CN105219880B - 文心兰属est-ssr标记引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种文心兰属EST‑SSR标记引物及其应用，所述引物包括引物对：5'‑ATCGTAATCCTGAAGCGTATC‑3'；5'‑AAGCCCAAACTATTCCATT‑3'等等；文心兰属EST‑SSR标记引物的应用方法如下：以从文心兰属植物中提取的DNA样品为模板进行PCR扩增，对文心兰分子进行标记，反应体系：反应体系的总体积为20μl，含有ddH₂O 11.3μL，10×Buffer 2μL，2.5mmol·L^‑1的dNTPs 2μL，引物对中的两引物各1μL 10μmol·L^‑1，5U·μL^‑1的Taq聚合酶0.2μL，20ng/μL的模板DNA 2.5μL。

Description

文心兰属EST-SSR标记引物及其应用

技术领域

本发明具体涉及一种文心兰属EST-SSR标记引物及其应用。

背景技术

文心兰(Oncidium)，又名跳舞兰，是一种重要的盆切两用花卉，作为商品洋兰在世界花卉市场占有一定的份额。文心兰自被发现以来发展迅速，在泰国、新加坡、马来西亚等多个国家大规模生产。广义的文心兰是文心兰属及其近缘属的总称，现代栽培品种均是文心兰属种间及亚族内近缘属间杂交培育而成，遗传背景非常复杂，因此，研究其遗传多样性具有重要意义。我国从20世纪90年代开始，在广东、海南、福建等地大力发展文心兰产业。目前，我国对文心兰的研究主要集中在文心兰组织培养快繁、栽培技术、生物学观察、花期调控、染色体研究等方面，而对遗传多样性研究的报道较少。

简单序列重复(SSR)标记因具有数量丰富，多等位基因，可提供的信息量高以及呈共显性等特点，被广泛用于植物遗传、进化、育种等研究中，但其开发费用较高。表达序列标签微卫星(EST-SSR)是一种基于表达序列标签的简单序列重复设计的新型分子标记，具多态性高、共显性遗传、重复性好、开发成本低等优点，且其来自基因组的编码区，与功能基因紧密连锁，更容易获得基因表达的信息。各种植物中约有1％-5％的EST含有可用于建立标记的SSR，目前EST-SSR已在***、甘蔗、菊科等多种植物中得到应用。在兰科植物中也有EST-SSR分子标记开发的研究报道，主要集中于蝴蝶兰。但有关文心兰的应用研究还未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一，在于提供一种文心兰属EST-SSR标记引物。

本发明是这样实现的：一种文心兰属EST-SSR标记引物，包括用于文心兰属植物EST-SSR检测的十个引物对，具体为：

5'-ATCGTAATCCTGAAGCGTATC-3'，

5'-AAGCCCAAACTATTCCATT-3'；

5'-GGCCTCCTATAACGTCTTC-3'，

5'-TCTCCGATCCATATCAAAA-3'；

5'-GCCCGATGATGAAGAACG-3'，

5'-GGAAATGAGCTGCACAGA-3'；

5'-TTCGGCCATTAACGGTCC-3'，

5'-TGTGATTTCTTGGGGTGC-3'；

5'-AAAACTCCCACTTATCCAAA-3'，

5'-CCCTGTATTATCGCCGTAG-3'；

5'-CTGCACTGCTCCATAAAC-3'，

5'-ACTGAATAGATGCCTCCC-3'；

5'-GAGCGTGAGTTGTCCTTC-3'，

5'-GAGTCCTCTTTACCACCTTT-3'；

5'-TGTATCAGAGTGGGGTTT-3'，

5'-TGGTGAGATTCAGCATAGT-3'；

5'-ATTAGGGCTGTGGTAGGC-3'，

5'-TAGATTGAAGGCGAGTGC-3'；

5'-AAAATCTTACTCACCACCTCC-3'，

5'-GCATACTTTCCTCGCCAC-3'。

本发明要解决的技术问题之二，在于提供一种所述的文心兰属EST-SSR标记引物的应用。

本发明是这样实现的：一种所述的文心兰属EST-SSR标记引物的应用，以从文心兰属植物中提取的DNA样品为模板进行PCR扩增，对文心兰分子进行标记，其中，反应体系和反应程序如下：

反应体系：反应体系的总体积为20μl，含有ddH₂O 11.3μL，10×Buffer(含Mg²⁺)2μL，2.5mmol·L^-1的dNTPs 2μL，引物对中的两引物各1μL 10μmol·L^-1，5U·μL^-1的Taq聚合酶0.2μL，20ng/μL的模板DNA 2.5μL。

反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，退火温度48℃～54℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

本发明的优点在于：

(1)本发明的10个微卫星标记在30个文心兰种或品种中有多态性，在30个文心兰种或品种中进行的遗传多样性分析与文心兰属植物分类常识相吻合(图1)，是稳定存在的新标记，可以直接将本发明所提供的10个标记应用于更多文心兰属植物上，进行种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子标记辅助育种中。

(2)本发明的10个微卫星标记来自于文心兰花发育相关基因EST序列，为克隆文心兰属植物花发育相关基因、基因序列分析奠定了良好的基础。

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1是基于10个微卫星标记构建的30份文心兰属植物UPGMA聚类图。

图2是标记Htc12在30份文心兰材料中PCR扩增产物电泳结果。

图3是标记Htc24，Htc26的2.5％琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明10个文心兰EST-SSR标记引物对是通过下述方法得到的：

从NCBI中的EST数据库中下载文心兰EST序列，采用SSRIT在线软件结合人工搜索含有SSR位点的EST序列。搜索的标准为：二、三、四、五和六核苷酸基序的最小重复次数均为5次重复，依次检索各位点SSR位点信息。利用Primer 5.0软件设计PCR扩增引物，引物设计的主要参数为：引物长度为18～22bp；退火温度48℃～54℃；上下游引物退火温度之差不高于3℃；GC含量35％～60％；文心兰EST-SSR的PCR扩增产物预期片段在150～500bp之间。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

本发明提供10个文心兰属分子标记，10个分子标记引物的特征如表1所示：

表1 文心兰属EST-SSR标记的特征

用EST序列开发文心兰属SSR标记的具体操作方法如下：

一、DNA提取

(1)配制DNA提取缓冲液：2％CTAB，0.1MTris，20mMEDTA，1.4MNaCl，pH8.0和DNA溶解缓冲液TE：10MmTris；1MmEDTA；PH＝8.0。

本发明所用到的文心兰品种如表2所示：

表2 本发明实现方案中所用到的不同文心兰品种

(2)对文心兰材料进行如下处理：

a、用天平迅速称取约0.2g贮藏于-80℃冰箱中的文心兰嫩叶，用液氮于研钵中研磨。将粉末转入盛有600μlCTAB溶液(65℃预热)与12μlβ-巯基乙醇的1.5ml离心管中，摇匀；加入500μl氯仿/异戊醇(24:1)，混匀，12000rpm离心20min。

b、在上述步骤a离心后所得的上清液中加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀至DNA沉淀。10000rpm离心2min，去上清液。

c、用75％的乙醇清洗步骤b所得DNA沉淀物1次，用96％的乙醇清洗步骤b所得DNA沉淀物1次。

d、将上述步骤c洗涤后的DNA晾干并溶于50μl的TE缓冲液中，加入1μlRNAase酶(10mg/ml)去除RNA。

e、紫外分光光度法检测上述步骤d所得的DNA样品的浓度，1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。

二、SSR分析：

利用GeneBank公布的3183条文心兰属EST序列设计了20对引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，如表1所示；

1、PCR扩增

(1)20μl反应体系包含：

ddH₂O 11.3μL，10×Buffer(含Mg²⁺)2μL，2.5mmol·L-1的dNTPs 2μL，10μmol·L-1的上、下游引物各1μL，5U·μL-1的Taq聚合酶0.2μL，20ng/μL的模板DNA2.5μL。

(2)反应程序：

94℃预变性4min；94℃变性30s，退火温度(各引物对的具体退火温度见表1)退火30s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

2、电泳检测：

取上述扩增产物5μl在2.5％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下照相记录结果。

首先利用20对SSR引物对随机2个文心兰品种进行SSR分析，电泳检测有扩增产物的引物在30个不同文心兰品种(见表2)上进行相同条件的PCR扩增，扩增产物利用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，电泳结束后进行银染，染色参考Bassam等的方法。将显色后的凝胶扫描成像保存，根据统计每一样品扩增所产生的DNA条带数，记录各样品的DNA指纹带型，如果其扩增条带有带则记为1，若无带则记为0，并形成原始数据矩阵。应用DPS软件中的UPGMA法进行1、0数据***聚类，对30个文心兰材料进行遗传多样性分析，获得各样品的遗传距离矩阵及聚类图，如图1所示。参见图2，图2是标记Htc12在30份文心兰材料中PCR扩增产物电泳结果。发现有10个标记(即本发明所述标记引物SEQ ID NO：1-20，如表1所示)在30个不同文心兰品种上表现多态性，***树表明这10个标记能将30个不同文心兰品种分为7大类，这种分类与文心兰经典的形态学分类相符合，说明这10对引物可以用于文心兰种质资源遗传多样性分析和亲缘关系研究中。

采用福建省农科院花卉研究中心种质资源圃里9株形态存在变异的文心兰实生苗。通过改良CTAB法提取文心兰DNA，利用筛选的表1中10对EST-SSR引物对9个文心兰实生苗进行变异检测，采用上述方法进行实验。

其中，2.5％琼脂糖凝胶电泳实验如图3所示，本发明对9个文心兰样品进行检测，其结果是其中的8个引物共扩增出51条清晰带，各引物扩增出5-10条带不等，平均每条引物扩增出6.375条带。9个样品经扩增后均出现差异性条带，样品变异率为100％。

本发明对NCBI数据库中收录的3183条文心兰EST进行分析，开发了文心兰EST-SSR分子标记，并将其应用于30个文心兰品种资源的遗传多样性分析，经筛选，得到10个不同于前人的具有多态性的通用型标记。

本发明克服了现有技术中文心兰分子标记数量不足的缺点，提供一组用于文心兰属植物EST-SSR检测的引物，增加文心兰属分子标记的数量以应用于今后的育种工作中。

本发明的有益效果是：

(1)本发明的10个微卫星标记在30个文心兰种或品种中有多态性，在30个文心兰种或品种中进行的遗传多样性分析与文心兰属植物分类常识相吻合(图1)，是稳定存在的新标记，可以直接将本发明所提供的10个标记应用于更多文心兰属植物上，进行种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子标记辅助育种中。

(2)本发明的10个微卫星标记来自于文心兰花发育相关基因EST序列，为克隆文心兰属植物花发育相关基因、基因序列分析奠定了良好的基础。

Claims (2)

1.一种文心兰属EST-SSR标记引物，其特征在于：包括用于文心兰属植物EST-SSR检测的十个引物对，具体为：

5'-ATCGTAATCCTGAAGCGTATC-3'，

5'-AAGCCCAAACTATTCCATT-3'；

5'-GGCCTCCTATAACGTCTTC-3'，

5'-TCTCCGATCCATATCAAAA-3'；

5'-GCCCGATGATGAAGAACG-3'，

5'-GGAAATGAGCTGCACAGA-3'；

5'-TTCGGCCATTAACGGTCC-3'，

5'-TGTGATTTCTTGGGGTGC-3'；

5'-AAAACTCCCACTTATCCAAA-3'，

5'-CCCTGTATTATCGCCGTAG-3'；

5'-CTGCACTGCTCCATAAAC-3'，

5'-ACTGAATAGATGCCTCCC-3'；

5'-GAGCGTGAGTTGTCCTTC-3'，

5'-GAGTCCTCTTTACCACCTTT-3'；

5'-TGTATCAGAGTGGGGTTT-3'，

5'-TGGTGAGATTCAGCATAGT-3'；

5'-ATTAGGGCTGTGGTAGGC-3'，

5'-TAGATTGAAGGCGAGTGC-3'；

5'-AAAATCTTACTCACCACCTCC-3'，

5'-GCATACTTTCCTCGCCAC-3'。

2.一种如权利要求1所述的文心兰属EST-SSR标记引物的应用，其特征在于：以从文心兰属植物中提取的DNA样品为模板进行PCR扩增，对文心兰分子进行标记，其中，反应体系和反应程序如下：

反应体系：反应体系的总体积为20μl，含有ddH₂O 11.3μL，10×Buffer 2μL，2.5mmol·L^-1的dNTPs 2μL，引物对中的两引物各1μL 10μmol·L^-1，5U·μL^-1的Taq聚合酶0.2μL，20ng/μL的模板DNA 2.5μL；

反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，退火温度48℃～54℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。