CN105219778A - 克氏原螯虾细胞周期相关的cyclinB基因及其编码蛋白的鉴定 - Google Patents
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Abstract
一种克氏原螯虾细胞周期相关的cyclin？B基因及其编码蛋白的鉴定。公开了克氏原螯虾周期蛋白cyclin？B基因全长序列。该基因的cDNA全长为1295bp，5’端非编码区为86bp，开放阅读框为1209bp，编码402个氨基酸残基，编码蛋白平均分子质量为45745.5，pI为8.93。cyclin？B基因编码的蛋白包含有2个cyclin？superfamily结构域。BLAST比对后发现，其氨基酸序列与斑节对虾的同源性达约90％。半定量RT-PCR结果显示，cyclin？B基因在不同组织表达中具有明显的组织特异性，在卵巢和心脏中有较高的表达量。推测该差异性主要与cyclin？B在细胞周期中调控细胞***的功能有关，该基因可用于克氏原螯虾人工养殖的性腺发育调控研究。
Description
技术领域：
本发明涉及克氏原螯虾基因，属于水产基因工程领域。具体是一个细胞周期相关的周期蛋白cyclinB基因及其编码蛋白的克隆与鉴定，其用于克氏原螯虾人工养殖的性腺同步调控研究。
背景技术：
克氏原螯虾(Procambarusclarkii)，俗称龙虾、小龙虾，隶属节肢动物门、甲壳纲、十足目，是具较高经济价值的水产养殖品种之一；同时，克氏原螯虾还具有成本低、易饲养、体型较大易于人工养殖等优点，因此近几十年来国内有关于小龙虾的人工养殖规模和养殖技术都发展得很快。但是随着发展的强势推进，诸多问题随之凸显出来，比如：人工养殖的雌虾卵巢发育不同步，发育成熟度不高，抱卵量低等，造成亲虾培育技术一直是限制小龙虾规模化人工养殖的瓶颈。如何实现无/弱副作用的人工卵巢发育调控成为克氏原螯虾养殖以及其它经济虾蟹养殖的重要难题之一。目前人们已摸索出不少促虾蟹卵巢快速成熟方法，如控温、控光、强化营养条件、激素处理、手术介入等等。然而，应用实践中会出现无法避免的副作用，比如控温控光存在过程不可控；激素处理过程繁琐；手术介入如切除眼柄后易致亲体蜕皮周期缩短、死亡率上升、卵子质量下降等不良后果。
水产养殖的目标是提高经济水产产品的产量和品质。现代基因工程技术从遗传基因型的角度出发，可以将优良外源基因导入并整合到基因组中，使其辅助获得自身不具备的新性状，并在其后代中得以遗传和表达。这样可以大大拓宽水产养殖品种的遗传改良的途径。克氏原螯虾细胞周期相关基因的克隆鉴定，不仅有助于研究揭示克氏原螯虾***周期调控机理，而且可以充分利用自身资源改进人工养殖中存在的卵巢发育同步化的问题，具有重要的理论意义和巨大的潜在经济价值。
发明内容：
本发明提供了一种克氏原螯虾细胞周期相关的cyclinB基因及其编码蛋白的鉴定。
本发明是通过以下技术方案实现的：克氏原螯虾cyclinB基因，是如SEQIDNo.1所示的碱基序列；或在SEQIDNo.1所示的碱基序列基础上进行一个或多个碱基的替换、缺失或/和***的碱基序列变体，且该碱基序列变体所编码的蛋白仍具有cyclinB编码蛋白的功能或活性。
SEQIDNo.1是从克氏原螯虾卵巢组织中克隆出的基因，命名为cyclinB，开放阅读框1209bp，编码由402个氨基酸残基组成的蛋白质，其序列如SEQIDNo.2所示。
SEQIDNo.1所示的碱基序列或者在严格条件下与其杂交且编码得到的仍具有cyclinB编码蛋白的功能或活性的DNA分子也属于本发明的保护范围。所述SEQIDNo.1所示的碱基序列是利用NCBI数据库中的基因序列，查找与克氏原螯虾周期蛋白cDNA同源的EST片段，根据同源片段设计兼并引物，测序之后再采用RACE方法分别扩增出首尾两端的序列，将上述片段进行序列拼装，组合成完整ORF的cDNA序列，根据这些序列设计特异性的PCR引物，采用RT-PCR的方法，获得完整的cyclinB基因。
本发明的目的之二是提供一种克氏原螯虾cyclinB基因编码蛋白，是如SEQIDNo.2所示的蛋白质所示的蛋白，以及将SEQIDNo.2所示的蛋白质通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或/和***而衍生得到的仍具有cyclinB基因功能或活性的蛋白变体。
本发明提供的cyclinB基因编码的蛋白包含了2个cyclinsuperfamily结构域，其氨基酸序列与斑节对虾的同源性达约90％。
另外，本发明提供了克氏原螯虾cyclinB基因在人工养殖的性腺同步调控研究中的应用。含有克氏原螯虾cyclinB基因的重组载体或重组菌或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
具体实施方式：
本发明通过以下实施方式作进一步阐述，但不限制本发明的范围。
实施例1.克氏原螯虾cyclinB基因cDNA序列及其编码序列的分离鉴定
利用NCBI公共数据库中的基因序列，查找与克氏原螯虾周期蛋白cDNA同源的EST片段，根据同源片段设计兼并引物，测序之后再采用RACE方法分别扩增出首尾两端的序列，将上述片段进行序列拼装，组合成完整ORF的cDNA序列，根据这些序列设计特异性的PCR引物，采用RT-PCR的方法，获得完整的cyclinB基因。克氏原螯虾cyclinB基因cDNA序列如SEQIDNo.1所示，开放阅读框编码蛋白全长序列如SEQIDNo.2所示。
实施例2.定量RT-PCR分析克氏原螯虾cyclinB基因的表达
提取克氏原螯虾卵巢组织总RNA，采用实时荧光定量RT-PCR技术研究基因表达。首先，利用反转录酶(M-MLVRNaseH-ReverseTranscriptase,Promega)将不同组织(卵巢，***，心脏，肌肉，肝，鳃，眼，脑，肠和血细胞)的总RNA(2μg/样品)反转录成cDNA；然后，以cDNA为模板，用基因特异引物(5’-GGATGTGGAGGAAGTGGC-3’和5’-AATTGCCAGACTGCAATTTATTG-3’)和Real-timePCRMasterMix(TOYOBO，Japan)进行定量PCR反应。克氏原螯虾18SrRNA基因(GenBankaccessionno.AF436001)作为反应内标(引物序列分别为5’-TGGTGCATGGCCGTTCTTA-3’和5’-AATTGCTGGAGATCCGTCGAC-3’)，目标基因每一个循环的扩增都被SYBR-Green荧光检测。每个基因的表达水平相对值按公式计算(其中△Ct＝CtcyclinB–Ct18SrRNA)。重复3次，统计分析实验结果。结果显示克氏原螯虾cyclinB基因在卵巢组织和心脏中优势高量表达，表明该基因可能参与***周期调控和卵巢发育过程。
Claims (2)
1.克氏原螯虾周期蛋白cyclinB基因，其特征在于：其cDNA序列如下：
开放阅读框为第87-1295位碱基，编码402个氨基酸。
2.权利要求1所述的克氏原螯虾cyclinB基因编码的蛋白质序列如下：
。
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2015
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GENBANK: "Procambarus clarkii cyclin B mRNA, complete cds；GenBank: KR135175.1", 《NCBI》 * |
| 水燕等: "克氏原螯虾卵巢发育III期与IV期的比较蛋白质组学研究", 《江苏农业科学》 * |
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