CN105218651B - 玉米抗禾谷镰刀菌茎腐病基因ZmAuxRP1的克隆及功能分析 - Google Patents

玉米抗禾谷镰刀菌茎腐病基因ZmAuxRP1的克隆及功能分析 Download PDF

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Abstract

本发明公开了玉米抗禾谷镰刀菌茎腐病基因ZmAuxRP1的克隆及功能分析。本发明提供了一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。本发明发现新基因ZmAuxRP1，并通过干扰野生型玉米中的ZmAuxRP1基因表达，得到转基因玉米，其与未干扰的野生型ZmAuxRP1相比，抗玉米茎腐病性提高；并通过过表达实验，进一步证明，因此，干扰ZmAuxRP1基因表达可用于水稻抗玉米茎腐病性。

Description

玉米抗禾谷镰刀菌茎腐病基因ZmAuxRP1的克隆及功能分析
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种玉米抗禾谷镰刀菌茎腐病基因ZmAuxRP1的克隆及功能分析。
背景技术
玉米(Zea mays L.)是粮饲兼用的重要粮食作物，也是重要的工业原料。玉米是世界第一大作物，我国玉米2007年种植面积超过水稻，2010年总产超过水稻，也成为我国名副其实的第一大粮食作物，我国粮食安全保障体系中占有举足轻重的地位。
玉米茎腐病是玉米生产中危害严重的土传性病害，在很多国家与地区都有发生，如南非、印度、加拿大、美国、英国、亚洲的尼泊尔与菲律宾及澳大利亚等。玉米茎腐病对玉米产量造成极大影响，英国有报道称，在1973-1975年间，茎腐病引起的玉米产量损失为11.2％。在美国的伊利诺伊州，炭疽茎腐病所造成的产量损失曾达到17.2％。在我国，玉米茎腐病最早开始报道于1962年，70年代以后报道逐步增多。80年代以来，玉米茎腐病在我国发生日益严重，一般年份发病率为5-10％，严重年份为20-30％。80年代末到90年代初，黑龙江省玉米茎腐病的田间发病率约10-20％，严重地块达50-60％以上，产量损失达10-20％。2004年豫西地区玉米茎腐病爆发，发病率平均在26％以上，严重地块达100％。山西玉米产区自80年代以来，一般发病率为10-20％，严重的高达50％以上。由于玉米茎腐病性状极为复杂，受环境影响很大，从而导致抗性测定的误差增大，因此，开展对玉米茎腐病的遗传基础研究相当困难。鉴于玉米茎腐病对经济和生态都有很重要的影响，培育抗病品种成为控制病害流行的有效手段，可以将多个抗茎腐病QTL导入优良的自交系改良品种抗性。
目前，世界上许多国家都已经报道玉米茎腐病的致病菌，这些致病菌不尽相同，在不同地区呈现不同优势病原菌。美国学者早期认为，玉米干腐菌(Diplodia maydis)与禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是引起玉米茎腐病发生的主要病原菌；但是到了20世纪80年代至90年代间，炭疽病原菌逐渐发展成为了玉米茎腐病的主要病原菌。欧洲则多以镰刀菌属病原菌(Fusarium spp)为主要致病菌，但是在法国西南部则是以玉米穗粒干腐菌(Diphodia zeae)作为主要致病菌。在我国，目前报道的玉米茎腐病的主要致病菌包括禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)、禾生腐霉菌(Pythium graminicola)、肿囊腐霉菌(Pythium inflatum)和瓜果腐霉菌(Pythiumaphanidermatum)等五大类。然而，这些病原菌在不同地区，不同年份都会发生变化。山东省一般认为是串珠镰孢、禾谷镰孢或瓜果腐霉为主要致病菌；广西、湖北、山西等三省则认为串珠镰刀菌是茎腐病主要病原菌；东北三省认为禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、腐皮镰刀菌(Sarium soiani)是主要致病菌；新疆地区的茎腐病病原菌主要是肿囊腐霉菌。一般来说，镰刀菌茎腐病主要发生在气候偏干旱地区，而腐霉菌茎腐病主要发生在气候偏湿润地区。
玉米抗茎腐病的遗传机制有两种不同的观点：一些学者认为玉米自交系对茎腐病的抗性受环境影响，呈现数量性状的变化；在分离后代，表型呈现连续性变化，说明玉米茎腐病受到多基因与多基因互作的共同调控。Kappelman和Thompson(1966)研究结果表明，玉米对茎腐病的抗性受少数基因控制，加性效应和显性效应均起作用。Carson与Hooker认为玉米对茎腐病的抗性是受多基因控制的。1993年，Pè等利用高抗茎腐病自交系B87和高感自交系33-16组配了150个F2：3家系，接种禾谷镰刀菌后对性状进行鉴定和分析，定位了5个抗禾谷镰刀菌茎腐病的QTL位点，分别位于第1、3、4、5和10号染色体上。玉米抗炭疽茎腐病的主效QTL(Rcg1)被定位到第4号染色体长臂上，该基因目前已经被成功克隆。扬琴等利用高抗玉米茎腐病自交系1145和高感自交系黄331组配后代群体，经接种禾谷镰刀菌后进行性状鉴定及分析，定位了2个QTL位点，分别位于1和10号染色体上。
另外，对于玉米茎腐病也有研究者认为是受的主基因调控的。Badu-Apraku等人研究认为玉米自交系LB31对炭疽茎腐病具有高抗性，而这种抗性是受到单基因调控的。其后，在国内先后有人将茎腐病的主基因定位。2001年，Yang等同样利用高抗玉米1145自交系与高感玉米Y331自交系组配分离群体，通过接种肿囊腐霉菌进行病症的鉴定，结果发现其表型符合3:1的比例，而认为其抗病性受一对显示基因调控，并将其定位在4号染色体分子标记bnlg1937和agrr286之间，其遗传距离为5.7cM。事实上，对于不同茎腐病遗传抗性的鉴定，无论是受多基因调控还是受单基因调控都只能在特定的病原菌及特定的群体的情况下进行。
发明内容
本发明的一个目的是提供玉米抗禾谷镰刀菌茎腐病基因ZmAuxRP1的克隆。
本发明提供的蛋白质，命名为是ZmAuxRP1，如下a)或b)的蛋白质：
a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。
编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护的范围。
上述DNA分子为如下1)-4)中任一种的DNA分子：
1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
2)编码区为序列表中序列2所示的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码上述蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也是本发明保护的范围。
上述蛋白质或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在调控植物抗病性中的应用也是本发明保护的范围；
或上述蛋白质或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在培育高抗病转基因植物中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
所述病为茎腐病，所述茎腐病的病原菌具体为禾谷镰刀菌；
或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物为玉米。
抑制上述蛋白表达的物质在调控植物抗病性中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，上述抑制上述蛋白表达的物质为如下1)或2)或3)：1)序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段编码的RNA；2)序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段；3)含有序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段和其反向互补序列的表达载体。所述2)为pGreen-HY104-ZmAuxRP1RNAi，其为将序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段替换载体pGreen-HY104的XhoI和EcoRI酶切位点间的DNA片段，且将序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段的反向互补片段替换载体pGreen-HY104的BamHI和PstI酶切位点间的DNA片段，得到的载体pGreen-HY104-ZmAuxRP1RNA，在导入植物中所产生的RNA，进而所形成双链RNA。
所述调控植物抗病性为提高植物抗病性；
所述病为茎腐病，所述茎腐病的病原菌具体为禾谷镰刀菌病；
所述植物为单子叶植物或双子叶植物；或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物为玉米。
本发明另一个目的是提供一种培育高抗病性转基因植物的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中上述蛋白表达，得到转基因植物；
所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物。
上述方法中，所述抑制目的植物中上述蛋白表达为将抑制上述蛋白表达的物质导入目的植物；
上述抑制上述蛋白表达的物质为如下1)或2)或3)：1)序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段编码的RNA；2)序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段；3)含有序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段和其反向互补序列的表达载体。所述2)为pGreen-HY104-ZmAuxRP1RNAi，其为将序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段替换载体pGreen-HY104的XhoI和EcoRI酶切位点间的DNA片段，且将序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段的反向互补片段替换载体pGreen-HY104的BamHI和PstI酶切位点间的DNA片段，得到的载体pGreen-HY104-ZmAuxRP1RNA，在导入植物中所产生的RNA，进而所形成双链RNA。
所述病为茎腐病，所述茎腐病的病原菌具体为禾谷镰刀菌；
所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；
或所述目的植物为单子叶植物，所述单子叶植物为玉米。
本发明的实验证明，本发明发现新基因ZmAuxRP1，并通过干扰野生型玉米中的ZmAuxRP1基因表达，得到转基因玉米，其与未干扰的野生型ZmAuxRP1相比，抗玉米茎腐病性提高；并通过过表达实验，进一步证明，因此，干扰ZmAuxRP1基因表达可用于水稻抗玉米茎腐病性。
附图说明
图1为定位群体构建的图谱。
图2为RNAi干扰载体pGreen-HY104-ZmAuxRP1示意图。
图3为过表达载体pGreen-0229-ZmAuxRP1示意图；
图4为精细定位结果；
A：2008年，15个BC4F1交换单株共983株BC5F1群体，QTL-qRfg2被定位在SSRZ68/SSRZ93之间；
B：2009年，28个BC5F1交换单株共1888株BC6F1群体，QTL-qRfg2被定位SSRZ293/SSRZ263之间；
C：2010年，36个BC6F1交换单株共2817株BC7F1群体，QTL-qRfg2被定位SSRZ319/CAPSZ459之间；
D：2010年，38个BC7F1交换单株共3022株BC8F1群体，QTL-qRfg2被定位SSRZ319/CAPSZ459之间；
E：2011年，47个BC8F1交换单株共4248株BC9F1群体，QTL-qRfg2定位在了STSIDP10/SNP1之间；
F：2012年，16个BC9F1交换单株共1663株BC10F1群体，QTL-qRfg2定位在了STS2/SNP1之间。
注：1.实心的矩形表示杂合等位基因区段，空心的矩形表示纯合的Y331等位基因区段；2.小写字母a表示分析每个基因型组抗性时统计所用的分子标记。
图5为2011年QTL-qRfg2等位基因效应鉴定。
图6为2012年QTL-qRfg2等位基因效应鉴定。
图7为五个阳性克隆(182A2-53、104A2-1、134B1-14、527A2-11和186B2-50)的BAC重叠群。
图8为三个阳性克隆(BAC-1，BAC-2，BAC-3.)的BAC重叠群
图9为三个自交系1145、Y331、B73在QTL-qRfg2定位区间内的BAC序列分析
图10为自交系1145与Y331中ZmAuxRP1cDNA序列分析
图11为抗感近等基因系在苗期接种病原菌的抗病率；
R-NIL为抗病近等基因系，S-NIL为感病近等基因系。
图12为接种禾谷镰刀菌后ZmAuxRP1在抗感近等基因西中的表达分析；
每组柱状图的左边为R-NIL，右边为S-NIL；R-NIL为抗病近等基因系，S-NIL为感病基因系，时间点2h，4h，8h都是存在差异表达。
图13为利用pGUS-F/R检测T1代转ZmAuxRP1RNAi植株胶图；
1-22为T1转ZmAuxRP1RNAi代植株，扩增出条带为阳性植株；HiII为阴性对照，不能扩增出条带；质粒为构建好的pGreen-HY104-ZmAuxRP1质粒，作为阳性对照，能够扩增出条带；M表示2Kb Marker。
图14为ZmAuxRP1RNAi转基因T1抗性分析。
图15为ZmAuxRP1RNAi转基因T3抗性分析。
图16为ZmAuxRP1RNAi转基因植株苗期抗性分析。
图17为两个转基因阳性事件表达量分析；
‘+’表示转基因植株，‘-’表示野生型植株。
图18为利用bar-R/L检测T1代转ZmAuxRP1过表达植株胶图；
1-22为T1转ZmAuxRP1过表达植株，扩增出条带的为阳性植株；HiII为阴性对照，不能扩增出条带；质粒为构建好的pGreen-0229-ZmAuxRP1质粒，作为阳性对照，能够扩增出条带；M表示2Kb Marker；
图19为过表达转基因事件抗性分析；每组柱状图的左边为转基因玉米，右边为野生型玉米。
图20为过表达事件over-2ZmAuxRP1表达量分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
玉米抗病自交系1145、玉米感病自交系Y331、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearumSchw.)、禾谷镰刀菌培养及人工接菌方法在文献“Yang Q,Yin G,Guo Y,Zhang D,Chen S,Xu M:A major QTL for resistance to Gibberella stalk rot in maize.TAGTheoretical and applied genetics Theoretische und angewandte Genetik 2010,121(4):673-687”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
玉米自交系HiIIA和HiIIB均记载在如下文献中“Armstrong C L,Green C E,Phillips R L.Development and availability of germplasm with high Type IIculture formation response.Maize genetics cooperation news letter(USA),1991.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
高抗禾谷镰刀菌茎腐病玉米自交系1145，高感禾谷镰刀菌茎腐病玉米自交系黄早四的BAC文库在文献“周高峰，2006.玉米自交系1145 BAC文库的构建及抗甘蔗花叶病毒基因Scmv1区域BAC克隆的筛选，硕士学位论文.中国农业大学”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
pEASY-T1载体购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CT101-01。
pGreen-HY104在文献“A maize wall-associated kinase confersquantitative resistance to head smut”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
pGreen0229载体购自普如汀生物技术(北京)有限公司，产品目录号为631903。
EHA105感受态购自北京华越洋生物科技有限公司，产品目录号为GX0133-100。
植物总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为DP432。
M-MLV Reverse Transcriptase第一链合成***购自Invitrogen公司，产品目录号为28025013。
SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为DRR041A。
实施例1、ZmAuxRP1基因的获得
一、ZmAuxRP1基因的发现
1、定位
利用玉米高抗自交系1145与高感自交系Y331杂交产生F1，F1与Y331回交获得BC1F1，利用BC1F1分离群体进行了初定位。在初定位基础上，选择覆盖QTL-qRfg2定位区间的重组单株，进一步回交获得BC2F1，直到BC3F1，在BC3F1的群体中，利用初定位区间两端的分子标记筛选，获得一株含有整个初定位供体片的单株。利用这株单株，本实验发展了用以精细定位的分离群体(图1)。
整个精细定位的群体包括：2008年共获得983株BC5F1群体(来自15个BC4F1交换单株)，2009年1888株BC6F1群体(来自28个BC5F1交换单株)，2010年共获得2817株BC7F1群体(来自36个BC6F1交换单株)，2010年共获得3022株BC8F1群体(来自38个BC7F1交换单株)，2011年共获得4248株BC9F1群体(来自47个BC8F1交换单株)，2012年共获得1663株BC10F1群体(来自16个BC9F1交换单株)，所有材料均接种禾谷镰刀菌进行性状鉴定和基因型分析。这些材料的遗传背景在回交过程中越来越趋向于Y331的遗传背景，这样定位时就会减少背景不同所引起的遗传差异，增加定位结果的准确性。所有材料种植均在中国农业大学昌平试验站完成。
在MaizeGDB，Maizesequence网站上检索QTL-qRfg2初定位区间内的玉米基因组BAC(Bacterial artificial chromosome)序列，通过序列比对的方式获得单拷贝或是低拷贝的序列，将这些序列开发成适合需要的SSR、STS、CAPS和SNP等分子标记。最终获得了18对SSR分子标记，12对STS分子标记及3对CPAS分子标记(表1)。用这些在亲本上具有多态性的分子标记来检测定位群体的基因型，最终，通过比较重组单株后代群体的基因型和抗性，对QTL-qRfg2进行精细定位。
在定位区间附近，发展了5个分子标记(STSZ499、STSZ511、STSZ514、STSZ519和STSZ525)与一个定位的分子标记(SSRZ319)，通过PCR的方法分别筛选1145和黄早四BAC文库，这两个材料经过抗性鉴定，其中1145为高抗材料，黄早四为高感材料。对选到的阳性克隆采用碱裂解法小量提取BAC质粒DNA，利用BamHI完全酶切BAC质粒DNA，在4℃，40V电压的条件下，电泳16h，通过EB染色，拍照，进行BAC克隆指纹图谱分析，构建覆盖整个基因区段的BAC重叠群。选择能够覆盖基因区域最少的克隆，用于测序。通过分析比较不同材料间qRfg2定位区段基因组序列及结构的差异，确定功能基因ZmAuxRP1。
表1精细定位qRfg2开发的分子标记详细信息
在初定位时，QTL-qRfg2被定位到mmc0041与phi308707之间，物理距离为～39cM(参考B73的物理图谱)。在这个定位区间内，利用SSRZ135、SSRZ171、SSRZ28、SSRZ56、SSRZ68、SSRZ81、SSRZ88、SSRZ93、mmc0041和phi308707(标记/2～5Mb)检测BC4F1群体的基因型，获得15个BC4F1的重组单株。将这些重组单株与轮回亲本Y331回交，产生了983个BC5F1后代群体。15个BC4F1重组单株的基因型可划分成5种类型(图4A)。其中类型I与类型II的后代测验结果显示，纯合后代(‘Y331’/‘Y331’)与杂合后代(‘1145’/‘Y331’)存在显著的抗病差异(P<0.05)，推测这二个类型的1145供体片段含有QTL-qRfg2。而在类型III、VI和V的后代群体中，纯合后代(‘Y331’/‘Y331’)与杂合后代(‘1145’/‘Y331’)不存在显著的抗病差异(P>0.05)，推测它们所含的1145供体片段不带QTL-qRfg2。类型I重组单株包括的1145供体片段覆盖了整个的初定位区间mmc0041与phi308707，类型II包括的1145供体片段被SSRZ171/phi308707覆盖，而类型III与类型IV所携带的1145供体片段的交换位置是在QTL-qRfg2上游与下游，并且这两个类型的重组单株表型均为感病。根据这些结果，将QTL-qRfg2定为在SSRZ68/SSRZ93区段(图4.A)。
在检测983BC5F1后代基因型时，在新的定位区间SSRZ68/SSRZ93筛选出28个新的重组单株，继续与Y331回交获得后代群体。在2009年，利用新发展的9个分子标记重新鉴定了这28个重组单株，按***区段分成6类基因型。同时，检测来自28个重组单株的1888个BC6F1后代的基因型和田间抗性。利用后代测验发现：类型I、II和III后代的测验结果均为杂合后代(‘1145’/‘Y331’)的抗性显著高于纯合后代(‘Y331’/‘Y331’)(P<0.05)，推测1145供体片段含有QTL-qRfg2，而类型IV、V和VI后代测验的结果显示，纯合后代(‘Y331’/‘Y331’)与杂合后代(‘1145’/‘Y331’)不存在显著地抗病差异(P>0.05)，推测1145供体片段不含有QTL-qRfg2。根据***片段与抗性的相关分析将QTL-qRfg2定位在SSRZ68/nmc1885之间，而类型V，VI的重组位点在QTL-qRfg的上游与下游，最终将定位区间锁定在SSRZ293/SSRZ263之间，物理距离为～4Mb(图4B)。
2010年，在定位区间SSRZ293/SSRZ263内发展了5个新的标记：SSRZ319、CAPSZ459、CAPSZ454、STSZ479和STSZ514。利用这些新发展的标记在BC6F1中筛选到了36个新的重组单株，与Y331回交产生了2817个后代单株。为了加快定位速度，在2010年冬天在海南三亚市加代扩繁，在BC7F1世代筛选到了38个重组单株，与Y331回交产生了3022个后代单株。36个BC6F1的重组单株被分成7类，利用后代测验鉴定表型，结果发现：类型I、II和III的表现抗病(P<0.05),而其余类型不存在抗性。最终，将QTL-qRfg2定位在SSRZ319/CAPSZ459之间(图4C)。
将获得的BC7F1种子在海南进一步回交，获得BC8F1的种子。这样可以加速轮回亲本遗传背景的纯合，降低遗传背景对QTL的效应的影响。在BC7F1世代的定位中，类型I、II、V、VI、VII和X通过后代测验表现为抗病，确认了QTL-qRfg2位于SSRZ256/SSRZ263之间。而类型III和IX的重组发生在QTL-qRfg2的两端。这样将QTL-qRfg2定位在SSRZ319/CAPSZ459之间，物理距离为～300kb(图4.D)。
在BC8F1世代中，再次筛选到了新的交换单株，能够进一步将QTL-qRfg2的置信区间缩小。利用发展的9个分子标记：STSIDP1、STSIDP2、STSIDP3、STSIDP4、STSZ615、STSZ613，P3，STSIDP6和STSIDP10，将筛选到的47个重组单株划分成了9个重组类型，与Y331回交构成了4284个后代的群体。经后代测验后：类型I、II、VII和VIII为抗病，再次验证了QTL-qRfg2的真实存在。类型IV与V重组类型表型为感病。而其余的三个类型：III、VI和IX表型感病，其交换位点将QTL-qRfg2定位在了STSIDP10/SNP1之间(图4.E)。
2012年，一个新的分子标记STS2被发展出来，同时鉴定了一个新的重组单株(类型II图4.F)。对这株重组单株的表型鉴定与基因型检测后，结果显示为其带有QTL-qRfg2(P<0.05)。同时，继续对其它重要的重组单株进行重复的表型鉴定，结果显示类型I所携带的覆盖整个候选区间的***片段为抗病，与以前的鉴定结果一致。而类型III、IV和V均表现为感病，同样验证了以前的定位结果。最终，将QTL-qRfg2定位在了STS2/SNP1之间，参考B73基因组，这个定位区间对应的物理图距仅为～2.5kb。
对QTL-qRfg2的STS2/SNP1定位区间内相对应的B73序列进行查看，发现其只覆盖一个预测基因，该基因注释为生长素调控基因。将这一候选基因命名为ZmAuxRP1。
图4中，利用后代测验方法分析每个重组单株的纯合后代(‘Y331’/‘Y331’)与杂合后代(‘1145’/‘Y331’)之间的抗病性是否存在差异。利用t测验，如果P<0.05说明纯合后代(‘Y331’/‘Y331’)与杂合后代(‘1145’/‘Y331’)之间的抗病性存在显著差异，推测亲本重组个体带有抗病基因，用R表示；如果P>0.05说明纯合后代(‘Y331’/‘Y331’)与杂合后代(‘1145’/‘Y331’)之间的抗病性不存在显著差异。推测亲本重组个体不带有抗病基因，用S表示。
2、QTL-qRfg2的抗性遗传效应鉴定
在精细定位后，对QTL-qRfg2的遗传效应进行了鉴定。在2011年，利用9株重组单株自交获得的F2群体对QTL-qRfg2进行了效应值分析。带有1145区段的纯合单株后代(共345株单株)的平均抗病率为27.8％，带有Y331区段的杂合单株后代(共350株单株)的平均抗病率为15％，而杂合后代个体(共697株单株)的平均抗病率为25.9％。通过方差分析，发现组间方差与组内方差比存在显著性(P<0.05)，说明QTL-qRfg2是存在的。利用多重比较发现：纯合1145等位基因与杂合等位基因不存在显著差异(P>0.05)，而与纯合Y331等位基因存在显著差异(P<0.05)，说明QTL-qRfg2位点表现显性效应，其效应值约为12％(图5)。
在2012年，同样的选择了9株重组单株自交获得的F2群体，再次对QTL-qRfg2进行了效应值分析。带有1145区段的纯合单株后代(共307株单株)的平均抗病率为39.3％，带有Y331区段的杂合单株后代(共345株单株)的平均抗病率为31.3％，而杂合后代个体(共656株单株)的平均抗病率为39.6％。通过方差分析同样得出：组间方差与组内方差比存在显著性(P<0.05)，说明QTL-qRfg2是存在的。利用多重比较发现：纯合1145等位基因与杂合等位基因不存在显著差异(P>0.05)，而与纯合Y331等位基因存在显著差异(P<0.05)，说明QTL-qRfg2是以显性效应存在，其效应值约为8％。综上所述，说明QTL-qRfg2所覆盖的候选基因是以显性方式作用的(图6)。
二、ZmAuxRP1基因克隆
BAC阳性克隆筛选、重叠群的构建、序列分析以及候选基因预测：
本实验室已经构建了玉米自交系1145和黄早四的BAC文库。经鉴定，自交系1145为高抗禾谷镰刀菌茎腐病，而黄早四为高感禾谷镰刀菌茎腐病。玉米自交系B73也是高感禾谷镰刀菌茎腐病的。
在QTL-qRfg2的定位区间附近，发展了5个分子标记(STSZ499、STSZ511、STSZ514、STSZ519和STSZ525)(表2)与一个定位的分子标记(SSRZ319)来筛选1145BAC文库。筛选到5个超级池，进而筛选到了对应的阳性亚池，最终筛选到了5个阳性单克隆：182A2-53、104A2-1、134B1-14、527A2-11和186B2-50(图7)。
表2为BAC库晒选的引物
利用筛选1145BAC文库的5个分子标记(STSZ499、STSZ511、STSZ514、STSZ519和STSZ525)筛选黄早4BAC文库。共筛选到3个阳性超级池，利用这3个阳性超级池筛选到了对应的阳性亚池，最后获得3个阳性单克隆：BAC-1，BAC-2，BAC-3(图8)。
通过比较分析，在每个材料中，选择了覆盖整个定位区段重叠最少的克隆，送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序，测序采用鸟枪法。其中自交系1145测序BAC为104A2-1和527A2-11，黄早四测序BAC为BAC-2，BAC-3。
对完成测序的BAC序列进行拼接组装,分别获得1145与黄早4约170kb BAC序列。同时也下载了maizesequence网站的B73所对应的序列。在QTL-qRfg2的候选区间内只包括一个候选基因，该基因在水稻，高粱中都具有同源基因，其功能注释是生长素调控的蛋白(Auxin-regulated protein)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，因此将这个候选基因命名为ZmAuxRP1。但是其功能未知。同时，也逐一分析了全部序列所包括的其它基因。发现在170kb的范围内，1145、B73和黄早4这三个自交系保守性比较低，在1145的BAC序列上，分子标记STSZ525与STSZ499所包括的序列长度约为130kb，B73序列上只有～105kb，而黄早4只有～75kb(图9)。
分析三个自交系(1145、黄早4、B73)在QTL-qRfg2区段的170kb序列长度。1145、黄早4序列来自于阳性BAC的序列，B73序列来源于Maizesequence网站。基因预测是利用http://linux1.softberry.com/berry.phtml网站上的FGENESH软件预测。基因功能注释是利用预测的基因的mRNA作为参考序列在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi比对同源的基因进行功能注释。红色锥形代表：BAC上预测的基因，箭头方向代表了基因的方向；灰色菱形代表：BAC上预测的转座子与反转座子。灰色区域是在1145、黄早4、B73的分析序列上基因功能注释相同的基因。
在1145的序列中包含了12个预测有功能的基因(表3)，而B73和黄早4序列分别包含了10个和15个有功能的基因，三个自交系之间的序列保守性低。在三个自交系间共享的基因只有三个，包括候选基因ZmAuxRP1(图9灰线示意)，另外，在1145与B73之间还包括另外两个共享基因。
表3 1145 BAC序列预测的基因注释
注：ABF98310.1为QTL-qRfg2定位区间的候选基因
由于没有Y331的BAC文库，为了获得Y331中候选基因ZmAuxRP1的DNA序列，分析Y331与1145间等位基因在DNA水平上的差异，利用PCR方法对Y331中的候选基因ZmAuxRP1进行了测序。一共利用六对分子标记：STSZ520、STSZ562、STSZ565、STSZ570、STSIDP6和STSIDP10对Y331DNA进行扩增(表4)，然后进行测序拼接。序列全长包扩：转录起始位点上游1.5kb至转录终止密码子之间的全部序列。
表4Y331等位基因测序引
在获得了Y331中的ZmAuxRP1等位基因的序列之后，分析了ZmAuxRP1等位基因在1145与Y331自交系间的多态性。序列比对包括了转录起始密码子(ATG)至转录终止密码子(TAA)之间的序列。结果发现等位基因ZmAuxRP1在1145与Y331自交系之间存在很多SNP与InDel的多态性位点。
依据1145的BAC测序，用在线软件分析ZmAuxRP1的结构(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)，预测cDNA序列，在不同的外显子区域设计引物。以1145和Y331根提取的总RNA反转成的cDNA为模板，进行RT-PCR扩增，然后进行克隆测序拼接，获得完整的开放阅读框(ORF)，命名为ZmAuxRP1cDNA-1。1145中该基因的ORF全长为1611bp，而Y331中为1614bp，均包括了4个内含子，5个外显子。比较1145和Y331ORF的序列差异，证实在转录水平上，这两个等位基因之间存在9个SNP与一个3-bp Indel的差异(图10)。暗示这些差异有可能与等位基因的功能有联系。
三、ZmAuxRP1等位基因在接种后病原菌后的表达分析
1、近等基因系苗期抗病率鉴定
为了进一步确认定位结果QTL-qRfg2在玉米抗茎腐病中的作用，以抗感近等基因系的幼苗作为研究材料，分别选取8组抗感近等基因系培养，接种48h后，每组各统计25株近等基因系苗，对抗病性进行鉴定。结果发现：带有QTL-qRfg2的抗病近等基因系(R-NIL)的平均抗病率为58.5％，而不带有QTL-qRfg2的感病近等基因系(S-NIL)的抗病率为42％，通过t测验检验发现两组数据存在极显著差异(P<0.001)(图11)。这结果显示QTL-qRfg2在苗期也具有抗病性。
2、ZmAuxRP1等位基因在接种后病原菌后的表达分析
利用实时定量PCR的方法检测了ZmAuxRP1在近等基因系间表达情况。考虑到生长素相关基因的表达变化都很快，取样的时间点设定为接种后的0h、2h、4h、8h、16h和48h。通过禾谷镰刀菌接种近等基因系幼苗的根，检测ZmAuxRP1在病原菌侵染之后的表达情况。在所有取样时间点，ZmAuxRP1在抗病近等基因系中的表达量都比感病中的表达量低。在接种0h，ZmAuxRP1在近等基因系间没有差异显著表达，在接种禾谷镰刀菌之后2h，ZmAuxRP1在两个近等基因系中表达都下降，在接种后4h，ZmAuxRP1在感病近等基因系中的表达量基本恢复到接种前水平，之后一直维持在接种前水平；而在抗病近等基因系中，在接种2h后，表达量显著下调，4h后略上升，在接种8h后，表达量降到最低，之后上升(图12)。
ZmAuxRP1在近等基因系间差异表达在接种后2h即出现，说明这个基因响应病原菌非常迅速。在接下来的时间点，ZmAuxRP1都存在显著的差异表达，其中在8h，ZmAuxRP1在两个近等基因系间表达差异达到最大，而在16h之后，近等基因系间ZmAuxRP1的表达差异不显著。从整体上看，ZmAuxRP1在感病近等基因系中的表达量一直要高于抗病近等基因系中的(图12)。接种后ZmAuxRP1在抗感近等基因系中不同的表达模式，可能与它在不同材料中所参与调控的生长或抗病生物学反应相关，在转录水平上ZmAuxRP1是负向调控抗病反应的。
实施例2、ZmAuxRP1基因的功能验证
人工合成序列1所示的基因ZmAuxRP1，该基因的cDNA为序列2，该基因编码的蛋白命名为ZmAuxRP1，该蛋白的氨基酸序列为序列3。
一、RNAi干扰验证ZmAuxRP1基因的功能
1、RNAi干扰载体的构建
为了构建RNAi干扰载体。设计了能够扩增候选基因ZmAuxRP1保守的外显子序列的特异引物，同时在引物两端添加PstI-EcoRI与BamHI-XhoI酶切位点(表5)。
取1145新鲜样品利用天根公司的RNA提取试剂盒提取总RNA，再利用Invitrogen公司的反转录试剂盒获得cDNA。以该cDNA为模板，用表5所示的引物进行PCR扩增，得到210bpDNA片段1(序列2第1158-1367位核苷酸)。
表5 RNAi干扰载体扩增片段的引物
将上述210bp DNA片段克隆到pEASY-T1载体上，得到P1质粒；
用XhoI和EcoRI分别酶切P1质粒和载体pGreen-HY104，回收210bp的片段和4000bp的载体骨架，连接，得到P2质粒；
用BamHI和PstI分别酶切P2质粒和P1质粒，回收220bp的P2质粒和4200bp的片段，连接，得到重组载体，即为RNAi扰载体，命名为pGreen-HY104-ZmAuxRP1(如图2)。
经过测序，pGreen-HY104-ZmAuxRP1RNAi为将序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段替换载体pGreen-HY104的XhoI和EcoRI酶切位点间的DNA片段，且将序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段的反向互补片段替换载体pGreen-HY104的BamHI和PstI酶切位点间的DNA片段，得到的载体。
2、转ZmAuxRP1RNAi玉米的制备
1)获得
将干扰载体pGreen-HY104-ZmAuxRP1RNAi(包含ZmAuxRP1外显子中特异的210bp序列)利用基因枪转入感茎腐病的玉米材料HiII中，总共得到2个独立的转基因阳性事件，RNAi-1和RNAi-2。转化及培养方法如下：
①基因枪转化试剂配制
2.5mol/L CaCl2：称取2.78g无水CaCl2溶于10ml无菌去离子水中，过滤灭菌后分装，-20℃保存。
0.1mol/L亚精胺：称取0.145g亚精胺溶于10ml无菌去离子水中，过滤灭菌后分装，-20℃保存(现用现配)。
50％甘油：量取25ml甘油和25ml去离子水，混匀后高压灭菌。
②受体HiII A×B(Hi IIA♀×Hi IIB♂)的制备
首先在田间种植自交系HiIIA和HiIIB，到自交系散粉时分别套袋；然后准备授粉，HiIIA作母本，HiIIB作父本，授粉后9-11天，取授粉果穗籽粒上的未成熟幼胚(该幼胚长成的植株命名为感茎腐病的玉米材料HiII，也成为野生型玉米)，置于MS基本培养基上。
③基因枪微弹的准备
(1)称取30mg金粉(60枪)于1.5ml无菌的离心管中，加入500μl 100％乙醇，vortex剧烈振荡1min，静置5min，10,000rpm离心1min，去掉上清，重复上述步骤3次；
(2)加入500μl无菌去离子水，vortex重新悬浮金粉，静置1min，短暂离心(3sec)，去掉上清，重复3次；
(3)加入500μl灭菌的50％甘油，重新悬浮金粉后分装，每管33μl(4枪)，4℃保存备用；
(4)向离心管中加入4μl构建好的干扰载体pGreen-HY104-ZmAuxRP1(1μg/μl)，先高强度的vortex 5min，再降低vortex的速度至可以在不停机的情况下打开离心管的盖子而没有液体溅出，同时又可以向管中加入其它试剂；
(5)加入50μl 2.5mol/L CaCl2，盖上盖子，低速振荡5min；
(6)用同样的方法加入20μl 0.1mol/L的亚精胺，盖上盖子，低速振荡5min；
(7)冰上静置8min，短暂离心(3sec)，去掉上清；
(8)加入200μl 100％乙醇，vortex至重新悬浮，短暂离心；
(9)小心去掉上清，加入50μl 100％乙醇，低速vortex，保持悬浮状态；
(10)把灭好菌的微弹载体装入固定装置，吸取12.5μl微弹，迅速均匀地涂在微弹载体的内圈上；
(11)自然条件下让乙醇挥发(子弹已经制备完成，备用)。
④基因枪轰击幼胚
(1)打开氦气瓶，调节压力至2000psi；
(2)将易裂片、阻拦网和微弹载体安装进固定装置中，设置射击参数：Gapdistance为20mm；微弹载体飞行距离为10mm；微弹飞行距离为7cm；压力为1100psi；真空度为25inches Hg；
(3)将培养皿放在托盘中间位置，再将托盘***装置的倒数第二档；
(4)打开基因枪的电源和真空泵；
(5)关闭基因枪的门，按下抽真空键(Vac)，当真空表读数达到25inches Hg.时，再按下保持键(Hold)；
(6)按下射击健(Fire)，直到射击结束；
(7)按下放气健，使真空表读数归零；
(8)打开基因枪门，取出培养皿。
⑤幼胚培养方法
将被基因枪轰击的幼胚转移到共培养培养基(co-cultivation medium)，用封口膜封住培养皿，在20℃条件下暗培养3天，再把幼胚转移到resting medium上面，同时用封口膜封住培养皿，放在28℃条件下暗培养7天，之后把所有的幼胚转移到选择培养基上面，培养两周，选择培养基含有潮霉素20mg/L,两周后再进行亚培养，潮霉素的浓度为20mg/L，浸染大约5周左右，含有转化子的细胞会长成可以看见的Ⅱ型愈伤，获得抗性愈伤，将抗性愈伤再生成苗，将其在再生培养基I上面长3周，然后在再生培养基II上面发芽(在光照培养室)。待再生成功后，转移至温室中，获得转基因T0代植株，再将转基因T0代植株进行自交获得T1代，再进行自交，得到T2代转基因植株，再进行自交，得到T3代转基因植株；对T1和T3转基因植株进行后续的基因型鉴定和表型鉴定。
T0代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-1和T0代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-2的种子全部种在海南三亚种植基地，分别自交获得T1代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-1和T1代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-2。
2)PCR鉴定
分别提取T1代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-1和T1代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-2各单株叶片的基因组DNA，用表6所示的引物进行PCR扩增(图13)，得到401bp(pGUS-F/R)和545bp(RNAi-R/F)的为阳性转ZmAuxRP1RNAi玉米。
表6 RNAi转基因筛选引物
3、转ZmAuxRP1RNAi玉米的功能鉴定
1)、抗病性鉴定
阳性T1代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-1和阳性T1代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-2播种、培育得到T2代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-1、T2代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-2、T3代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-1和T3代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-2。
将上述鉴定阳性的T1代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-1、阳性T1代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-2、T3代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-1和T3代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-2进行抗病性检测。以野生型玉米为对照。
上述抗病性检测所用病原菌为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schw.)，是中国北方地区的主要病原菌，将禾谷镰刀菌的菌株，接种在PDA(Potato Dxtrose Agar)培养基上，25℃暗培养一周直至菌丝铺满整个培养基。然后将经过初扩繁的病原菌连同其培养基一起接种到已灭菌的玉米籽粒培养基上，恒温(26-28℃)暗培养15-20天获得大量禾谷镰刀菌。采用伤根土埋法人工接种禾谷镰刀菌。在玉米抽雄散粉前后进行人工接菌。在接种后30天左右进行第一次调查，每隔一星期调查一次。典型的茎腐病症状表现在：茎基部变褐***，易倒伏，果穗倒挂，叶片青枯或黄枯，导致整个植株早衰或死亡等。最后一次调查采用劈茎法，通过观察根部和茎基部输导组织的生长状态确定抗感，并计算抗病率。
每个株系50株，结果取平均值。
成熟期T1代检测结果如图14所示，可以看出，阳性T1代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-1(转基因玉米RNAi-1)和阳性T1代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-2(转基因玉米RNAi-2)的抗病性均高于野生型玉米。并且RNAi-1这个转基因事件两者的抗性差异达到了极显著水平(p<0.01)。
成熟期T3代检测结果如图15所示，T3代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-1(转基因玉米RNAi-1)和T3代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-2(转基因玉米RNAi-2)的抗病性均高于野生型玉米。并且RNAi-1这个转基因事件两者的抗性差异达到了极显著水平(p<0.01)。
苗期T2代检测结果如图16所示，T2代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-1和RNAi-2的抗病性高于野生型玉米。并且抗性差异都达到了极显著水平(p<0.01)。
2)RT-PCR对转基因植株苗期ZmAuxRP1的表达量分析
利用天根的植物提取T3代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-1和T3代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-2的总RNA，利用Invitrogen公司的M-MLV第一链合成***对得到的总RNA进行反转录，得到cDNA。以cDNA作为模板，利用表7引物进行RT-PCR扩增。以野生型玉米为对照。
表7 RT-PCR所用引物与内参
结果如图17所示，可以看出，T3代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-1和T3代转ZmAuxRP1RNAi玉米RNAi-2的ZmAuxRP1表达量低于野生型玉米，证明RNAi转基因植株能够达到特异干扰ZmAuxRP1基因表达的作用。
二、过表达ZmAuxRP1验证基因功能
1、过表达ZmAuxRP1载体的构建
将包含序列1所示的ZmAuxRP1基因的片段(序列4)替换pGreen-0229的BglII与XbaI位点间的DNA分子，得到重组载体，命名为pGreen-0229-ZmAuxRP1，bar-R(图3所示)。
2、转ZmAuxRP1玉米的制备
1)获得
将上述重组载体pGreen-0229-ZmAuxRP1导入农杆菌EHA105中，得到重组菌。将得到重组菌侵染野生型玉米幼胚，获得两个独立的转基因事件，T0代转ZmAuxRP1玉米over-1和T0代转ZmAuxRP1玉米over-2。幼胚的培养和后期愈伤组织的培养参见一(RNAi干扰验证ZmAuxRP1基因的功能)。T0代转ZmAuxRP1玉米over-1和T0代转ZmAuxRP1玉米over-2的种子全部种在海南三亚种植基地，获得T1代转ZmAuxRP1玉米over-1和T1代转ZmAuxRP1玉米over-2。
2)PCR鉴定
分别提取T1代转ZmAuxRP1玉米over-1和T1代转ZmAuxRP1玉米over-2各单株叶片的基因组DNA，用表8所示的引物进行PCR扩增(图18)，得到357bp的为阳性转ZmAuxRP1玉米。
表8过表达转基因植株筛选引物
3、转ZmAuxRP1玉米的功能鉴定
1)、抗病性鉴定
将上述鉴定阳性T1代转ZmAuxRP1玉米over-1和阳性T1代转ZmAuxRP1玉米over-2进行抗病性检测。以野生型玉米为对照。接菌和性状调查方法参一(RNAi干扰验证ZmAuxRP1基因的功能)。
每个株系50株，实验重复3次，结果取平均值。
检测结果如图19所示，可以看出，阳性T1代转ZmAuxRP1玉米over-1(转基因玉米over-1)和阳性T1代转ZmAuxRP1玉米over-2(转基因玉米over-2)的抗病性均低于野生型玉米。
2)Realtime-PCR对过表达转基因植株苗期ZmAuxRP1的表达量分析
提取阳性T1代转ZmAuxRP1玉米over-1的总RNA，反转录得到cDNA作为模板，用表9引物进行realtime-PCR扩增。以野生型玉米为对照。
表9 realtime-PCR所用引物与内参
结果如图20所示：与野生型玉米相比，在阳性T1代转ZmAuxRP1玉米中ZmAuxRP1的表达量提高了十几倍。因此，依据以上RNAi和过表达转基因结果，认为ZmAuxRP1就是抗禾谷镰刀菌茎腐病微效QTL-qRfg2区段内的功能基因。

Claims (6)

1.如下任一所述在提高植物抗病性中的应用；所述病为茎腐病；所述植物为单子叶植物；所述单子叶植物为玉米；
1）蛋白质，是由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）编码1）所述蛋白质的DNA分子；
3）含有2）所述DNA分子的重组载体、表达盒、重组菌或重组病毒。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述DNA分子为如下1）或2）中的DNA分子：
1）编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
2）编码区为序列表中序列2所示的DNA分子。
3.如下任一所述在培育高抗病转基因植物中的应用；所述病为茎腐病；所述植物为单子叶植物；所述茎腐病的病原菌为禾谷镰刀菌；所述单子叶植物为玉米；
1）蛋白质，是由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）编码1）所述蛋白质的DNA分子；
3）含有2）所述DNA分子的重组载体、表达盒、重组菌或重组病毒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述DNA分子为如下1）或2）中的DNA分子：
1）编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
2）编码区为序列表中序列2所示的DNA分子。
5.抑制权利要求1中所述蛋白表达的物质在调控植物抗病性中的应用；所述调控植物抗病性为提高植物抗病性；所述病为茎腐病；所述抑制权利要求1所述蛋白表达的物质为如下1）或2）或3）：1）序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段编码的RNA；2）序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段；3）含有序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段和其反向互补序列的表达载体；所述植物为单子叶植物；所述茎腐病的病原菌为禾谷镰刀菌病；所述单子叶植物为玉米。
6.一种培育高抗病性转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中权利要求1中所述蛋白表达，得到转基因植物；
所述转基因植物的抗病性高于所述目的植物；所述抑制目的植物中权利要求1中所述蛋白表达为将抑制权利要求1中所述蛋白表达的物质导入目的植物；所述抑制权利要求1中所述蛋白表达的物质为如下为如下1）或2）或3）：1）序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段编码的RNA；2）序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段；3）含有序列2第1158-1367位核苷酸所示的DNA片段和其反向互补序列的表达载体；
所述病为茎腐病；所述茎腐病的病原菌为禾谷镰刀菌；
所述目的植物为单子叶植物；所述单子叶植物为玉米。
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