学或发酵科学领域的技术人员将知道用于特定微生物生长的合适培养基。已知可以直接或间接调节分解代谢物阻遏的试剂,如环腺苷2′,3′-单磷酸(cAMP),也可以掺入发酵培养基中。
适于发酵的pH范围在介于pH5.0至pH9.0之间,其中pH6.0至pH8.0优选作为起始条件。对于酵母的发酵,合适的pH范围通常是介于约pH3.0至约pH9.0之间。在一个实施例中,初始条件采用了约pH5.0至约pH8.0。对于其它微生物的发酵,合适的pH范围是介于约pH3.0至约pH7.5之间。在一个实施例中,初始条件采用了约pH4.5至约pH6.5。
发酵能够在有氧或厌氧条件下进行。在一个实施例中,将厌氧或微氧条件用于发酵。
工业分批发酵和连续发酵
丁醇或其它产物可使用分批的发酵方法生产。经典的分批发酵是封闭***,其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不进行人工改变。标准分批式***的一种变型是补料分批***。补料分批发酵工艺也适用于本发明,并且包括典型的分批式***,不同的是随着发酵进程递增地添加底物。在阻遏分解代谢以抑制细胞的代谢作用以及在培养基中期望具有有限量的底物的情况下,补料分批式***是可用的。分批发酵和补料-分批发酵在本领域内是常用的且是本领域所熟知的,并且示例可见于如下文献:ThomasD.Brock,Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,第二版(1989),SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA.,或Deshpande,MukundV.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227,(1992)中,它们以引用方式并入本文。
丁醇或其它产物也可用连续发酵方法生产。连续发酵是一种开放式***,其中将确定好的发酵培养基连续添加到生物反应器中,并同时去除等量条件培养基用于加工。连续发酵一般使培养物维持在恒定的高密度下,其中细胞主要处于对数生长期。连续发酵允许调节一种因素或任意数目的因素,这些因素影响细胞生长或终产物浓度。用于调节连续发酵工艺中的营养物质和生长因子的方法以及使产物形成速率保持最高水平的技术是工业微生物领域众所周知的,并且多种方法已由Brock(同上)详细描述。
采用分批、分批补料或连续过程,预期丁醇或其它产物的生产可以实行,并且任何已知的发酵模式将是合适的。另外,预期可以将细胞固定在底物上而作为完整的细胞催化剂并让其经受发酵条件以生产丁醇。
用于利用提取发酵回收丁醇的方法
可自一种发酵培养基回收生物生产的丁醇,所述发酵培养基包含丁醇,水,至少一种可发酵的碳源,以及一种经基因修饰以通过生物合成途径从至少一种碳源生产丁醇的(即遗传工程的)微生物。该方法的第一步骤是使发酵培养基与如上所述的包含溶剂的与水不混溶的有机提取剂组合物接触,以形成包含水相和含丁醇的有机相的两相混合物。“接触”是指发酵培养基和有机提取剂组合物或其一种或多种溶剂组分在发酵过程期间的任何时间处发生物理接触。在一个实施例中,所述发酵培养基还包含乙醇,并且所述含丁醇的有机相可包含乙醇。
在某些实施例中,在多于一种溶剂可用于提取的情况下,所述接触可用先前合并的提取剂组合物中的溶剂进行。例如,可以在诸如混合槽的容器中将第一溶剂和第二溶剂合并以形成提取剂,然后将提取剂添加到包含发酵培养基的容器中。作为另外一种选择,接触可以第一溶剂和第二溶剂在接触过程中合并的方式进行。例如,第一溶剂和第二溶剂可分别地添加到含有发酵培养基的容器中。在一个实施例中,使发酵培养基与有机提取剂组合物接触进一步包括,在使发酵培养基和第一溶剂与第二溶剂接触之前,先使发酵培养基与第一溶剂接触。在一个实施例中,与第二溶剂的接触和与第一溶剂的接触在相同的容器中发生。在一个实施例中,与第二溶剂的接触和与第一溶剂的接触在不同的容器中发生。例如,第一溶剂可在一个容器中与发酵培养基接触,然后内容物被转移至另一个容器,在后者中发生与第二溶剂的接触。
有机提取剂组合物可以在发酵开始时与发酵培养基接触,从而形成双相发酵培养基。另选地,有机提取剂组合物可在当微生物达到一个期望的生长量之后与发酵培养基接触,其中所述生长量的达到可以通过测定培养物的光密度而确定。
另外地,有机提取剂组合物可以在当发酵培养基中的丁醇水平达到一个预先确定的水平时与发酵培养基接触,例如在丁醇浓度达到毒性水平之前。可以利用本领域已知的方法,诸如通过气相色谱法或高效液相色谱法,在发酵期间监测丁醇浓度。
发酵可以在有氧条件下进行足以使培养物达到预先选定的生长水平的时间,如通过光密度测量所确定的。然后可添加诱导剂以在所述经修饰的微生物中诱导丁醇生物合成途径的表达,并将发酵条件转至微需氧或厌氧条件,以刺激丁醇的生产,如美国专利申请公布2009/0305370A1的实例6中所述。转至微需氧或厌氧条件之后添加提取剂。
通过使发酵培养基与有机提取剂接触,丁醇产物分配至有机提取剂,降低了在包含微生物的水相中的浓度,从而限制了生产丁醇的微生物在抑制性的丁醇产品中的暴露。待使用的有机提取剂的体积依赖于多种因素,包括发酵培养基的体积,发酵罐的尺寸,丁醇产物在提取剂中的分配系数,以及发酵模式的选择,如下所述。有机提取剂的体积可以是发酵罐工作体积的约3%至约60%。提取剂与发酵培养基的比率为以体积比计约1∶20至约20∶1,例如约1∶15至约15∶1,或约1∶12至约12∶1,或约1∶10至约10∶1,或约1∶9至约9∶1,或约1∶8至约8∶1。
下一步为利用本领域已知的方法,包括但不限于虹吸、滗析、离心,利用重力澄清槽以及膜辅助的相***等等,将含丁醇的有机相与水相分离。丁醇从含丁醇的有机相中的回收可以用本领域已知的方法进行,这些方法包括但不限于蒸馏、树脂吸附、通过分子筛分离以及全蒸发等等。具体地,可以采用蒸馏从含丁醇的有机相中回收丁醇。提取剂或溶剂可以被循环至丁醇的生产和/或回收过程。
可与有机提取剂组合物的溶剂同时地采用汽提从发酵培养基中去除丁醇产物。汽提可以通过将气体诸如空气、氮气或二氧化碳通过发酵培养基从而形成含丁醇的气相来进行。可用本领域已知的方法,诸如利用冷却水捕集器以冷凝丁醇或用溶剂洗涤气相,从含丁醇的气相中回收丁醇产物。
发酵过程完成之后保留在发酵培养基中的任何丁醇均可通过用新鲜的或循环利用的有机提取剂持续提取而得到回收。另选地,可用本领域已知的方法,包括但不限于蒸馏、共沸蒸馏、液-液提取、吸附、汽提、膜蒸发、全蒸发等,从发酵培养基中回收丁醇。
两相提取发酵方法可于搅拌槽发酵罐中以连续模式进行。在这种模式中,发酵培养基和含丁醇的有机提取剂组合物的混合物被从发酵罐中去除。通过本领域已知的方法,包括但不限于虹吸、滗析、离心,利用重力澄清槽以及膜辅助的相***等等,如上所述将两相分离。分离之后,发酵培养基可循环至发酵罐中,或者也可用新鲜的培养基替换。然后,对提取剂进行处理以回收丁醇产物,如上所述。提取剂接下来可被循环返回至发酵罐用于进一步提取产物。另选地,可持续地将新鲜的提取剂添加到发酵罐中,以替换被去除的提取剂。这种连续的操作模式具有若干优点。由于产物被连续地从反应器中去除,只需较小体积的有机提取剂组合物就能允许使用较大体积的发酵培养基。这导致较高的产品收率。有机提取剂组合物的体积可为发酵罐工作体积的约3%至约50%;为发酵罐工作体积的3%至约20%;或为发酵罐工作体积的3%至约10%。有利的是,使用尽可能最小量的发酵罐中的提取剂以使水相的体积最大化,从而使发酵罐内细胞的量最大化。该过程可以完全连续的模式操作,在这种模式中,提取剂在发酵罐和分离设备之间连续循环利用,而发酵培养基被连续地从发酵罐中去除并用新鲜的培养基补足。在这种完全连续的模式中,丁醇产物不被允许达到毒性临界浓度,并且新鲜的营养物质被连续地提供,使得发酵可以长时间进行。可用于进行这些模式的两相提取发酵的设备为本领域所熟知。例如,示例由Kollerup等人描述于美国专利4,865,973中。
也可以使用分批发酵模式。为本领域所熟知的分批发酵是封闭***,其中发酵培养基的组成在发酵开始时设定,并且在发酵过程中不经受人为的改变。在这种模式中,一定体积的有机提取剂组合物被添加到发酵罐中,并且这些提取剂在发酵过程中不被去除。有机提取剂组合物可通过分别地添加第一溶剂和第二溶剂而在发酵罐中形成,或者可以合并上述溶剂以形成提取剂组合物,然后再将提取剂组合物添加到发酵罐中。虽然这种模式比上述连续的或者完全连续的模式更简单,但它需要更大体积的有机提取剂组合物,以使发酵培养基中抑制性的丁醇产物的浓度最小化。因此,发酵培养基的体积更少,所产生的产物的量也比采用上述连续模式时所获得的更少。在分批模式中,有机提取剂组合物的体积可为发酵罐工作体积的约20%至约60%;或者为发酵罐工作体积的30%至约60%。基于上文所述原因,在发酵罐中使用尽可能最小体积的提取剂是有利的。
还可使用分批补料发酵模式。分批补料发酵是标准的分批***的变型,在这种模式中,营养物质如葡萄糖在发酵期间被递增添加。营养物质添加的量和速率可通过常规实验确定。例如,可以在发酵期间监测发酵培养基中关键营养物质的浓度。另选地,可以对更易测量的因素诸如pH、溶解氧以及废气(诸如二氧化碳)的分压进行监测。从这些测量参数可以确定营养物质添加的速率。在这种模式中使用的有机提取剂组合物的量及其添加方法与在分批模式中所使用的相同,如上文所述。
产物的提取可以在发酵罐的下游而不是在原位进行。在这种外部模式中,将丁醇产物提取到有机提取剂组合物中是在从发酵罐中去除的发酵培养基上进行的。所使用的有机溶剂的量为发酵罐工作体积的约20%至约60%;或者为发酵罐工作体积的30%至约60%。发酵培养基可以连续地或者间歇地从发酵罐中去除,并且用有机提取剂组合物对丁醇产物进行的提取可以在从发酵培养基中去除或者不去除细胞的情况下进行。细胞可以通过本领域已知的方法从发酵培养基中去除,所述方法包括但不限于过滤或离心。在通过上述方法将发酵培养基与提取剂分离之后,发酵培养基可再循环到发酵罐中,或者被丢弃,或者被处理以去除任何残余的丁醇产物。类似地,分离的细胞也可再循环到发酵罐中。在用于回收丁醇产物的处理之后,提取剂、第一溶剂、和/或第二溶剂可被再循环用于提取过程中。另选地,也可以使用新鲜的提取剂。在这种模式中,提取剂不存在于发酵罐中,因此提取剂的毒性远不是问题。如果在使发酵培养基与提取剂接触之前将细胞从发酵培养基中分离,则进一步减小了提取剂毒性的问题。此外,采用这种外部模式时,形成乳液的可能性更小,并且提取剂的蒸发被最小化,减轻了环境问题。
用于使用包含无水溶剂的提取剂使用提取发酵来生产丁醇的方法
提供了用于生产丁醇的改进的方法,其中经基因修饰以通过生物合成途径从至少一种碳源生产丁醇的微生物在双相发酵培养基中生长。双相发酵培养基包含水相和含有无水溶剂的与水不混溶的有机提取剂组合物。
利用经修饰的大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株结合使用油醇作为有机提取剂,可以通过提取发酵生产异丁醇,如美国专利申请公布2009/0305370A1中所公开的。与使用常规的发酵技术相比,该方法产生更高的异丁醇有效滴度(即,37g/L),(参见美国专利申请公布2009/0305370A1的实例6)。例如,Atsumi等人(Nature451(3):86-90,2008)报导了用一种经基因修饰从而包含异丁醇生物合成途径的大肠杆菌(Escherichiacoli)进行发酵时,至多达22g/L的异丁醇滴度。用美国专利申请公布2009/0305370A1所公开的提取发酵方法获得的较高的丁醇滴度,部分地是由于毒性丁醇产物从发酵培养基中的去除,从而保持了其水平低于对微生物具有毒性的水平。可以合理地假设,本发明的使用包含如本文所定义的无水溶剂的与水不混溶的有机提取剂组合物的提取发酵方法,将以类似的方式被使用并得到类似的结果。
通过本文所公开的方法生产的丁醇可具有大于22g/L的发酵培养基的有效滴度。另选地,通过本文所公开的方法生产的丁醇可具有至少25g/L的发酵培养基的有效滴度。另选地,通过本文所公开的方法生产的丁醇可具有至少30g/L的发酵培养基的有效滴度。另选地,通过本文所公开的方法生产的丁醇可具有至少37g/L的发酵培养基的有效滴度。另选地,通过本文所公开的方法生产的丁醇可具有至少45g/L的发酵培养基的有效滴度。另选地,通过本文所公开的方法生产的丁醇可具有至少50g/L的发酵培养基的有效滴度。另选地,通过本文所公开的方法生产的丁醇可具有至少60g/L的发酵培养基的有效滴度。在一些实施例中,回收的丁醇具有约22g/L至约50g/L,约22g/L至40g/L,约22g/L至约30g/L,约25g/L至约50g/L,约25g/L至40g/L,约25g/L至约30g/L,约30g/L至约50g/L,约40g/L至约50g/L,约22g/L至约60g/L,约30g/L至约60g/L,约40g/L至约60g/L,约22g/L至约80g/L,约40g/L至约80g/L,约50g/L至约80g/L,约65g/L至约80g/L的有效滴度。
本发明的方法一般概述于下文对图1至图7的描述中。
现在参见图1,显示的是用于使用原位提取发酵生产和回收丁醇的过程的一个实施例的示意图。将至少一种可发酵的碳源的含水料流10引入到发酵罐20中,该发酵罐包含至少一种能够将至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的重组微生物(未示出)。第一无水溶剂的料流12和任选的第二溶剂的料流14被引入到容器16中,在该容器中将溶剂合并以形成提取剂18。提取剂18的料流被引入到发酵罐20中,在该发酵罐中发生发酵培养基与提取剂的接触以形成包含水相和含丁醇的有机相的两相混合物。同时包含水相和有机相的料流26被引入到容器38中,在该容器中,进行水相和有机相的分离,从而产生含丁醇的有机相40和水相42。
现在参见图2,示出用于使用原位提取发酵生产和回收丁醇的过程的一个实施例的示意图。将至少一种可发酵的碳源的含水料流10引入到发酵罐20中,该发酵罐包含至少一种能够将至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的重组微生物(未示出)。组成提取剂的第一无水溶剂的料流12和任选的第二溶剂的料流14被分别引入到发酵罐20中,在该发酵罐中,发生发酵培养基与提取剂的接触,从而形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。同时包含水相和有机相的料流26被引入到容器38中,在该容器中,进行水相和有机相的分离,从而产生含丁醇的有机相40和水相42。
现在参见图3,示出用于使用原位提取发酵生产和回收丁醇的过程的一个实施例的示意图。将至少一种可发酵的碳源的含水料流10引入到第一发酵罐20中,该第一发酵罐包含至少一种能够将至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的重组微生物(未示出)。组成提取剂的第一无水溶剂的料流12被引入到发酵罐20中,并且包含第一无水溶剂和发酵罐20的内容物的混合物的料流22被引入到第二发酵罐24中。组成提取剂的任选的第二溶剂的料流14被引入到第二发酵罐24中,在该第二发酵罐中,发生发酵培养基与提取剂的接触,从而形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。同时包含水相和有机相的料流26被引入到容器38中,在该容器中,进行水相和有机相的分离,从而产生含丁醇的有机相40和水相42。
现在参见图4,示出用于生产和回收丁醇的过程的一个实施例的示意图,其中对产物的提取在发酵罐的下游而不是在原位进行。将至少一种可发酵的碳源的含水料流110引入到发酵罐120中,该发酵罐包含至少一种能够将至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的重组微生物(未示出)。第一无水溶剂的料流112和任选的第二溶剂的料流114被引入到容器116中,在该容器中将溶剂合并以形成提取剂118。发酵罐120中的发酵培养基的至少一部分,示出为料流122,被引入到容器124中。提取剂的料流118也被引入到容器124中,在该容器中发生发酵培养基与提取剂的接触,从而形成包含水相和含丁醇的有机相的两相混合物。同时包含水相和有机相的料流126被引入到容器138中,在该容器中,进行水相和有机相的分离,从而产生含丁醇的有机相140和水相142,水相可返回到发酵罐120中。
现在参见图5,示出用于生产和回收丁醇的过程的一个实施例的示意图,其中对产物的提取在发酵罐的下游而不是在原位进行。将至少一种可发酵的碳源的含水料流110引入到发酵罐120中,该发酵罐包含至少一种能够将至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的重组微生物(未示出)。组成提取剂的第一无水溶剂的料流112和任选的第二溶剂的料流114被分别引入到容器124中,在该容器中将溶剂合并以形成提取剂。发酵罐120中的发酵培养基的至少一部分,示出为料流122,也被引入到容器124中,在该容器中发生发酵培养基与提取剂的接触,从而形成包含水相和含丁醇的有机相的两相混合物。同时包含水相和有机相的料流126被引入到容器138中,在该容器中,进行水相和有机相的分离,从而产生含丁醇的有机相140和水相142,水相可返回到发酵罐120中。
现在参见图6,示出用于生产和回收丁醇的过程的一个实施例的示意图,其中对产物的提取在发酵罐的下游而不是在原位进行。将至少一种可发酵的碳源的含水料流110引入到发酵罐120中,该发酵罐包含至少一种能够将至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的重组微生物(未示出)。组成提取剂的第一无水溶剂的料流112被引入到容器128中,并且发酵罐120中的发酵培养基的至少一部分,示出为料流122,也被引入到容器128中。包含第一无水溶剂和发酵罐120的内容物的混合物的料流130被引入到第二容器132中。组成提取剂的任选的第二溶剂的料流114被引入到第二容器132中,在该容器中发生发酵培养基与提取剂的接触,从而形成包含水相和含丁醇的有机相的双相混合物。同时包含水相和有机相的料流134被引入到容器138中,在该容器中,进行水相和有机相的分离,从而产生含丁醇的有机相140和水相142,水相可返回到发酵罐120中。
本文所述的提取过程可作为分批过程运行,或者可以连续模式运行,其中新鲜的提取剂被添加而使用过的提取剂被泵出,使得发酵罐中的提取剂的量在整个发酵过程中保持恒定。如此对发酵培养基中产物和副产物的连续提取可提高有效速率、有效滴度和有效产量。
在另一个实施例中,还可以在柔性顺流中,或者作为另外一种选择,以逆流方式进行液-液提取,其中当使用一系列分批发酵罐时,所述逆流方式是导致分批操作模式的差异的原因。在这种情形中,只要车间在运行,提供了至少一种可发酵的碳源和重组微生物的发酵麦芽浆就会以连续方式一个接一个地充满发酵罐。参见图7,一旦发酵罐F100用麦芽浆和微生物填充,麦芽浆和微生物进料就可以连续环路形式首先推进到发酵罐F101,继而推进到发酵罐F102,然后回到发酵罐F100。在任何一个发酵罐中,一旦麦芽浆和微生物一起存在,发酵就开始,并持续至发酵完全。麦芽浆和微生物的充填时间可等于总的循环时间除以发酵罐的数量(填充、发酵、排空和清洗)。若总的循环时间为60小时且存在3个发酵罐,则充填时间可为20小时。若总的循环时间为60小时且存在4个发酵罐,则充填时间可为15小时。
合适的顺流提取所根据的发酵模式假定,以较高的发酵液相滴度运行的发酵罐能够利用丁醇浓度最高的提取溶剂料流,而以最低的发酵液相滴度运行的发酵罐能受益于丁醇浓度最低的提取溶剂料流。例如,再次参见图7,考虑此种情况,即发酵罐F100位于发酵的启始并以相对低的丁醇发酵液相(B)滴度运行,发酵罐F101位于发酵的中部并以相对中等的丁醇发酵液相滴度运行,并且发酵罐F102靠近发酵的末端并以相对高的丁醇发酵液相滴度运行。这种情况下,不含或仅含极少的提取的丁醇的贫提取溶剂(S),可被供给发酵罐F100,来自发酵罐F100的含有提取的丁醇组分的“流出溶剂”料流(S′)可作为“流入溶剂”料流被供给发酵罐F101,而来自F101的流出溶剂可继而作为流入溶剂料流供给发酵罐F102。然后,来自F102的流出溶剂料流可接受处理以回收该料流中存在的丁醇。绝大多数丁醇已被去除的经过处理的溶剂料流,可作为贫提取溶剂返回至***中,并作为供给上述发酵罐F100的流入溶剂。
随着发酵以有序方式进行,可重置提取溶剂歧管中的阀门,以将最贫的提取溶剂供给以最低的丁醇发酵液相滴度运行的发酵罐。例如,假定(a)发酵罐F102完成了其发酵过程,并且已被重新装料并重新开始发酵,(b)发酵罐F100处于其发酵过程的中期,正以中等的丁醇发酵液相滴度运行,并且(c)发酵罐F101接近其发酵过程的末期,正以相对较高的丁醇发酵液相滴度运行。在这种情形中,最贫的提取溶剂将会供给F102,自F102流出的提取溶剂将会供给发酵罐F100,而自发酵罐F100流出的提取溶剂将会供给发酵罐F101。
以这种方式运行的优点在于可在尽量长的时间里保持发酵液相丁醇滴度尽可能地低,从而实现生产率的提升。此外,在已进一步进入以较高的丁醇发酵液相滴度运行的发酵过程的其它发酵罐中,是有可能降低温度的。温度的降低能允许对较高丁醇发酵液相滴度的耐受力的改善。
已经描述了可使用无水溶剂(包括多溶剂)的多种技术、方法、体系等,现在更详细地描述多溶剂提取技术。应当显而易见的是,结合溶剂混合物描述的技术、方法、组合物等可使用前述原理,并且反之亦然。此外,虽然描述了包括无水溶剂的多溶剂体系,但显然相对“湿”溶剂体系可获益于本公开的原理。
使用溶剂混合物提取丁醇
在实施例中,使用溶剂混合物来从水性溶液中提取醇。例如,可使溶剂混合物和发酵液接触在一起以从发酵液提取丁醇,诸如异丁醇。如上所述,接触可内部地(发酵罐内部)、外部地(例如,经由冷却回路)、或它们的组合等来进行。另外,如上所述,发酵液可包含但不限于发酵产物、发酵固体、未发酵碳底物(例如糖)、微生物(活的、死的、预期的、非预期的)、营养物质(例如,由微生物利用以产生醇的矿物质营养物质)等。
在示例中,溶剂混合物包含第一溶剂和第二溶剂。任选地,如本领域的普通技术人员所设想的,溶剂混合物中可包含促进有效提取的附加溶剂(三种或更多种)、添加剂等。
可选择单独的溶剂,从而所得的混合物表现出以下特性:增加提取效率,改善提取选择性(例如,相比于其它化合物诸如水,优先提取例如目标醇(异丁醇)),或是营养物质的反溶剂。另外的示例包括但不限于,使含水量(溶剂溶解水的趋势,或湿度)最小化,表现出良好的疏水性,通过蒸馏与目标醇分离的能力,其是抑制性杂质或副产物的良好溶剂,所述溶剂是经济上可行的、环境友好的等。在实施例中,疏水性表达为logP,其是溶剂或溶剂混合物在溶剂/辛醇/水的混合物中的分配系数的对数log。因此,logP可表达为在辛醇存在下,有机相中一种或多种溶剂的总摩尔浓度除以水相中一种或多种溶剂的总摩尔浓度(例如所有溶剂的总和)的比率的以十为底的对数。
可定制的其它相关溶剂混合物的特性包括但不限于,对能够产生醇的微生物的低毒性/生物相容性、提取营养物质(例如由微生物利用以产生醇的营养物质)的低趋势、沸点、与待包含在溶剂混合物中的其它溶剂的相容性、热稳定性、低挥发性等。营养物质的示例包括矿物质和维生素。还可考虑溶剂对氨基酸、蛋白质、肽和蛋白胨的亲和力。在一些实施例中,使用溶剂或溶剂混合物中的一种或多种来将营养物质传输到发酵液。在如此的示例中,溶剂混合物可在接触发酵液之前接触营养物质。因此,营养物质可与发酵液交换,从而营养物质进入发酵液并且醇进入溶剂混合物。其它相关特性包括溶剂对抑制微生物的杂质的亲和力。例如,溶剂混合物包含这样的溶剂,其具有对在发酵期间产生的化合物的高亲和力,但对产生产物醇的微生物是毒性的。如果例如溶剂以使用之后去除的形式提供,则可考虑溶剂彼此分离的能力。可将COFA纯化以分离任何共溶剂并作为去除产物提供。
可因为其有效去除对微生物具有毒性的污染物(例如丁酸),而选择溶剂。虽然优选最大化有利的特性,但也可进行权衡以避免或最小化非优选的特性。例如,虽然一些溶剂具有高丁醇亲和力(Kd),但其可表现出高含水量(湿度),和/或对微生物具有毒性。其它溶剂被认为是无水的(低水分),具有良好的生物相容性(高logP),但表现出低或差的Kd。
在一些具体实施中,溶剂混合物表现出不由第一溶剂和第二溶剂的线性摩尔组合所表示的一个或多个特性。一些溶剂混合物,例如表现出不基于单种溶剂的特性以及单种溶剂的摩尔分数所表示的特性。例如,可预期对于具体特征(例如疏水性)而言,五十/五十(50/50)比率的第一溶剂和第二溶剂将表现得如溶剂混合物的相应特性或特征为百分之五十(50%)第一溶剂的特性和百分之五十(50%)第二溶剂的特性。在一些情况下,溶剂混合物表现出受混合物中的一种溶剂影响的程度比另一种溶剂相对大。上述内容还适用于包含多于两种溶剂的溶剂混合物。在一些情况下,与由线性组合所指示的特性的这种偏离是由于溶剂混合物中的溶剂之间的分子间相互作用。示例包括但不限于极性、氢键合、范德华力例如伦敦力等的存在。与预定性能的这种偏离可以由下图进行图示说明(大致地并以简化形式)。
图表1:预期特性相对于可能观察到的特性
如图表1中可见,相对于溶剂特性,二元溶剂混合物可背离由第一溶剂和第二溶剂的线性组合所表示的特性。如图所示,所述特性可背离基于其对应摩尔分数由单种溶剂所预期的特性(例如,“线性组合”),如上文所概述的。所述特性或特征可以是有利的(例如,在丁醇提取方面的良好选择性、对丁醇的高亲和力)或其可表现出不利的特性(例如,表现出差疏水性)。因此,溶剂混合物可背离(通常)由线性组合沿所述两条曲线所指示的特性。例如,将无水(低水分)的并与微生物(丁醇菌)生物相容(高logP)的第一溶剂与具有高Kd的第二湿溶剂混合可导致在从发酵液中提取丁醇时有效的并表现出与发酵液中的丁醇菌的良好生物相容性的溶剂混合物。以这种方式,溶剂混合物可被定制成表现出不由第一溶剂和第二溶剂的线性组合表示的协同效应、有利效应。例如,相比于百里酚和COFA的溶剂混合物,异十六烷和异十二烷的溶剂混合物可表现出良好的疏水性并且一般来讲可对丁醇菌无毒性(例如生物相容性)。
溶剂混合物的特性有时由组分摩尔分数的复杂函数来描述。例如,非理想液体混合物中组分的活度系数的自然对数可由溶剂行为的经验模型诸如由Margules公式所提供的经验模型来表达。在这种情况下,组分中任一种的活度系数的自然对数为溶剂混合物中所有组分的摩尔分数的三次多项式函数。
当例如在两种接触的不可混溶的非理想液体混合物(例如水相和有机相)之间分配异丁醇时,平衡摩尔分配系数可等于一种混合物(例如水相)中异丁醇的活度系数与另一种混合物(例如有机相)中异丁醇的活度系数的比率。因此,摩尔分配系数的自然对数可等于将遵循三次多项式函数的两种活度系数的自然对数之间的差值。本领域的技术人员可预期混合物的特性诸如Kd和logP可相似地至少遵循组分摩尔分数的更复杂函数。将非理想液体混合物的平衡含水量描述成组分摩尔分数的函数可能甚至更复杂。
当溶剂混合物或其部分可为与水不混溶的,例如大约10-7时,在一些情况下,溶剂中的一种或多种可在水中相对弱的混溶。还可以理解水可在溶剂混合中混溶(例如,可一定程度地混溶)和/或在溶剂混合物所包含的一种或多种溶剂中混溶。在一些示例中,COFA可吸收水分,或水,使得COFA是“湿的”。在一些示例中,溶剂吸收水分(例如用作溶剂)的趋势,可不同于所述溶剂在水中成溶剂化物的能力,例如其疏水性。正下方再现了各种溶剂及其相应特性的表。
表1:示例性溶剂特性
溶剂 | logP | Kd | 含水量(重量%) |
玉米油 | 19 | 0.25 | 0.70 |
FABE | 9.4 | 1.4 | 0.18 |
COFA | 6.5 | 3 | 0.70 |
2-乙基己醇 | 2.8 | 7.8 | 2 |
香芹酚 | 3.3 | 15.6 | 2 |
四丁基脲 | 6.6 | 7.4 | 0.9 |
异十二烷醇 | 4.4 | 5.4 | 0.2 |
磷酸三丁酯 | 4.3 | 9.8 | 6.7 |
异十二烷 | 6.2 | 0.25 | <0.01 |
异十六烷 | 8.0 | 0.2 | <0.01 |
三异丙基苯 | 6.2 | 0.65 | <0.01 |
异丁醇产生的确认
异丁醇在培养基中的存在和/或浓度能够通过本领域中已知的多种方法(参见,例如,美国专利7,851,188,该文献以引用方式并入)测定。例如,一种特异性的使用ShodexSH-1011柱和ShodexSHG保护柱(二者均可购自WatersCorporation(Milford,Mass.))并具有折射率(RI)检测的高效液相色谱(HPLC)方法。用0.01MH2SO4作为流动相,以0.5mL/分钟流速和50℃的柱温实现色谱分离。异丁醇在所用条件下具有46.6min的保留时间。
另选地,气相色谱法(GC)是可用的。例如,特异性的GC方法利用HP-INNOWax柱(30m×0.53mm内径,1μm膜厚度,AgilentTechnologies(Wilmington,DE)),配有火焰离子化检测器(FID)。载气是在恒定排出压力下在150℃下测量的流速为4.5mL/min的氦气;注射器分流在200℃下为1∶25;烘箱温度为45℃并持续1min,以10℃/min从45℃上升至220℃,并且在220℃下持续5min;并且采用利用26mL/min氦气补充气体在240℃下的FID检测。异丁醇的保留时间为4.5分钟。
尽管本发明的各种实施例已如本文所述,但是应当理解它们仅仅以举例的方式存在,并且不受限制。对相关领域的技术人员将显而易见的是能够在不脱离本发明的实质和范围的情况下对其进行形式和细节的多种改变。因此,本发明的广度和范围应不受任何上述示例性实施例的限制,但应仅仅根据以下权利要求及其等同物限定。
在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均指示本发明所属领域的技术人员的技术水平,并且以引用方式并入本文至如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体且单独地指明为以引用方式并入的相同程度。
实例:
本发明将在以下的实例中进一步阐述。应该理解,尽管这些实例说明了本发明的实施例,但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实例,本领域的技术人员可确定本发明的必要特征,并且在不脱离本发明的实质和范围内的情况下,可对本发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。
本文所述实例中的一些可使用计算模型诸如Aspen模型来展示(参见,例如,美国专利7,666,282)。例如,商业建模软件Aspen(AspenTechnology,Inc.,Burlington,MA)可与物理特性数据库诸如可购自AmericanInstituteofChemicalEngineers,Inc.(NewYork,NY)的DIPPR和UNIFAC一起使用,来开发用于整合的丁醇发酵、纯化和水管理过程的Aspen模型。这种过程建模可进行许多基本的工程计算,例如质量和能量平衡,气/液平衡以及反应速率计算。为了产生Aspen模型,信息输入可包括例如实验数据、水含量和原料组成、麦芽浆烹煮和闪蒸的温度、糖化条件(例如,酶进料、淀粉转化、温度、压力)、发酵条件(例如,微生物进料、葡萄糖转化、温度、压力)、脱气条件、溶剂塔、预闪蒸塔、冷凝器、蒸发器、离心机等。
实例1A:三异丁烯与乙醇菌的生物相容性
在两个125ml摇瓶中,各自添加20ml包含浓度为21g/L的葡萄糖的水性培养基以及天然存在的乙醇菌酵母菌株的0.5OD悬浮液。将10ml体积的三异丁烯(TokyoChemicalInsdustryCo.,>90%的异构体混合物,其中估计的logP为5.8)添加到烧瓶中的一个的含水悬浮液的顶部上。将这些烧瓶放置在控制为32℃并且连续摇动的温育烘箱中。4小时之后,分析两个***水相并发现包含小于0.1g/L葡萄糖。在两个烧瓶之间没有观察到葡萄糖吸收方面的显著差异。
实例1B:三异丁烯与异丁醇菌的生物相容性
两个125ml烧瓶各自准备有二十毫升(20ml)包含浓度为二十八克每升(28g/L)的葡萄糖的水性培养基,向其中添加经基因修饰的异丁醇菌酵母菌株(PNY2141)的零点五(0.5)OD悬浮液。将十毫升(10ml)的三异丁烯(TokyoChemicalInsdustryCo.,>90%的异构体的混合物,估计的logP为5.8)添加到烧瓶中的一个的含水悬浮液的顶部上。将烧瓶放置在控制为三十二摄氏度(32℃)并且连续摇动的温育烘箱中。监测两个烧瓶中的每一个的葡萄糖浓度和OD。下文再现的表2指出得自监测的***结果。
通过测量OD和葡萄糖浓度监测生长。在包含三异丁烯的烧瓶中观察到对生长的一些阻碍。
表2:用于利用三异丁烯进行异丁醇提取的OD和葡萄糖浓度
实例2:三异丁烯-COFA混合物的生物相容性
在两个125ml烧瓶中,各自添加20ml包含浓度为32g/L的葡萄糖的水性培养基以及经基因修饰的异丁醇菌酵母菌株的0.5OD悬浮液。将10ml体积的三异丁烯(TokyoChemicalInsdustryCo.,>90%的异构体的混合物,其中估计的logP为5.8)和玉米油脂肪酸的50%混合物添加到烧瓶中的一个的含水悬浮液的顶部上。将这些烧瓶放置在控制为32℃并且连续摇动的温育烘箱中。通过测量OD监测生长。在两个烧瓶之间没有观察到生长方面的显著差异,如表3所示。
表3:在三异丁烯和玉米油脂肪酸(COFA)的50∶50混合物的存在和
不存在下所生长的异丁醇菌的OD值。
时间(小时) | 在无溶剂情况下的OD | 在具有溶剂情况下的OD |
0 | 0.5 | 0.5 |
7 | 0.9 | 0.9 |
13 | 1.5 | 1.6 |
23 | 3.7 | 3.1 |
29 | 4.1 | 4.0 |
37 | 4.3 | 4.3 |
50 | 5.0 | 5.0 |
60 | 5.4 | 5.5 |
实例3:异十二烷的生物相容性
在两个125ml烧瓶中,各自添加20ml包含浓度为32g/L的葡萄糖的水性培养基以及经基因修饰的异丁醇菌酵母菌株的0.5OD悬浮液。将10ml体积的异十二烷(异构体的AlfaAesar工业级混合物,其中估计的logP为六点二(6.2))添加到烧瓶中的一个的含水悬浮液的顶部上。将这些烧瓶放置在控制为32℃并且连续摇动的温育烘箱中。通过测量葡萄糖吸收和OD监测生长。在两个烧瓶之间没有观察到生长方面的显著差异,如在正下方表3所示。
表3:在异十二烷的存在/不存在下所生长的异丁醇菌的OD和葡萄糖
值
实例4:在三异丁烯和水之间的异丁醇分配
在小圆底烧瓶中,将包含浓度为6重量%的异丁醇的10ml水性溶液和1ml三异丁烯(TokyoChemicalInsdustryCo.,>90%的异构体的混合物,其中估计的logP为5.8)合并。将液体完全混合,然后离心以分成有机层和水层。通过气相色谱法分析有机层的样品并发现包含9.03重量%(或18.39摩尔%)异丁醇。通过气相色谱法分析水层的样品并发现包含5.28重量%(或1.33摩尔%)异丁醇。质量分配系数计算为1.71并且摩尔分配系数计算为13.8。
实例5A:异十二烷和水之间的异丁醇分配(第一条件组)
在小圆底烧瓶中,将包含浓度为6重量%的异丁醇(Sigma-AldrichCo.LLC,St.Louis,MO,USA,试剂级)的10ml水性溶液和1ml异十二烷(异构体的AlfaAesar工业级混合物,其中估计的logP为六点二(6.2))合并。将液体完全混合,然后离心以分成有机层和水层。通过气相色谱法分析有机层的样品并发现包含8.31重量%(或17.24摩尔%)异丁醇。通过气相色谱法分析水层的样品并发现包含5.45重量%(或1.39摩尔%)异丁醇。质量分配系数计算为1.525并且摩尔分配系数计算为12.4。
实例5B:异十二烷和水之间的异丁醇分配(第二条件组)
在样品瓶中,将包含浓度为两点零重量百分比(2.0重量%)异丁醇的三克(3g)水性溶液和三克(3g)异十二烷合并。将液体完全混合,然后离心以分成有机层和水层。通过HPLC分析水层的样品并发现包含一点六零重量百分比(1.60重量%)异丁醇并通过质量平衡计算有机层包含零点四零重量百分比(0.40重量%)异丁醇。质量分配系数计算为零点二五(0.25)。
实例6A:1,3-二异丙基苯的生物相容性
在125ml烧瓶中,添加二十毫升(20ml)包含浓度为三十克每升(30g/L)的葡萄糖的水性培养基,以及经基因修饰的异丁醇菌酵母菌株(PNY2141)的一点零1.0OD悬浮液。将10ml体积的1,3-二异丙基苯(Sigma-AldrichCo.LLC(St.Louis,MO,USA),(Aldrich)试剂级,其中估计的logP为四点九(4.9))添加到含水悬浮液的顶部上。将烧瓶放置在控制为三十二摄氏度(32℃)并且连续摇动的温育烘箱中。通过测量葡萄糖监测生长。没有观察到葡萄糖的显著消耗。该分析的结果记录在正下方表4中。
表4:用于1,3-二异丙基苯的葡萄糖含量
时间(小时) | 葡萄糖(克/升,gpl) |
0 | 30 |
6 | 30 |
11 | 30 |
16 | 28 |
24 | 29 |
实例6B:1,3,5-三异丙基苯的生物相容性
在该实例中,将经基因修饰的异丁醇菌酵母菌株PNY2310的1.0OD悬浮液添加到125ml烧杯中,该烧瓶包含含有浓度为29g/L的葡萄糖的水性培养基。将十毫升(10ml)1,3,5-三异丙基苯(Sigma-Aldrich,试剂级,其中估计的logP为6.2)添加到含水悬浮液的顶部上。将包含样品的烧瓶保持在三十二摄氏度(32℃)下在连续摇动的温育烘箱中。测量葡萄糖以监测其消耗。在包含三异丙基苯的情况下没有观察到葡萄糖消耗方面的显著抑制。正下方表5指出了结果。如可观察到的,添加异丙基基团形成了显著的影响。该影响归因于丙基基团的存在。
表5:用于1,3,5-三异丙基苯的葡萄糖含量
时间(小时) | 葡萄糖(克/升,gpl) |
0 | 29 |
6 | 25 |
11 | 20 |
16 | 12 |
24 | 1 |
实例7:在1,3,5-三异丙基苯和水之间的异丁醇分配
在实例中,在样品瓶中,将五点二克(5.2g)三异丙基苯(Sigma-Aldrich,试剂级)和包含浓度为二点四重量百分比(2.4重量%)的异丁醇的水性溶液合并。将1,3,5-三异丙基苯和水性溶液充分混合并离心以彼此分成有机层和水层。如标题为“异丙醇产生的确认”的部分中所述,使用气相色谱法分析得自有机层,即包含1,3,5-三异丙基苯的层的样品。该分析指出有机层包含一点一八重量百分比(1.18重量%)异丁醇。如标题为“异丁醇产生的确认”的部分中所述,使用高压液相色谱(HPLC)分析得自水层的样品。该分析指出水层包含一点八四重量百分比(1.84重量%)异丁醇。由有机层和水层的重量百分比计算质量分配系数,所述质量分配系数为零点六四(0.64)。
实例8:在1,3,5-三异丙基苯/百里酚共混物和水之间的异丁醇分配
在一个实例中,在样品瓶中将零点二五(0.25g)的百里酚(Sigma-AldrichCo.LLC(St.Louis,MO,USA),试剂级)与包含浓度为二点四重量百分比(2.4重量%)的异丁醇的十点二五克(10.25g)水性溶液以及四点七五克(4.75g)1,3,5-三异丙基苯合并。将百里酚、1,3,5-三异丙基苯和水性溶液充分混合并离心以形成有机层和水层。使用气相色谱分析得自有机层的样品。如标题为“异丁醇产生的确认”的部分中所述,有机层样品被测定为包含二点三零重量百分比(2.30重量%)异丁醇。使用HPLC分析得自水层的样品。如标题为“异丁醇产生的确认”的部分中所述,水层样品被测定为包含一点三七重量百分比(1.37重量%)异丁醇。由有机层和水层的重量百分比计算质量分配系数,该质量分配系数为一点七零(1.70)。
在实施例中,百里酚表现出杀真菌特性。例如,百里酚可用于破坏酵母细胞,导致细胞裂解。在一些实施例中,百里酚表现出在1.5mM浓度下(MIC,最小抑制浓度)对酿酒酵母(SacchromycesCerevisiae)的体外抗真菌特性,然而MFC(最小真菌浓度)为1.8mM。百里酚的杀真菌特性的示例记录在Bennis等人,SurfaceAlterationofSacchromycesCerevisiaeInducedbyThymolandEugenol,38LettersinAppliedMicrobiology454-458(2004),其全文以引用方式并入本文。
百里酚可能是感兴趣的,因为其对水/丁醇/溶剂的分配系数(Kd)(例如,由水/丁醇/溶剂的平衡三元混合物计算)大于二十五(>25),并且相比之下,比BHT更少受阻。百里酚是天然存在的(百里香的主要提取剂)并且被认为是GRAS(通常识别为安全的)。其被用作非毒性驱昆虫剂。其可用作抗氧化剂。其还是抗菌的,但示出对酵母的等几率损害。在实施例中,重组微生物(诸如经基因修饰的丁醇菌)可在百里酚和/或COFA百里酚混合物存在下进化,故微生物可长得比天然存在于相同环境中的酵母或细菌更快。在诸如该实施例的实施例中,COFA百里酚混合物可表现出高Kd并且可作为氧化稳定的提取溶剂实施。百里酚的logP为3.3。因此,百里酚的生物相容性是足够的,所以在一些实施例中,百里酚包含在具有COFA的混合物中,其含量按体积计为或大约为或低于百分之十(10%)。在一些示例中,百分之十百里酚/COFA混合物具有四点八(4.8)的Kd。就比较结果而言,在按体积计百分之十(10%)下的一些百里酚/COFA混合物表现出为或大约为三(3)的Kd。因此,相比于百里酚/玉米油,百里酚/COFA表现出相对于Kd的更大协同性。
实例9:四丁基脲的生物相容性
在两个125ml烧瓶中,各自添加二十毫升(20ml)包含浓度为二十八克每升(28g/L)的葡萄糖的水性培养基,以及经基因修饰的异丁醇菌酵母菌株(PNY2310)的0.5OD悬浮液。将十毫升(10ml)体积的四丁基脲(TokyoChemicalInsdustryCo.,估计的logP为六点六(6.6))添加到烧瓶中的一个的含水悬浮液的顶部上。将这些烧瓶放置在控制为三十二摄氏度(32℃)并且连续摇动的温育烘箱中。通过测量葡萄糖浓度监测生长。在两个烧瓶之间没有观察到显著差异。结果示于正下方的下表6中。
表6:在四丁基脲的存在/不存在下所生长的异丁醇菌的葡萄糖浓度
实例10A:在四丁基脲和水之间的异丁醇分配
在样品瓶中,将包含浓度为二点零重量百分比(2.0重量%)的异丁醇(Sigma-AldrichCo.LLC(St.Louis,MO,USA),试剂级)的五克(5g)水性溶液和二点五(2.5g)四丁基脲(TokyoChemicalInsdustryCo.,其中估计的logP为六点六(6.6))合并。将液体完全混合,然后离心以分成有机层和水层。通过HPLC分析水层的样品并发现包含零点四一七重量百分比(0.417重量%)异丁醇并通过质量平衡计算有机层包含三点零六重量百分比(3.06重量%)异丁醇。质量分配系数被计算为七点三五(7.35)。
实例10B:在异十二烷/四丁基脲共混物和水之间的异丁醇分配
在样品瓶中,将包含浓度为二点零重量百分比(2.0重量%)的异丁醇(Sigma-AldrichCo.LLC(St.Louis,MO,USA),试剂级)的三克(3g)水性溶液、一点五克(1.5g)异十二烷(异构体的AlfaAesar工业混合物,其中估计的logP为六点二(6.2))以及一点五克(1.5g)四丁基脲(TokyoChemicalInsdustryCo.,其中估计的logP为六点六(6.6))合并。将液体完全混合,然后离心以分成有机层和水层。通过HPLC分析水层的样品并发现包含零点四六重量百分比(0.46重量%)异丁醇并通过质量平衡计算有机层包含一点五三重量百分比(1.53重量%)异丁醇。质量分配系数被计算为三点三三(3.33)。对于异十二烷和水之间的异丁醇分配也参见实例5B。
实例11A:2,6,8-三甲基-4-壬醇(异十二烷)和水之间的异丁醇分配
在样品瓶中,将包含浓度为二点零重量百分比(2.0重量%)的异丁醇(Sigma-AldrichCo.LLC(St.Louis,MO,USA),试剂级)的五克(5g)水性溶液和二点五(2.5g)2,6,8-三甲基-4-壬醇(Pfaltz&Bauer,Inc.(Waterbury,CT))合并。将液体完全混合,然后离心以分成有机层和水层。通过HPLC分析水层的样品并发现包含零点五三重量百分比(0.53重量%)异丁醇并通过质量平衡计算有机层包含二点八重量百分比(2.87重量%)异丁醇。质量分配系数被计算为五点四二(5.42)。
实例11B:异十二烷/2,6,8-三甲基-4-壬醇共混物和水之间的异丁醇分
配
在样品瓶中,将包含浓度为二点零重量百分比(2.0重量%)的异丁醇(Sigma-AldrichCo.LLC(St.Louis,MO,USA),试剂级)的五克(5g)水性溶液、四点五克(4.5g)异十二烷(异构体的AlfaAesar工业混合物,其中估计的logP为六点二(6.2))以及零点五(0.5g)2,6,8-三甲基-4-壬醇(Pfaltz&Bauer,Inc.(Waterbury,CT))合并。将液体完全混合,然后离心以分成有机层和水层。通过HPLC分析水层的样品并发现包含一点三三重量百分比(1.33重量%)异丁醇并通过质量平衡计算有机层包含二点二八重量百分比(2.28重量%)异丁醇。质量分配系数被计算为一点七一(1.71)。对于异十二烷和水之间的异丁醇分配也参见实例5B。
实例12:三(2-乙基己基)磷酸盐的生物相容性
在125ml烧瓶中,添加二十毫升(20ml)包含浓度为十七克每升(17g/L)的葡萄糖的水性培养基,以及乙醇红酵母菌株的一点一(1.1)OD悬浮液。将十毫升(10ml)体积的三(2-乙基己基)磷酸酯(Sigma-AldrichCo.LLC(St.Louis,MO,USA),试剂级,其中估计的logP为十点一(10.1))添加到含水悬浮液的顶部上。将烧瓶放置在控制为三十二摄氏度(32℃)并且连续摇动的温育烘箱中。通过测量葡萄糖监测生长。没有观察到葡萄糖消耗方面的显著抑制。结果记录在表7中,在正下方再现。
表7:用于三(2-乙基己基)磷酸酯的葡萄糖含量
时间(小时) | 葡萄糖(克/升,gpl) |
0 | 17 |
2.5 | 11.5 |
5 | 0 |
实例13:在三异丁烯和水之间的异丁醇分配
在样品瓶中,将包含浓度为两点零重量百分比(2.0重量%)异丁醇的五克(5g)水性溶液和五克(5g)三异丁烯(TokyoChemicalInsdustryCo.)合并。将液体完全混合,然后离心以分成有机层和水层。通过HPLC分析水层的样品并发现包含一点五三重量百分比(1.53重量%)异丁醇并通过质量平衡计算有机层包含零点四七重量百分比(0.47重量%)异丁醇。质量分配系数被计算为零点三一(0.31)。对于不同条件下的该***还参见实例4。
实例14:在三丁基磷酸酯和水之间的异丁醇分配
在样品瓶中,将包含浓度为两点零重量百分比(2.0重量%)异丁醇的五克(5g)水性溶液和二点五克(2.5g)三丁基磷酸酯(Sigma-AldrichCo.LLC(St.Louis,MO,USA),试剂级)合并。将液体完全混合,然后离心以分成有机层和水层。通过HPLC分析水层的样品并发现包含零点三三重量百分比(0.33重量%)异丁醇并通过质量平衡计算有机层包含三点二二重量百分比(3.22重量%)异丁醇。质量分配系数被计算为九点八(9.8)。
实例15:在DEET和水之间的异丁醇分配
在样品瓶中,将包含浓度为两点零重量百分比(2.0重量%)异丁醇的一克(1g)水性溶液和零点五克(0.5g)DEET(Sigma-AldrichCo.LLC(St.Louis,MO,USA),试剂级)合并。将液体完全混合,然后离心以分成有机层和水层。通过HPLC分析水层的样品并发现包含零点三四重量百分比(0.34重量%)异丁醇并通过质量平衡计算有机层包含三点一七重量百分比(3.17重量%)异丁醇。质量分配系数被计算为九点二(9.2)。
实例16:在香芹酚和水之间的异丁醇分配
在样品瓶中,将包含浓度为两点零重量百分比(2.0重量%)异丁醇的五克(5g)水性溶液和二点五克(2.5g)香芹酚(Sigma-AldrichCo.LLC(St.Louis,MO,USA),试剂级)合并。将液体完全混合,然后离心以分成有机层和水层。通过HPLC分析水层的样品并发现包含零点二二重量百分比(0.22重量%)异丁醇并通过质量平衡计算有机层包含三点四二重量百分比(3.42重量%)异丁醇。质量分配系数被计算为十五点五(15.5)。
实例17:水在溶剂中的溶解度
以举例的方式,使用AspenPlus模拟软件(AspenTechnology,Inc.(Burlington,MA,U.S.A.))进行研究来比较三种溶剂。研究的溶剂为玉米油脂肪酸(COFA)、油醇和异月桂醇(ISOLAUR)。表3示出了在按重量计约百分之二(2重量%)丁醇存在下,在约三十二摄氏度(32℃)下,溶剂中的平衡水含量。
表8:不同溶剂的水含量
溶剂 | 水含量,重量% |
COFA | 0.84 |
油醇 | 1.5 |
ISOLAUR | 2.0 |
在该实例中,将有机溶剂、丁醇和水的混合物在压力下预热,然后蒸馏以从溶剂中去除丁醇。在所有情况下,溶剂中的丁醇浓度为按重量计约百分之二(2重量%)并且至换热器的进料温度为约三十二摄氏度(32℃)。在进入蒸馏单元之前,预热器的温度在介于九十摄氏度(90℃)和一百三十摄氏度(130℃)之间变化。感兴趣的变量是将混合物升温至预热温度所需的热负荷。如图9所示的结果展示,从所选择的溶剂中,进料中较高的水含量导致为达到给定温度的更大热需求。就每种组合物而言,水含量固定为表8中所示的其平衡值。在每种混合物中,丁醇和溶剂的质量相同。
就溶剂、水和丁醇的混合物中的给定溶剂而言,达到给定温度所需的热负荷对存在的含水量敏感。使用AspenPlus模拟软件进行单独的研究,从而将达到给定温度所需的热负荷示为三异丁烯、丁醇和水的混合物中的水含量的函数。在一百摄氏度(100℃)的固定换热器温度下,水含量从百分之零(0%)至约百分之三(3%)变化。料流中负载的附加水导致所需换热器负荷的增加,如图10所展示的。
实例的讨论
在实施例中,基础溶剂被选择为无水的,但其可不表现出足够的丁醇亲和力,例如异丁醇亲和力。这些实施例中的基础溶剂可被选择为具有过量生物相容性。溶剂的生物相容性可能与溶剂的logP值相关。在一些实施例中,优选形成溶剂的混合物,其中一种溶剂(例如基础溶剂或第一溶剂)表现出高生物相容性然而其它溶剂(例如第二溶剂)表现出其它特性(例如,对丁醇的高亲和力,表现出溶剂混合物中的协同效应),但其可表现出较低或差的生物相容性。可基于混合物的特性选择溶剂,所述混合物的特性不同于溶剂的那些特性或根据混合物中每种溶剂的摩尔比由形成混合物的溶剂的特性所预测的那些特性。就一些产生丁醇的生物体而言,六(6)或约六(6)的最大logP指示生物相容性,诸如对于丁醇菌(例如,经基因修饰以产生丁醇的微生物)的生物相容性。也就是说,就一些发酵体系而言,疏水性与生物相容性或毒性相关联。
logP为六(6)可对应于百万分之零点二(0.2ppm)或约百万分之零点二(0.2ppm)的水相中平衡的饱和溶剂浓度。在该浓度下,溶剂可充分分散在水相中以避免干扰糖(葡糖糖)至醇的微生物的代谢。将水相中的溶剂浓度增加至例如百万分之零点三(0.3ppm)或约百万分之零点三(0.3ppm)可对微生物产生醇的能力产生有害影响。另外,例如,如果溶剂具有对由微生物在发酵中所用的营养物资的高亲和力,则该溶剂可阻碍发酵。溶剂可通过干扰微生物膜(细胞膜)的完整性来阻碍微生物。增加水相中溶剂的浓度可影响膜的刚度,因为膜通常是亲油的并且包含甾醇。邻近微生物的溶剂的存在可增加细胞膜中的孔数,并影响糖、葡萄糖、产物醇、营养物质等中的一者或多者传输穿过细胞膜。如果一些溶剂以足够的浓度存在于水相中,则可影响细胞膜的修复速率。例如,实例6A和6B示出如何利用合适量的烷基取代可将芳族烃制成可生物相容的。发现logP低于6的二异丙基苯溶剂不是生物相容的。通过将另外的异丙基基团添加到芳环上,发现所得的logP大于6的三异丙基苯溶剂是生物相容的,例如与丁醇菌生物相容。
在实施例中,约六(6)的logP包括以下logP:5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2或6.3。如果logP远大于六(6),则在实施例中,可将不是生物相容的第二溶剂与基础溶剂共混以形成可生物相容的二元混合物。虽然描述了logP为六(6),但可以理解不同的微生物可具有对水相中溶剂存在的不同敏感度,这还可取决于溶剂的特性。例如,选择第二溶剂从而其表现出相比于第一溶剂的高产物醇亲和力(例如,高丁醇亲和力),但可表现出比第一溶剂低或差的生物相容性或作为生物相容性指标的疏水性。显然,可实现多种溶剂和/或定制溶剂混合物以平衡对于发酵产物等的生物相容性与亲和力。影响溶剂选择的其它特性包括但不限于,对水的亲和力、干燥度、溶解度、其分配系数、反应性、界面张力、粘度、沸点或凝固点。其它因素包括成本、密度、易燃性、对发酵产物的选择性、热稳定性等。在实例中,远大于六(6)包括6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9。在一些实例中,第二溶剂提供异常高的丁醇亲和力但可以不是无水的。感兴趣的是,令人惊奇地,一些溶剂混合物的含水量可随组成而非线性地变化,并且溶剂的任何线性组合的平衡含水量通常小于单独的平衡溶剂含水量的线性组合。溶剂的线性组合的logP可小于或不同于溶剂logP值的线性组合。溶剂的线性组合的Kd可不同于Kd值的线性组合。
在实施例中,溶剂的logP由溶剂、辛醇和水的平衡三元混合物按稀释条件下有机相中溶剂的摩尔浓度与水相中溶剂的摩尔浓度的比率来计算。在诸如这些实施例的实施例中,将五毫升(5ml)零点零零一(0.001)摩尔溶剂(例如第一溶剂或第二溶剂或溶剂混合物)的辛醇溶液混合并使其与三十毫升(30ml)水发生相平衡,取样,并且然后进行分析。
溶剂的logP可实验性地测定或通过特性评估来测定。二元混合物的logP可由单独溶剂logP值、摩尔组成和严格的非理想热力学特性混合模型来测量或计算。在一个实施例中,构建Aspen模型(AspenPlus模拟软件),该模型的特征在于通过DIPPR模型进行的纯组分特性估计和用于估计混合物的多组分相平衡的UNIFAC模型。应当理解“纯组分特性”一般是指单种溶剂的特性,该溶剂/组分不一定不含任何杂质。就大部分或所有溶剂而言,由Aspen模型计算的logP值良好地符合以实验方法确定的logP值。进行模拟以预测被引入到由辛醇和水的混合物形成的有机相和水相中的溶剂组分的平衡摩尔浓度。此外,可通过用异丁醇替换辛醇来估计异丁醇在各种溶剂混合物中的分配系数。在这些实施例中,将少量异丁醇引入到溶剂组分与水的混合物中。分配系数被计算为平衡有机相中异丁醇的质量浓度与平衡水相中异丁醇的质量浓度的比率。
三异丙基苯被确定为基础溶剂。其具有六点二(6.2)的估计的logP。测试三异丙基苯,并且发现与丁醇菌生物相容。三异丙基苯具有二百三十六摄氏度(236℃)的标准沸点和零点八五克每立方厘米(0.85g/cm3)的密度。
另外,异十二烷(2,2,4,6,6-五甲基庚烷)被确定为基础溶剂。异十二烷具有六点二(6.2)的估计的logP。发现经测试的异十二烷与丁醇菌生物相容。异十二烷具有一百七十七摄氏度(177℃)的沸点和零点七五克每立方厘米(0.75g/cm3)的密度。
另外,异十六烷(2,2,4,4,6,8-七甲基壬烷)被确定为基础溶剂。异十六烷具有八点零(8.0)的估计的logP并被预测为与丁醇菌生物相容。异十六烷具有二百四十摄氏度(240℃)的沸点和零点七八克每立方厘米(0.78g/cm3)的密度。
此外,玉米油三甘油酯(COTG)确定为基础溶剂。COTG具有22.0-24.0的估计的logP并被预测为可生物相容的。其具有0.9g/cm3的密度。
四丁基脲被确定为基础溶剂。四丁基脲具有六点六(6.6)的估计的logP。发现四丁基脲在测试时与丁醇菌生物相容。四丁基脲具有三百八十摄氏度(380℃)的沸点和零点九克每立方厘米(0.9g/cm3)的密度。四丁基脲具有对于异丁醇的高分配系数。其它具有低于六(6)但具有对于异丁醇的高分配系数的短链四烷基脲被认为是第二溶剂。
另外,双酚A被确定为第二溶剂。双酚A具有三点四(3.4)的估计的logP。
另外,DEET(二乙基间甲苯甲酰胺)被确定为第二溶剂。DEET具有二点零(2.0)的估计的logP。
此外,二叔戊基苯酚被确定为第二溶剂。二叔戊基苯酚具有五点九(5.9)的估计的logP。可将其它不受阻的烷基化苯酚用作第二溶剂。例如,二叔丁基苯酚具有4.9的估计的logP。百里香的油和牛至的油,甲基异丙基苯酚的两种异构体均可用作第二溶剂,并被认为是环境友好的。百里香的油和牛至的油具有三点三(3.3)的估计的logP。
样品溶剂混合物制备和提取的讨论
以下说明提供用于选择、制备以及使用溶剂混合物的取样技术、方式和方法。如应该理解的,本文所述的技术、方式和方法适用于本公开中所述的溶剂。然而,与二元溶剂混合物、多元溶剂混合物(三元、四元等)结合描述的方法可从本文所述的技术中获得有益效果。
在实施例中,从水性溶液诸如发酵液中提取醇的方法包括选择待包含在溶剂混合物中的溶剂。该选择可基于单独溶剂的特性(例如,所述溶剂的特性)。示例性特性包括但不限于疏水性(logP)、作为生物相容性指标的疏水性/logP、Kd、含水量等。虽然溶剂及其相应特性被单独地考虑,但在一些实施例中,选择包括确定溶剂,所述溶剂具有相比于表现出所述特性但在较小程度上表现或不利地表现出所述特性(例如,不优选的特性)的另一种溶剂,在特定方面(相对于待进行的提取)是有利的特性。不优选的特性的一个示例为当要从包含丁醇菌的发酵液中提取丁醇时,对丁醇菌是高度毒性的溶剂。在另一个实例中,如果将溶剂混合物用于提取丁醇,则识别第二溶剂,所述第二溶剂表现出高生物相容性来说明第一溶剂表现出相对较差的生物相容性,但也表现出有利特性诸如高Kd、低水分、对丁醇的高选择性。因此,可选择溶剂从而所得的溶剂混合物大致平衡,例如从而所述溶剂混合物总体表现出良好的特性,而不是强烈地表现出一种有利特性,然而弱地、差地或甚至不利地表现出其它相关特性。
另外,虽然选择可包括单独地考虑每种溶剂和/或每种溶剂的特性,但这可在待包含于溶剂混合物中的其它溶剂的框架内进行。当确定待选择的溶剂时,可考虑单种溶剂的化学结构。例如,可将“相似相溶”规律应用于从识别的溶剂中选择溶剂。换句话说,待包含于溶剂混合物中的溶剂的选择可包括考虑单种溶剂的化学结构。还可使用其它方法,例如包括具体官能团、化学特性(例如对、邻、间取代基)等。例如,因为两种溶剂均在其对应的主链上具有芳族结构,所以选择两者。另外的示例包括选择两种溶剂,因为两者均为脂族和支链的。
在一些实施例中,化学结构是在考虑溶剂特性之前要满足的阈值标准。在其它实施例中,化学结构可与识别溶剂和/或溶剂特性并行考虑。例如,可选择待包含在二元溶剂混合物中的两种溶剂,因为当考虑总体是基本上平衡的或平衡的时,它们具有大致相似的结构,以及其相应的特性。基本上平衡的溶剂混合物的示例为强烈地或在可接受程度内表现出“有利”的特性,同时避免或在耐受性水平内表现出不利的特性的两种或更多种溶剂。耐受性水平的示例可以为表现出高Kd但在对预定条件组而言耐受性水平内溶剂化水(例如是湿的)的溶剂组合物。
在一些具体实施中,计算***被构造成用于通过基于其相应特性和/或化学结构识别溶剂来选择溶剂。在诸如这些示例的示例中,可将计算***编程从而以单种溶剂为基础比较与各种溶剂相关联的特性,从而识别表现出有利于溶剂混合物的特性的溶剂。
所述方法还可包括设定待包含在溶剂混合物中的溶剂的比率的极限。例如,疏水性可用作对第一溶剂与第二溶剂的比率的极限,以确定第一溶剂与第二溶剂的比率极限。在先前的示例中,疏水性可用作生物相容性的指标或“替代物”。因此,在实施例中,设定极限从而溶剂混合物中的溶剂的比率不超过所述极限,从而是对产生发酵产物(例如待提取的产物醇)的微生物有毒性的或生物不相容的。在一些情况下,设定极限从而溶剂混合物仅略具毒性或具有最少的毒性,以适应在其它方面表现出有利特性的溶剂。在一些情况下,当考虑每种溶剂在溶剂混合物中的摩尔分数时,溶剂混合物的疏水性不由溶剂混合物的组成溶剂的疏水性的线性组合表示。
换句话讲,溶剂混合物的疏水性(用作生物相容性的指标)可用于设定待包含在混合物中的溶剂的比率极限。例如,溶剂A与溶剂B的比率极限设定为六(6)或基本上为六(6)的logP,从而溶剂A与溶剂B的混合物对存在于发酵液中的丁醇菌不具有毒性。在一些实施例中,溶剂混合物的疏水性用作极限,因为溶剂混合物的疏水性表现出协同效应。换句话说,疏水性是当溶剂A和溶剂B混合以形成溶剂混合物时,表现出协同效应的特性(例如,以有利的方式影响)。虽然本文描述了logP为六(6),但本领域的技术人员将会知道产生醇的微生物的一些菌株表现出可以想到的不同的耐受性水平。
在一些实施例中,所述方法还包括确定在所述极限内的溶剂的比率。例如,确定待包含在溶剂混合物中的第一溶剂和第二溶剂的实际比率以平衡溶剂混合物的总体特性,只要确定的比率在极限内即可,即对发酵液中的微生物不具有毒性。以这种通用方式,溶剂混合物中的溶剂的比率可被定制成表现出至少一种协同效应,只要确定的比率对微生物不具有毒性即可。协同特性可不由形成溶剂混合物的溶剂的线性组合表示。换句话讲,当考虑其在溶剂混合物中的摩尔分数时,溶剂混合物的有利特性的程度不由第一溶剂和第二溶剂的相应特性的线性组合表示(对于两种溶剂混合物而言)。例如,以有利的方式,溶剂混合物的Kd不同于可分别基于第一溶剂和第二溶剂的Kd所预期的Kd。在前述实例中,一般示出了其中对于两种溶剂混合物而言,一种溶剂表现出比另一种溶剂的Kd对溶剂混合物的Kd影响大的情况。这些原理可施用于具有多于两种溶剂的溶剂混合物。在三元溶剂混合物中,单种溶剂的Kd(为清楚起见溶剂A、B和C)可具有不同的影响。因此,溶剂A的Kd和溶剂B的Kd可具有比溶剂C的Kd即溶剂C的Kd成比例大的对溶剂混合物的Kd的影响。在其它三元溶剂混合物中,单独考虑时,溶剂A的水分可具有比溶剂B和C的水分大的对溶剂混合物的水分的影响。另外的实例包括但不限于醇选择性、作为生物相容性指标的疏水性、毒性/生物相容性(直接表示)等。
在实施例中,通过以确定的比率将组成溶剂混合来合并所选择的溶剂,从而所得的溶剂混合物被平衡并表现出至少一种协同醇提取特性,所述特性不由溶剂特性的线性组合表示并且有利于待进行的提取。在另外的实施例中,溶剂混合物表现出多于一种协同特性。
通过合并溶剂获得的溶剂混合物可与水性溶液接触以将水中存在的醇提取到溶剂/有机相中。例如,溶剂混合物与发酵液接触,除了其它组分之外,该发酵液还可包含水、丁醇、丁醇菌微生物、营养物质等。
任选地,可将添加剂掺入到溶剂混合物中。示例性添加剂包括但不限于下列中的一种或多种:抗氧化剂、抗微生物剂、被包含以改变溶剂混合物的特性的添加剂(例如“盐”)等。
任选地,在实施例中,所述方法还包括维持溶剂混合物从而其表现出预定的特性。例如,添加附加溶剂混合物以调节其在发酵体系中的浓度,添加附加量的组成溶剂等。
在实施例中,用于干燥提取剂的方法包括使第一溶剂与发酵液接触以从发酵液中提取醇。例如,无水溶剂或溶剂混合物与通过外部环路从发酵罐泵送的发酵液接触以提取醇。一般来讲,与其它溶剂(包括溶剂混合物)类似,第一溶剂和/或第二溶剂可以逆流提取构造来实施。除了提取醇之外,在贫发酵液返回到发酵罐之前,第一溶剂还可增溶至少一些来自发酵液的水。富溶剂,例如包含醇的提取剂现在还包含水。在本实施例的实例中,通过使包含醇和水的第一溶剂与第二溶剂接触来去除水。所述提取可在不存在发酵液的情况下进行,因为第二溶剂可能被发酵液中的水淹没。这些实施例中的第二溶剂为表现出对水的高亲和力的无水溶剂。前述实施例中的第二溶剂可以为亲水性溶质,如上所述。例如,在将包含醇的溶剂混合物转移用于蒸馏之前,使用甘油以从溶剂混合物中提取水。从富溶剂中提取水可避免与从产物醇和溶剂中蒸馏部分水相关联的缺点。示例性缺点包括但不限于当将水/溶剂/醇彼此分离时可经历的增加的体积、增加的能量消耗、蒸馏/分离的考虑。可进行从富溶剂中去除水,因为溶剂可能重新用于后续提取。
如本领域技术人员将会知道的,溶剂干燥法、技术和方法可利用溶剂混合物来实施,换句话讲,第一溶剂包含如该整个文档中所描述的溶剂混合物。虽然在确定用作无水溶剂或第二溶剂的溶剂时,可考虑多种第一溶剂和第二溶剂的特性,但这些特性通常反映被认为与溶剂混合物中的第一溶剂和第二溶剂有关的那些特性。
实例和单种溶剂对溶剂混合物的影响的进一步讨论
提供以下讨论以进一步描述单种溶剂的特征。通过选择如下溶剂,可将单种溶剂的特性用于定制溶剂混合物,所述溶剂表现出有利于丁醇提取但不由第一溶剂和第二溶剂各自相对于所述溶剂在溶剂混合物中的摩尔分数的特性的线性组合表示的特性。
现在参见图11A,示出了对单种溶剂可如何表现出有利的特性进行讨论的示意图。该示意图使用Aspen模型软件产生,如在本文档的各种位置处所述的。在该实施例中,将异十二烷添加到COFA中以改善溶剂混合物的干燥度。例如,即使向COFA中添加少量异十二烷也能够减少溶剂混合物中的含水量。因此,调节COFA对异十二烷的摩尔浓度以非线性方式,例如以对待进行的提取有利的方式协同影响所得的溶剂混合物的含水量。如图所示,虚线示出预期COFA和异十二烷将如何基于两者的线性组合相对于含水量表现,然而实(曲)线指示溶剂混合物中异十二烷的浓度增加影响溶剂混合物中含水量的程度,直至溶剂混合物为以摩尔计百分之一百(100%)的异十二烷。如可见的,就用于从发酵液中提取醇而言,异十二烷的浓度增加至最多约百分之七十(70%)可改善溶剂混合物(COFA和异十二烷)的干燥度,其超过单独的COFA的干燥度。虽然按摩尔浓度计最高至百分之七十(70%)的异十二烷浓度示出较低的含水量(非线性行为),但应该认识到可在更低浓度下实施异十二烷。
现在参见图11B和11C,这些图示出相比于不同摩尔浓度来示出Kd以示出两种相似溶剂(异十二烷和异十二烷醇)的影响。实例11B的混合物表现出比可由线性组合所预期的高的丁醇亲和力。在一些实例中,异十二烷和异十二烷醇的溶剂混合物表现出与其它溶剂混合物的线性组合相比较不相似的线性组合。例如,11C所示的四叔丁基脲与异十二烷的溶剂组合物可基本上表现出相似的线性组合,然而,相比较而言,关于Kd,异十二烷和异十二烷醇以较不理想或不理想的方式表现。
参见图12,在实施例中,一些溶剂不表现出预期的在例如Kd和疏水性之间的折衷。例如,烷基苯酚和烷基脲不遵循用于丁醇提取的在Kd和logP之间的预期折衷。也就是说,相比于所述溶剂的疏水性(如通常对于有机溶剂所预期的),这些溶剂不表现出丁醇分布平衡分配方面的下降。线(例如,标题为“总体折衷”的曲线)使用标准技术由溶剂的数据点来图示确定,所述溶剂确实表现出logP和各种溶剂的丁醇分配系数之间的这种关系,如可以观察到的。还可知,百里酚、磷酸三丁酯、和四丁基脲表现出水相和溶剂相之间的高丁醇分布平衡分配,然而具有比预期更高的logP。因此,这些溶剂中的一种或多种甚至以低浓度包含在溶剂混合物中,这可增加混合物的丁醇亲和力,所述亲和力超过由这些溶剂中的一种和共溶剂(第二溶剂)的线性组合所表示的亲和力。对于毒性(生物相容性)等存在类似实例(请参见图12)。
现在参见图13,该图是相比于各种溶剂的logP,对沸点的说明。如图所示,即使其具有相同的碳原子数,但不同溶剂表现出不同的沸点/疏水性。这些logP至沸点的差异可用于定制溶剂混合物的特性以优化有利的特性,同时使不利的特性最小化或消除。沸点和/或疏水性的差异可归因于溶剂的结构,包括但不限于直链的、芳族、取代基的取向、脂族等。值得注意的是,百里酚表现出低沸点和低毒性,这由其约二百三十摄氏度(230℃)的沸点和其约三点三(3.3)的logP表示。此外,百里酚一般被认为是环境友好的并且因为其普遍存在于百里香中而容易获得。
现在参见图14,该图是百里酚分别占玉米油和1,3,5-三异丙基苯的不同摩尔浓度的示意图。如可以观察到的,当与玉米油一起混合在两种溶剂体系中时,玉米油/百里酚的logP通过加入约百分之一摩尔百里酚而从约十八(19)的高logP减小至约六(6)的logP,这指示以不利方式的非线性关系。虽然百里酚表现出高丁醇分配平衡分配,同时具有比对于其化学结构所预期的更高的logP,但一些实验指示百里酚/玉米油的混合物表现出差的总体特性,因为百里酚/玉米油混合物的Kd下降至约四(4)的logP。一些潜在的结构影响包括但不限于玉米油和百里酚之间的化学结构的差异(例如,直链相对于具有邻/对取代基的芳族化合物)等。一般来讲,结构上相异的溶剂被认为是不利的,因为其不遵循相似相溶规律。
相比之下,虽然结构相似,但1,3,5-三异丙基苯和百里酚(两者均包括芳族结构和丙基基团)示出当百里酚的摩尔浓度增加时(示出最高至10%百里酚),logP的相对小的变化。也就是说,1,3,5-三丙基苯和百里酚以线性方式但以有利的方式作用。因此,虽然单独表现出低logP,但与三丙基苯合并时,百里酚不示出由不遵循相似相溶规律的玉米油/百里酚混合物所示的显著的logP变化。百里酚和1,3,5-三异丙基苯的行为可能是因为两者均包括芳族结构并具有丙基基团。
从本说明书的角度来看,本公开的实施例的另外变型和更改对本领域的技术人员将是显而易见。有时,所述方法可结合被构造成进行方法或方法的一部分的计算***来实施。在如此的情况下,计算***可以是被编程以进行方法或步骤的通用计算机。显然,方法可按以计算机可读介质,例如有形的、非暂态介质体现的一套说明书来实施。另外,根据本公开的计算***可以多种方式提供输出,包括但不限于,显示信息、被构造成以特定方式控制设备(例如,发酵或提取装置)等。因此,应当理解,本发明不受计算***中的这些示例性布置和/或硬件限制。因此,本说明应理解为仅作为解释说明,并且出于教导本领域技术人员实施所述方法、方式、装置、设备、***等的目的。应当理解,本文所示并描述的本发明的形式被视为目前优选的实施例。可进行部件的形状、尺寸和布置的各种改变。例如,等同的元件可替代本文所示和所述的那些,并且本发明的某些特征结构可独立于其它特征结构的用途而使用,在具有本说明书的有益效果之后,其全部对本领域技术人员将是显而易见的。
Claims (82)
1.一种用于从发酵培养基中回收丁醇的方法,所述方法包括:
a)提供发酵培养基,所述发酵培养基包含丁醇、水、以及含有丁醇生物合成途径的重组微生物,其中所述重组微生物产生丁醇;
b)使所述发酵培养基与包含无水溶剂的与水不混溶的有机提取剂组合物接触以形成水相和含丁醇的有机相;以及
c)从所述含丁醇的有机相中回收丁醇。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述无水溶剂为烃。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述烃为C7至C22烷烃或它们的混合物。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述C7至C22烷烃为支链的C7至C22烷烃。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述烃为异丁醇的衍生物。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述异丁醇的衍生物为三异丁烯、二异丁烯、四异丁烯、异辛烷、异十六烷、3,4,5,6,6-五甲基-2-庚醇、或异十二烷。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述异丁醇的衍生物为异十二烷。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述有机提取剂组合物与所述发酵培养基的接触在发酵罐中发生。
9.根据权利要求1所述的方法,所述方法还包括将所述发酵培养基的一部分从发酵罐转移到容器,其中所述有机提取剂组合物与所述发酵培养基的接触在容器中发生。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述有机提取剂组合物还包含第二溶剂,其中所述第二溶剂为C4至C22脂肪醇、C4至C28脂肪酸、C4至C28脂肪酸的酯、C4至C22脂肪醛、C7至C22醚、磷酸酯、酰胺、脲、苯酚、次膦酸酯、氨基甲酸酯、磷酰胺、氧化膦、水杨酸酯、对羟基苯甲酸酯、或它们的混合物。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述有机提取剂组合物还包含第二溶剂,其中所述第二溶剂包含下列中的至少一种:油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、肉豆蔻醇、硬脂醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、辛酸、癸酸、十一烷酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、1-壬醇、1-癸醇、2-十一醇、1-壬醛、十一烷醇、十一烷醛、异十二烷醇、2,6,8-三甲基-4-壬醇、月桂醛、2-甲基十一醛、油酰胺、亚油酰胺、棕榈酸酰胺、硬脂酰胺、2-乙基-1-己醇、2-己基-1-癸醇、2-辛基-1-十二烷醇、3,4,5,6,6-五甲基-2-庚醇、或它们的混合物。
12.根据权利要求10或11所述的方法,其中所述第二溶剂增加所述有机提取剂组合物的丁醇分配系数。
13.根据权利要求1所述的方法,其中所述回收的丁醇具有约30克每升至约80克每升的所述发酵培养基的有效滴度。
14.根据权利要求1所述的方法,其中所述回收的丁醇具有至少50克每升的所述发酵培养基的有效滴度。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法,其中所述丁醇为异丁醇。
16.一种组合物,所述组合物包含与水不混溶的有机提取剂组合物中的丁醇,其中所述有机提取剂组合物包含溶剂,其中所述溶剂为无水溶剂。
17.根据权利要求16所述的组合物,其中所述无水溶剂为烃。
18.根据权利要求17所述的组合物,其中所述烃为C7至C22烷烃或它们的混合物。
19.根据权利要求18所述的组合物,其中所述C7至C22烷烃为支链的C7至C22烷烃。
20.根据权利要求17所述的组合物,其中所述烃为异丁醇的衍生物。
21.根据权利要求20所述的组合物,其中所述异丁醇的衍生物包括下列中的至少一种:三异丁烯、二异丁烯、四异丁烯、异辛烷、异十六烷、3,4,5,6,6-五甲基-2-庚醇、或异十二烷。
22.根据权利要求21所述的组合物,其中所述异丁醇的衍生物为异十二烷。
23.根据权利要求16所述的组合物,其还包含第二溶剂,其中所述第二溶剂为C4至C22脂肪醇、C4至C28脂肪酸、C4至C28脂肪酸的酯、C4至C22脂肪醛、C7至C22醚、磷酸酯、酰胺、脲、苯酚、次膦酸酯、氨基甲酸酯、磷酰胺、或它们的混合物。
24.根据权利要求16所述的组合物,其还包含第二溶剂,其中所述第二溶剂包含下列中的至少一种:油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、肉豆蔻醇、硬脂醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、辛酸、癸酸、十一烷酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、1-壬醇、1-癸醇、2-十一醇、1-壬醛、十一烷醇、十一烷醛、异十二烷醇、三甲基壬醇、五甲基庚醇、2,6,8-三甲基-4-壬醇、月桂醛、2-甲基十一醛、油酰胺、亚油酰胺、棕榈酸酰胺、硬脂酰胺、2-乙基-1-己醇、2-己基-1-癸醇、2-辛基-1-十二烷醇、3,4,5,6,6-五甲基-2-庚醇、或它们的混合物。
25.根据权利要求16-24中任一项所述的组合物,其中所述丁醇为异丁醇。
26.根据权利要求2所述的组合物,其中所述烃为芳族烃。
27.一种从水性溶液中提取醇的方法,所述方法包括:
A)通过基于第一溶剂和第二溶剂的相应特性识别第一溶剂和第二溶剂来选择待被包含在溶剂混合物中的溶剂,其中所述第一溶剂和所述第二溶剂具有相似的化学结构;
B)基于溶剂混合物的疏水性,设定待包含在所述溶剂混合物中的所述第一溶剂与所述第二溶剂的比率的极限,其中所述溶剂混合物的疏水性不由所述第一溶剂的疏水性和所述第二溶剂疏水性的线性组合表示;
C)确定待包含在溶剂混合物中的所述第一溶剂与所述第二溶剂的比率在所述极限内以平衡所述溶剂混合物的总体特性,从而所述溶剂混合物表现出至少一种协同特性,所述协同特性不由各自对应于所述至少一种协同特性的所述第一溶剂特性和所述第二溶剂特性的线性组合表示;以及
D)使包含所述醇的水性溶液与所述溶剂混合物接触以提取所述醇。
28.根据权利要求27所述的方法,其中对于在辛醇存在下的所述第一溶剂与水的三元混合物而言,所述第一溶剂的疏水性是有机相中的第一溶剂的量除以水相中的第一溶剂的量的比率的以十为底的对数;其中对于在辛醇存在下的所述第二溶剂与水的三元混合物而言,所述第二溶剂的疏水性是有机相中第二溶剂的量除以水相中第二溶剂的量的比率的以十为底的对数;并且其中对于在辛醇存在下的溶剂混合物与水的混合物而言,所述溶剂混合物的疏水性是有机相中溶剂混合物的量除以水相中溶剂混合物的量的比率的以十为底的对数。
29.根据权利要求27所述的方法,其中疏水性包括生物相容性的指标。
30.根据权利要求27所述的方法,所述方法还包括针对待包含在溶剂混合物中的每种溶剂的相互整合的步骤A、B和C,以基于所述第一溶剂的特性、所述第二溶剂的特性、以及另外包含在所述溶剂混合物中的每种溶剂考虑所述溶剂混合物的累积特性。
31.根据权利要求27所述的方法,其中所述至少一种协同特性包括疏水性。
32.根据权利要求27所述的方法,其中疏水性表达为logP。
33.根据权利要求27所述的方法,其中所述至少一种协同特性包括所述溶剂混合物增溶水的能力。
34.根据权利要求27所述的方法,其中所述至少一种协同特性包括所述溶剂混合物在具有丁醇和水的混合物中的分配系数(Kd)。
35.根据权利要求27所述的方法,其中所述至少一种协同特性包括与产生醇的微生物的生物相容性。
36.根据权利要求31所述的方法,其中所述微生物包括经基因修饰的微生物。
37.根据权利要求36所述的方法,其中所述经基因修饰的微生物包括丁醇菌。
38.根据权利要求34所述的方法,其中所述第一溶剂或所述第二溶剂中的至少一者与所述丁醇菌基本上生物相容。
39.根据权利要求34所述的方法,其中所述第一溶剂与所述丁醇菌比所述第二溶剂与所述丁醇菌相对更生物相容,并且表现出比所述第二溶剂大的醇选择性。
40.根据权利要求27所述的方法,其中至少一种协同特性包括对于从所述水性溶液中提取营养物质的低亲和力。
41.根据权利要求36所述的方法,其中所述营养物质包括由微生物支持醇发酵的营养物质。
42.根据权利要求35所述的方法,其中所述丁醇菌包括具有被工程化从而相比于ABE方法产生高含量丁醇的生物合成途径的丁醇菌。
43.根据权利要求27所述的方法,其中所述水性溶液包含发酵液,所述发酵液包含经基因修饰以产生醇的微生物。
44.根据权利要求27所述的方法,其中所述醇包括杂醇。
45.根据权利要求27所述的方法,其中所述第一溶剂包含异丁醇的衍生物。
46.根据权利要求45所述的方法,其中所述异丁醇的衍生物包括下列中的至少一种:三异丁烯、二异丁烯、四异丁烯、异辛烷、异十六烷、或异十二烷。
47.根据权利要求27所述的方法,其中所述第二溶剂包含下列中的至少一种:C4至C22脂肪醇、C4至C28脂肪酸、C4至C28脂肪酸的酯、C4至C22脂肪醛、C7至C22醚、酰胺、磷酸酯、脲、苯酚(酚醛树脂)、次膦酸酯、氨基甲酸酯、磷酰胺、水杨酸酯、对羟基苯甲酸酯、或它们的混合物。
48.根据权利要求45所述的方法,其中所述第二溶剂包含下列中的至少一种:油醇、苯基醇、鲸蜡醇、月桂醇、肉豆蔻醇、硬脂醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、辛酸、癸酸、十一烷酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、1-壬醇、1-癸醇、2-十一醇、1-壬醛、1-十一烷醇、十一烷醛、异十二烷醇、2,6,8-三甲基-4-壬醇、月桂醛、2-甲基十一醛、油酰胺、亚油酰胺、棕榈酸酰胺、硬脂酰胺、2-乙基-1-己醇、2-己基-1-癸醇、2-辛基-1-十二烷醇、3,4,5,6,6-五甲基-2-庚醇、或它们的混合物。
49.根据权利要求27所述的方法,其中所述第二溶剂包含异丁醇的衍生物。
50.根据权利要求49所述的方法,其中所述异丁醇的衍生物包括3,4,5,6,6-五甲基-2-庚醇。
51.一种从水性溶液中提取醇的方法,所述方法包括:
将至少两种溶剂合并以形成溶剂混合物,所述溶剂混合物表现出不由特性的线性组合表示的协同醇提取特性,其中所述特性各自对应于所述至少两种溶剂,所述至少两种溶剂通过以下方法选择:
基于各自对应于所述至少两种溶剂的特性来识别所述至少两种溶剂,其中所述至少两种溶剂中的两种具有对应的化学结构;
基于每种溶剂的疏水性相对于所述溶剂混合物中的每种溶剂设定所述至少两种溶剂的比率的极限,其中所述溶剂混合物的疏水性不由包含在所述溶剂混合物中的每种溶剂的疏水性的线性组合表示;以及
以在所述极限内的比率将所述至少两种溶剂混合,以平衡所述溶剂混合物的总体特性,从而所述溶剂混合物表现出协同醇提取特性。
52.根据权利要求51所述的方法,所述方法还包括使包含醇的水性溶液与所述溶剂混合物接触以提取所述醇。
53.根据权利要求51所述的方法,其中所述协同醇提取特性包括所述溶剂混合物增溶水的能力。
54.根据权利要求51所述的方法,其中疏水性包括在所述至少两种溶剂或所述溶剂混合物中包含的至少一种溶剂在具有辛醇和水的混合物中的分配系数(logP)。
55.根据权利要求51所述的方法,其中所述协同醇提取特性包括所述溶剂混合物在具有丁醇和水的混合物中的分配系数(Kd)。
56.根据权利要求51所述的方法,其中所述溶剂混合物中的至少一种溶剂包括表现出与能够产生醇的微生物的良好生物相容性的无水溶剂,并且所述溶剂混合物中的至少一种溶剂包括对所述醇表现出高亲和力的溶剂。
57.根据权利要求51所述的方法,其中所述醇包括杂醇。
58.根据权利要求57所述的方法,其中所述杂醇包括丁醇。
59.根据权利要求58所述的方法,其中所述丁醇包括异丁醇。
60.根据权利要求51所述的方法,其中所述水性溶液包含发酵液,所述发酵液包含经基因修饰从而相比于ABE方法产生更多异丁醇的异丁醇菌。
61.根据权利要求51所述的方法,其中所述协同醇提取特性包括对由微生物消耗以产生醇的营养物质的差提取效率。
62.根据权利要求51所述的方法,其中疏水性包括生物相容性的指标。
63.根据权利要求51所述的方法,其中所述极限是对应于近似六(6)的logP的浓度。
64.根据权利要求51所述的方法,其中所述极限对应于水性溶液中溶剂混合物的浓度,所述浓度不足以明显地影响微生物的细胞膜的完整性。
65.一种干燥提取剂的方法,所述方法包括:
使包含含有丁醇生物合成途径的重组微生物以及经由所述丁醇生物合成途径产生的丁醇的发酵液与第一溶剂接触,以将所述丁醇的至少一部分提取到所述第一溶剂中;以及
使包含所述丁醇的至少一部分和至少一些发酵液中的水的所述第一溶剂与所述第二溶剂接触,以将所述第一溶剂中的水提取到所述第二溶剂中,从而干燥包含丁醇的所述第一溶剂。
66.根据权利要求65所述的方法,其中使所述第一溶剂与所述第二溶剂接触在不存在所述发酵液的情况下进行。
67.根据权利要求65所述的方法,其中所述第一溶剂包含溶剂混合物,所述溶剂混合物通过以下方法制备:
将至少两种溶剂合并以形成溶剂混合物,所述溶剂混合物表现出不由特性的线性组合表示的协同醇提取特性,其中所述特性各自对应于所述至少两种溶剂,所述至少两种溶剂通过以下方法选择:
基于各自对应于所述至少两种溶剂的特性来识别所述至少两种溶剂,其中所述至少两种溶剂中的两种具有对应的化学结构;
基于每种溶剂的疏水性相对于所述溶剂混合物中的每种溶剂设定所述至少两种溶剂的比率的极限,其中所述溶剂混合物的疏水性不由包含在所述溶剂混合物中的每种溶剂的疏水性的线性组合表示;以及
以在所述极限内的比率将所述至少两种溶剂混合,以平衡所述溶剂混合物的总体特性,从而所述溶剂混合物表现出协同醇提取特性。
68.根据权利要求67所述的方法,其中所述协同醇提取特性包括所述溶剂混合物阻隔水的能力。
69.根据权利要求67所述的方法,其中疏水性包括在所述至少两种溶剂或所述溶剂混合物中的至少一种溶剂在具有辛醇和水的混合物中的分配系数(logP)。
70.根据权利要求67所述的方法,其中所述协同醇提取特性包括所述溶剂混合物在具有丁醇和水的混合物中的分配系数(Kd)。
71.根据权利要求67所述的方法,其中所述溶剂混合物中的至少一种溶剂包括表现出与能够产生醇的微生物的良好生物相容性的无水溶剂,并且所述溶剂混合物中的至少一种溶剂包括对所述醇表现出高亲和力的溶剂。
72.根据权利要求67所述的方法,其中所述醇包括杂醇。
73.根据权利要求72所述的方法,其中所述杂醇包括丁醇。
74.根据权利要求73所述的方法,其中所述丁醇包括异丁醇。
75.根据权利要求67所述的方法,其中所述协同醇提取特性包括对由微生物消耗以产生醇的营养物质的差提取效率。
76.根据权利要求67所述的方法,其中疏水性包括生物相容性的指标。
77.根据权利要求67所述的方法,其中所述极限是对应于约六(6)的logP的浓度。
78.根据权利要求67所述的方法,其中所述极限对应于所述水性溶液中溶剂混合物的浓度,所述浓度不足以明显地影响微生物的细胞膜的完整性。
79.根据权利要求65所述的方法,其中所述第二溶剂包含亲水性溶质。
80.根据权利要求65所述的方法,其中所述第二溶剂包含甘油。
81.根据权利要求66所述的方法,其中使所述第一溶剂与所述第二溶剂接触以逆流提取方式进行,所述逆流提取在所述第一溶剂与所述发酵液接触之后进行。
82.根据权利要求67所述的方法,其中所述第一溶剂包括无水溶剂。
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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