CN105213482A - 一种抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物活性物制剂及其制备方法技术领域，具体涉及一种抗糖尿病肾病活性物脂质体及其制备方法，该脂质体粉针剂的活性物质是由桑叶黄铜：枸杞多糖：银杏叶黄铜的质量比为2.2-3.5:2.8-3.7:1混合而成。本发明以银杏叶黄酮、桑叶黄酮与枸杞多糖配伍为活性物质包埋物制得的脂质体粉针剂，包封率达90%以上，粒径小且均匀，具有靶向性和淋巴定向性，增加了药物在体循环中的保留时间，提高活性物质的生物利用度，毒性低，治疗效果好，为治疗糖尿病肾病患者的医学界提供更多可选择方案；本发明制备的脂质体粉针剂缓慢释放游离药物，提高稳定性，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。

Description

一种抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物活性物制剂及其制备方法技术领域，具体涉及一种抗糖尿病肾病活性物脂质体粉针剂及其制备方法。

背景技术

糖尿病肾病是由于糖尿病糖代谢异常为主因所致的肾小球硬化并伴尿蛋白含量超过正常的疾病，它是糖尿病引起的严重和危害性最大的一种慢性并发症。目前针对其治疗方法主要是合理饮食与西药相结合，长期使用单一或几种已证实有效的药物会使人体逐渐产生抗药性，而从植物中提取的活性物质对人体具有较小的毒副作用，现已发现“药食同源”中提取的活性物质对人体具有保健作用，且几乎无毒性。近年来开发植物资源的功能活性、植物提取成分及保健食品具有巨大潜力及应用价值，开发具有抗糖尿病肾病的药食同源提取物用以预防和治疗糖尿病，减少心血管病变、肾脏病变、神经病变、视网膜病变、糖尿病足等糖尿病并发症的发病率具有重要的意义。

将对糖尿病肾病有预防及治疗作用类的活性物质直接进入生物体内后有消化的过程，会破坏其活性，影响作用效果，而将活性物质包埋在脂质体中，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。脂质体能起到很好的保护作用。目前，针对糖尿病肾病的脂质体类药物研究较少，而植物提取的活性物质脂质体的研究更为少见，单一的活性物质脂质体治疗效果不佳，且脂质体制备过程中包封率低，稳定性差等问题亟待解决。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂。

本发明还提供了一种抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂的制备方法。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂，所述活性物质为银杏叶黄酮、枸杞多糖和桑叶黄酮的混合物。

进一步的，上述活性物质中，所述桑叶黄铜：枸杞多糖：银杏叶黄铜的质量比为2.2-3.5:2.8-3.7:1。

进一步的，所述脂质体粉针剂是由以下重量份的原料组成：活性物质5-15份、磷脂酰胆碱0.1-10份、胆固醇2-30份、吐温-601-25份、蛋黄磷脂酰肌醇6-60份、抗氧剂0.03-5份、分散剂0.5-40份、冻干保护剂0.05-10份、磷酸盐缓冲液。

进一步的，所述磷脂酰胆碱优选为氢化大豆磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二反式油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱中的一种或几种,所述几种为两种以上任意比例的组合。

进一步的，所述冻干保护剂优选为蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸中的一种或几种,所述几种为两种以上任意比例的组合。

进一步的，所述抗氧剂优选为维生素E、抗坏血酸、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、抗坏血酸棕榈酸酯中的一种或几种,所述几种为两种以上任意比例的组合。

进一步的，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2-7.4。

进一步的，所述分散剂为氯仿同甲醇按照体积比1:2-1:7组成。

本发明还提供了一种抗氧化肾病活性物质脂质体粉针剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）将蛋黄磷脂酰肌醇、胆固醇、吐温-60、磷脂酰胆碱的原料溶于分散剂中，得到油相混合物，并经过120℃蒸汽灭菌20min，后超声处理10min；

（2）将银杏叶黄酮、枸杞多糖和桑叶黄酮的活性物质混合物溶于一半质量浓度为5%抗氧剂-磷酸盐缓冲液中，得到水相混合物；

（3）将水相混合物边搅拌边注入油相混合物中，在10000r/min的搅拌速度下搅拌5min，间歇超声处理3-5min形成初乳,再添加剩余另一半质量浓度为5%的抗氧剂-磷酸盐缓冲液，继续用高速组织捣碎机以10000r/min的搅拌速度搅拌5min，继续间歇超声处理3-5min形成复乳；

（4）将复乳倒入梨形瓶中，在旋转蒸发仪上减压去除分散剂，在瓶壁上形成均匀的薄膜；

所述旋转蒸发仪的参数为：压强为30rpm,温度为37℃；

（5）将步骤（4）得到均匀的薄膜的梨形瓶中边加入质量浓度为5%的冻干保护剂-磷酸盐缓冲液边水浴孵化，直至干膜完全脱落下来:，得到均匀分散的脂质体溶液；

（6）将脂质体溶液过高压均质机在500bar条件下进行5次循环高压均质处理，得到脂质体混悬液；

（7）将脂质体混悬液放入冰箱中，以5℃/min的速度快速降温至-45℃，于-45℃预冻15min，然后反复冻融3-4次；所述冻融：于-80℃恒温45min后在室温下解冻；

（8）取冻融处理的脂质体混悬液在温度为-80℃，真空度为8的真空冷冻干燥机中冷冻干燥28h，得到的冻干品即为粉针剂。

进一步的，步骤（5）中，所述水浴孵化在温度为37℃条件下进行。

本发明所述质量浓度为5%的冻干保护剂-磷酸盐缓冲液是指冻干保护剂在磷酸盐缓冲液中质量浓度是5%，同理抗氧剂-磷酸盐缓冲液。

本发明发明人经过大量实验发现：银杏叶黄酮、桑叶黄酮、枸杞多糖这三种活性物质的配比经过配伍组合实验，根据均匀设计U9(96)表，进行配伍优化，MTT比色法及乳酸脱氢酶试剂盒测定不同有效成分的优化配伍比例，三者能够协同作用，靶向性及定向性更高，治疗效果更好。本发明的脂质体粉针剂具有良好的制剂稳定性，冷冻过程中脂质体因融合、冰晶发生破裂的程度降低，在长期储存后仍能保持较高的包封率。

本发明的优点为：

（1）本发明以银杏叶黄酮、桑叶黄酮与枸杞多糖配伍为活性物质包埋物制得的脂质体粉针剂，包封率达90%以上，粒径小且均匀，为120-250nm，具有靶向性和淋巴定向性，增加了药物在体循环中的保留时间，提高活性物质的生物利用度，毒性低，治疗效果好，为治疗糖尿病肾病患者的医学界提供更多可选择方案；

（2）本发明制备的脂质体粉针剂缓慢释放游离药物，从而避免了游离药物通常的肾清除机制、延缓肾***和代谢，从而延长作用时间，提高稳定性，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部，脂质体能起到很好的保护作用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行进一步的阐述，应该明白的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明主要原料来源：

实施例1

抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂，原料组成为：

活性物质（桑叶黄铜：枸杞多糖：银杏叶黄铜的质量比为3.5:3.7:1）5份、氢化大豆磷脂酰胆碱6份、胆固醇29份、吐温-6020份、蛋黄磷脂酰肌醇6份、维生素E0.3份、氯仿-甲醇（体积比1:2）23份、蔗糖及甘氨酸（质量比为1：1）1份、pH为7.2磷酸盐缓冲液。

制备方法为：

（1）将氢化大豆磷脂酰胆碱、胆固醇、吐温-60、蛋黄磷脂酰肌醇的溶于氯仿-甲醇中，得到油相混合物，并经过120℃蒸汽灭菌20min，后超声处理10min；

（2）将银杏叶黄酮、枸杞多糖和桑叶黄酮的混合物加入3份质量浓度为5%的维生素E-磷酸盐缓冲液中(将0.3份维生素E溶于磷酸盐缓冲液中得到6份质量浓度为5%的维生素E-磷酸盐缓冲液)，搅拌均匀得到水相混合物；

（3）将水相混合物边搅拌边注入油相混合物中，在10000r/min的搅拌速度下搅拌5min，间歇超声处理3-5min形成初乳,再添加另一半（3份）的质量浓度为5%的维生素E-磷酸盐缓冲液，继续用高速组织捣碎机以10000r/min的搅拌速度搅拌5min，继续间歇超声处理3min形成复乳；

（4）将复乳倒入梨形瓶中，在旋转蒸发仪上减压去除分散剂，在瓶壁上形成均匀的薄膜；

所述旋转蒸发仪的参数为：压强为30rpm,温度为37℃；

（5）将步骤（4）得到均匀的薄膜的梨形瓶中边加入质量浓度为5%的冻干保护剂-磷酸盐缓冲液（同上）边在常压，37℃条件下水浴孵化，直至干膜完全脱落下来，并得到均匀分散的脂质体溶液；

（6）将脂质体溶液过高压均质机在500bar条件下进行5次循环高压均质处理，得到平均粒径小于120nm的脂质体混悬液；

（7）将脂质体混悬液放入冰箱中，以5℃/min的速度快速降温至-45℃，于-45℃预冻15min，然后反复冻融3次；所述冻融：于-80℃恒温45min后在室温下解冻；

（8）取冻融处理的脂质体混悬液在温度为-80℃，真空度为8的真空冷冻干燥机中冷冻干燥28h，得到的冻干品即为粉针剂。

实施例2

抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂，原料组成为：

活性物质（桑叶黄铜：枸杞多糖：银杏叶黄铜的质量比为2.28:2.83:1）8份、二油酰磷脂酰胆碱和二反式油酰磷脂酰胆碱混合物（1:1）8份、胆固醇25份、吐温-601份、蛋黄磷脂酰肌醇50份、抗坏血酸1份、氯仿-甲醇（体积比1:4）40份、乳糖、麦芽糖及海藻糖混合物（质量比1:1:1）4份、pH为7.4磷酸盐缓冲液。

制备方法为：

（1）将二油酰磷脂酰胆碱和二反式油酰磷脂酰胆碱混合物、胆固醇、吐温-60、蛋黄磷脂酰肌醇的溶于氯仿-甲醇中，得到油相混合物，并经过120℃蒸汽灭菌20min，后超声处理10min；

（2）将银杏叶黄酮、枸杞多糖和桑叶黄酮的混合物加入一半质量浓度为5%的维生素E-磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀得到水相混合物；

（3）将水相混合物边搅拌边注入油相混合物中，在10000r/min的搅拌速度下搅拌5min，间歇超声处理5min形成初乳,再添加另一半质量浓度为5%的维生素E-磷酸盐缓冲液，继续用高速组织捣碎机以10000r/min的搅拌速度搅拌5min，继续间歇超声处理5min形成复乳；

（4）将复乳倒入梨形瓶中，在旋转蒸发仪上减压去除分散剂，在瓶壁上形成均匀的薄膜；

所述旋转蒸发仪的参数为：压强为30rpm,温度为37℃；

（5）将步骤（4）得到均匀的薄膜的梨形瓶中边加入质量浓度为5%的冻干保护剂-磷酸盐缓冲液边在常压，37℃条件下水浴孵化，直至干膜完全脱落下来，并得到均匀分散的脂质体溶液；

（6）将脂质体溶液过高压均质机在500bar条件下进行5次循环高压均质处理，得到平均粒径小于120nm的脂质体混悬液；

（7）将脂质体混悬液放入冰箱中，以5℃/min的速度快速降温至-45℃，于-45℃预冻15min，然后反复冻融4次；所述冻融：于-80℃恒温45min后在室温下解冻；

（8）取冻融处理的脂质体混悬液在温度为-80℃，真空度为8的真空冷冻干燥机中冷冻干燥28h，得到的冻干品即为粉针剂。

实施例3

抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂，原料组成为：

活性物质（桑叶黄铜：枸杞多糖：银杏叶黄铜的质量比为2.56:2.95:1）10份、二硬脂酰磷脂酰胆碱9份、胆固醇18份、吐温-6022份、蛋黄磷脂酰肌醇45份、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠及焦亚硫酸钠（质量比为1:1:1）2.2份、氯仿-甲醇（体积比1:5）30份、甘露醇6份、pH为7.3磷酸盐缓冲液。

制备方法同实施例2。

实施例4

抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂，原料组成为：

活性物质（桑叶黄铜：枸杞多糖：银杏叶黄铜的质量比为3.5:3.7:1）12份、氢化大豆磷脂酰胆碱和二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱混合物（1:1）9.5份、胆固醇27份、吐温-6018份、蛋黄磷脂酰肌醇60份、抗坏血酸棕榈酸酯3.8份、氯仿-甲醇（体积比1:6）0.5份、甘氨酸8份、pH为7.2磷酸盐缓冲液。

制备方法同实施例2。

实施例5

抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂，原料组成为：

活性物质（桑叶黄铜：枸杞多糖：银杏叶黄铜的质量比为3.5:3.7:1）15份、二油酰磷脂酰胆碱、二反式油酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱混合物（1:1:1）10份、胆固醇30份、吐温-6025份、蛋黄磷脂酰肌醇40份、维生素E和抗坏血酸棕榈酸酯（质量比为1:1）4份、氯仿-甲醇（体积比1:7）18份、海藻糖和甘氨酸混合物（1:1）10份、pH为7.4磷酸盐缓冲液。

制备方法同实施例2。

对比例1

抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂，原料组成同实施例1，不同之处在于制备过程中：

（2）将银杏叶黄酮、枸杞多糖和桑叶黄酮的混合物加入全部的质量浓度为5%的维生素E-磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀得到水相混合物；

（3）将水相混合物边搅拌边注入油相混合物中，在10000r/min的搅拌速度下搅拌10min，间歇超声处理5min形成初乳。

其他步骤均同实施例1的制备方法。

效果实验

（一）包封率的测定

1、色谱条件：色谱柱：AgilentAlltimaC18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：0.045%三氟乙酸(TFA)溶液-甲醇-乙腈(94:3.5:2.5)；检测波长：275nm；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；柱温：25℃；

2、样品包封率的测定

(1)精密量取实施例1-5中冻融处理后的脂质体混悬液250μl置10ml量瓶中，加乙醇2ml，超声20min，放冷至室温，用流动相定容，进样测定总药物量。另取脂质体混悬液适量置2ml离心管中，18000rpm离心10min，精密量取上清液250μl置10ml量瓶中，同上操作，测定游离药物量，根据公式：包封率(EE，%)=(1－W游离/W总)×100%；测定5批样品（实施例1-5的产品）的包封率，结果显示药物平均包封率为91.56%；测得对比例1的产品的包封率为79.83%；

(2)精密称取抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂5mg置5ml量瓶中，加蒸馏水复溶，摇匀，得脂质体混悬液。精密量取脂质体混悬液250μl置10ml量瓶中，加乙醇1ml，超声20min，放冷至室温，用流动相定容，进样测定总药物量。另取脂质体混悬液适量置2ml离心管中，10000rpm离心10min，精密量取上清液250μl置10ml量瓶中，同上操作，测定游离药物量，根据公式：包封率(EE，%)=(1－W_游离/W_总)×100%，测定5批样品（实施例1-5的产品）的包封率（结果如表1所示），显示药物平均包封率为93.05%，测得对比例1的产品的包封率为82.25%。

表1

（二）抗糖尿病肾病活性物质脂质体稳定性考察

取冻干后的脂质体冻干品样品，分别于4℃和25℃放置6个月，于0、1、2、3、4、5、6月取样，考察外观、再分散性、含量、粒径和渗漏率。两种条件下脂质体冻干品均为浅黄色块状物；除25℃放置6个月的样品用水再分散的效果较差外，其它条件的样品加水振摇下150s都能快速分散成均匀的混悬液，再分散性良好。

渗漏率=[(W_初-W_贮)/W_初]×100%；W_初为初始包封率，采用表1的数据；W_贮为产品于4℃下放置4月之后的包封率，包封率测定方法同上，结果如表2所示。

表2

（三）药效学试验

以下通过本发明中配伍组分及制备的抗糖尿病肾病活性物质脂质体的药效学试验来进一步说明抗糖尿病肾病活性物质脂质体有关抗糖尿病肾病的有益效果：

试验：糖尿病肾病活性物质脂质体对体外高糖诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）及肾小球系膜细胞损伤的保护作用。

细胞株：人脐静脉内皮细胞（HUVEC），由山东大学提供；肾小球系膜细胞（HBZY-1），由上海研晶实业科技有限公司购买。

药品及试剂：MTT(SIGMA,USA)，DMSO(SIGMA,USA)，胰蛋白酶(SIGMA,USA)，DMEM/HIGHGLUCOSE(赛默飞世尔生物化学制品有限公司，北京)，特级胎牛血清FetalBovineSerum(Hyclone)；

仪器：超低温冰箱(Bio-TekInstruments，Inooski，VT，USA),pH计(Thermoorion，USA)，超净工作台(FLC-哈尔滨东联仪器厂)。

试验方法MTT法：将人脐静脉内皮细胞株和肾小球系膜细胞株分别按照常规方法培养传代，收集对数生长期细胞，调节单细胞混悬液浓度1×10⁵个/ml。将细胞混悬液加入6孔板中，每个孔加入3mL。置于37℃恒温培养箱中培养24h后进行实验，实验分组:（1）对照组:培养液中加等量的培养基,不加任何其他试剂;（2）高糖组:人脐静脉内皮细胞培养液中加入终浓度为80-120mmol/L的葡萄糖培养24h，肾小球系膜细胞培养液中加入终浓度为50-100mmol/L的葡萄糖培养24h;（3）枸杞多糖、桑叶黄酮和银杏叶黄酮的配伍干预组:两种细胞培养液中加入配伍组分(使其终浓度分别银杏叶黄酮：109.4μg/mL、桑叶黄酮：250μg/mL、枸杞多糖：310μg/mL)培养12h,然后在人脐静脉内皮细胞和肾小球系膜细胞培养液中分别加入终浓度为80mmol/L和55mmol/L的葡萄糖培养24h;（4）抗糖尿病肾病脂质体组:两种细胞培养液中加入抗糖尿病肾病脂质体(使其中的银杏叶黄酮为109.4、117.2或78.2μg/mL、桑叶黄酮为250、300或275μg/mL、枸杞多糖为310、346或290μg/mL)培养12h,然后在人脐静脉内皮细胞和肾小球系膜细胞培养液中分别加入终浓度为80mmol/L和55mmol/L的葡萄糖培养24h。并设有相应的空白对照组及无细胞调零孔。处理24小时后，及时收集细胞培养上清液测其中乳酸脱氢酶（LDH）、NO、人内皮素-1（ET-1）含量，并收集细胞裂解液检测细胞总蛋白含量，测总一氧化氮合酶（TNOS）、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)含量，并进行显著性比较，具体结果见表3、表4。

表3、不同处理对高糖损伤的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的影响

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与高糖组比较，^▲ P<0.05，^▲▲ P<0.01。

表4、不同处理对高糖损伤的肾小球系膜细胞（HBZY-1）的影响

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与高糖组比较，^▲ P<0.05，^▲▲ P<0.01。

通过抗糖尿病肾病活性物质脂质体的药效学试验得出，在高糖诱导下，人脐静脉内皮细胞与肾小球系膜细胞的乳酸脱氢酶（LDH）和ET-1水平均升高，已知在慢性肾炎中，这两种指标是内皮损伤的一个标志，并可使肾脏出现病理改变，肾小球滤过率减少，肾系膜增生，肾小球硬化，最终导致肾功能衰竭，配伍组与脂质体组能有效抑制这种炎症反应，而脂质体组效果更佳，实验结果得到LDH与ET-1的含量均下降并与正常组无显著差异。正常情况下内皮素1与一氧化氮的合成与释放处于动态平衡,保持血管正常收缩和舒张状态，一氧化氮水平的降低及内皮素-1水平的升高,两者的动态平衡被破坏,提示血管内皮功能受损，反之受到保护。本实验中，高糖诱导下，人脐静脉内皮细胞与肾小球系膜细胞的通透性均被破坏，细胞损伤，导致NO含量降低，而配伍组与脂质体组的NO含量均显著提升。由实验结果得出高糖组iNOS含量均升高，而大量实验证实iNOS升高是细胞产生炎性反应的标志，本实验配伍组与脂质体组均能抑制iNOS的升高。以上实验证实，配伍组与脂质体组均能在体外显著抑制糖尿病肾病，脂质体组的效果更加明显，能为医药界提供有效助力。

Claims (10)

1.一种抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂，其特征在于，所述活性物质为银杏叶黄酮、枸杞多糖和桑叶黄酮的混合物。

2.根据权利要求1所述的抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂，其特征在于，所述桑叶黄铜：枸杞多糖：银杏叶黄铜的质量比为2.2-3.5:2.8-3.7:1。

3.根据权利要求1或2所述的抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂，其特征在于，所述脂质体粉针剂是由以下重量份的原料组成：活性物质5-15份、磷脂酰胆碱0.1-10份、胆固醇2-30份、吐温-601-25份、蛋黄磷脂酰肌醇6-60份、抗氧剂0.03-5份、分散剂0.5-40份、冻干保护剂0.05-10份、磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求3所述的抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂，其特征在于，所述磷脂酰胆碱为氢化大豆磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二反式油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱中的一种或几种。

5.根据权利要求3所述的抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂，其特征在于，所述冻干保护剂为蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸中的一种或几种。

6.根据权利要求3所述的抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂，其特征在于，所述抗氧剂为维生素E、抗坏血酸、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、抗坏血酸棕榈酸酯中的一种或几种。

7.根据权利要求3所述的抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2-7.4。

8.根据权利要求3所述的抗糖尿病肾病活性物质脂质体粉针剂，其特征在于，所述分散剂为氯仿同甲醇按照体积比1:2-1:7组成。

9.一种如权利要求1-8任一项所述的抗氧化肾病活性物质脂质体粉针剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将蛋黄磷脂酰肌醇、胆固醇、吐温-60、磷脂酰胆碱的原料溶于分散剂中，得到油相混合物，并经过120℃蒸汽灭菌20min，后超声处理10min；

（2）将银杏叶黄酮、枸杞多糖和桑叶黄酮的活性物质混合物溶于一半质量浓度为5%抗氧剂-磷酸盐缓冲液中，得到水相混合物；

（3）将水相混合物边搅拌边注入油相混合物中，在10000r/min的搅拌速度下搅拌5min，间歇超声处理3-5min形成初乳,再添加剩余另一半质量浓度为5%的抗氧剂-磷酸盐缓冲液，继续用高速组织捣碎机以10000r/min的搅拌速度搅拌5min，继续间歇超声处理3-5min形成复乳；

（4）将复乳倒入梨形瓶中，在旋转蒸发仪上减压去除分散剂，在瓶壁上形成均匀的薄膜；

所述旋转蒸发仪的参数为：压强为30rpm,温度为37℃；

（5）将步骤（4）得到均匀的薄膜的梨形瓶中边加入质量浓度为5%的冻干保护剂-磷酸盐缓冲液边水浴孵化，直至干膜完全脱落下来，得到均匀分散的脂质体溶液；

（6）将脂质体溶液过高压均质机在500bar条件下进行5次循环高压均质处理，得到脂质体混悬液；

（7）将脂质体混悬液放入冰箱中，以5℃/min的速度快速降温至-45℃，于-45℃预冻15min，然后反复冻融3-4次；所述冻融：于-80℃恒温45min后在室温下解冻；

（8）取冻融处理的脂质体混悬液在温度为-80℃，真空度为8的真空冷冻干燥机中冷冻干燥28h，得到的冻干品即为粉针剂。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述水浴孵化在温度为37℃条件下进行。