CN105203647A

CN105203647A - 肝素钠中多硫酸软骨素和硫酸皮肤素的高灵敏度检测方法

Info

Publication number: CN105203647A
Application number: CN201410230578.6A
Authority: CN
Inventors: 张在忠; 郭林; 李�荣; 崔慧斐; 李加耀; 陈少鹏
Original assignee: DONGYING TIANDONG PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: DONGYING TIANDONG PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2014-05-29
Filing date: 2014-05-29
Publication date: 2015-12-30

Abstract

本发明涉及一种肝素钠中多硫酸软骨素和硫酸皮肤素的高灵敏度检测方法，其采用梯度洗脱方法进行洗脱，CIM-QA整体柱，整体柱的直径为12mm，整体柱的高度为3mm；流动相A为超纯水，流动相B为高纯水的混合溶液，该混合溶液由磷酸锂、二甲基甲酰胺、乙二醇和高纯水形成。本发明所述的高灵敏检测方法具有设备投入较低，检测成本低，而且操作简单的特点，而且检测灵敏度高，检测时间短，重现性好，可随时对多硫酸软骨素和硫酸皮肤素进行跟踪检测，适用于大规模生产中的质量控制。

Description

肝素钠中多硫酸软骨素和硫酸皮肤素的高灵敏度检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析的技术领域，更具体地说，本发明涉及一种肝素钠中多硫酸软骨素和硫酸皮肤素的高灵敏度检测方法。

背景技术

肝素(HP)是一种由葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸与乙酰葡萄糖胺以-1，4-糖苷键连接的重复二糖单位组成的酸性粘多糖，在临床上作为抗凝血药物广泛应用于血液透析、外科手术和心血管疾病的治疗。目前肝素是临床上使用时间最长而且仍在广泛使用的重要糖类药物。

肝素是我国重要的生化原料药出口品种之一，出口额目前已经超过8000万美元。但是2008年初在欧美等国家发生的肝素钠污染事件，我国的肝素钠行业为此面临严重的信誉危机，肝素钠的质量控制及临床使用的安全性也引起了国际社会的广泛关注。通过研究发现多硫酸软骨素被证实为引发问题肝素严重不良反应的异常杂质。另外硫酸皮肤素也是HP中难以检测且与HP结构上十分接近的杂质。目前，国内肝素钠行业对多硫酸软骨素进行检测的方法主要有核磁共振法和高效毛细管电泳方法，但是存在着仪器价格昂贵以及操作复杂等缺点，难以在日常检测中推广使用。中国发明专利申请CN102830150A公开了一种高效毛细管电泳方法(HPCE)的肝素钠中多硫酸软骨素的高灵敏度检测方法，但该方法设备售价高，成本较高；而且该方法不能实现多硫酸软骨素和硫酸皮肤素的同时检测；因此，现有技术中的检测方法仍有待改进和提高，检测成本也有待进一步降低。

发明内容

为了解决现有技术中所存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种肝素钠中多硫酸软骨素和硫酸皮肤素的高灵敏度检测方法；该方法不仅操作较为简单，可以同时实现OSCS和DS的检测，而且具有更好的灵敏度和准确度。

为了解决上述技术问题，本发明采用了以下技术方案：

一种肝素钠中多硫酸软骨素和硫酸皮肤素的高灵敏度检测方法，其特征在于：采用CIM-QA整体柱，整体柱的直径为12mm，整体柱的高度为3mm；流动相A为超纯水，流动相B为高纯水的混合溶液，该混合溶液由磷酸锂、二甲基甲酰胺、乙二醇和高纯水形成；其中，磷酸锂的含量为2.0mol/L、二甲基甲酰胺的含量为0.5mol/L、乙二醇的含量为0.2mol/L；采用梯度洗脱方法进行洗脱，洗脱条件为：0～2min：90v％A+10v％B～90v％A+10v％B，2～6min：90v％A+10v％B～72v％A+28v％B，6～8min：72v％A+28v％B～72v％A+28v％B，8～25min：72v％A+28v％B～100v％B。

其中，梯度洗脱时流速为0.18mL/min，柱温为30℃，检测波长为203nm。

其中，所述检测方法包括对照溶液的制备：分别取肝素钠、多硫酸软骨素、硫酸皮肤素，精密称定，用超纯水作为溶剂，配置成含20.0mg/mL的肝素钠、0.20mg/mL的多硫酸软骨素和0.20mg/mL的硫酸皮肤素的对照溶液。

其中，所述检测方法包括供试品溶液的制备：取肝素钠供试品，用超纯水配制成含肝素钠20.0mg/mL的溶液。

其中，采用的高效液相色谱仪包括LC-10Ai泵，CBM-20A控制器，SPD-20A紫外检测器，和LCsolution工作站。

与现有技术相比，本发明所述的高灵敏检测方法具有以下有益的技术效果：

本发明所述的高灵敏检测方法通过对色谱柱以及流动相组成的选择和设计，通过梯度洗脱方法，能够同时检测肝素钠中的多硫酸软骨素和硫酸皮肤素，而且分离度高、检测时间短、重现性好、线性关系良好、精密度高、稳定性好，而且灵敏度高。与现有技术相比，本发明的高灵敏度检测方法还操作简单、设备投入较低，检测成本低的优点，使用本发明的方法能够对多硫酸软骨素和硫酸皮肤素进行跟踪检测，适用于大规模生产中的质量控制。

附图说明

图1：实施例1所述的高灵敏度检测方法的肝素钠适用性图谱。

具体实施方式

下面将结合附图和具体的实施例对本发明所述的高灵敏度检测方法进行详细描述，但附图以及具体实施例不作为对本发明专利的限定。

实施例1

仪器与试剂：日本岛津公司高效液相色谱仪，采用LC-10Ai泵，CBM-20A控制器，SPD-20A紫外检测器，和LCsolution工作站。磷酸锂、二甲基甲酰胺、乙二醇均为色谱纯，水为超纯水。

对照溶液的制备：分别取肝素钠、多硫酸软骨素、硫酸皮肤素，精密称定，用超纯水作为溶剂，配置成含20.0mg/mL的肝素钠、0.20mg/mL的多硫酸软骨素和0.20mg/mL的硫酸皮肤素的对照溶液。对照溶液中肝素钠、多硫酸软骨素和硫酸皮肤素为USP标准品。

供试品溶液的制备：取肝素钠供试品，用超纯水配制成含肝素钠20.0mg/mL的溶液。

色谱条件与***适用性试验色谱柱：CIM-QA整体柱，整体柱的直径为12mm，整体柱的高度为3mm。流动相A为超纯水，流动相B为高纯水的混合溶液，该混合溶液由磷酸锂、二甲基甲酰胺、乙二醇和高纯水形成；其中，磷酸锂的含量为2.0mol/L、二甲基甲酰胺的含量为0.5mol/L、乙二醇的含量为0.2mol/L；采用梯度洗脱方法进行洗脱，梯度洗脱时流速为0.18mL/min，柱温为30℃，检测波长为203nm；并且洗脱条件如表1所示：

表1

时间(min)	流动相A(v％)	流动相B(v％)
			0～2	90	10
2～6	90→72	10→28
			6～8	72	28
8～25	72→0	28→100

本实施例所述的检测方法的适用性图谱如附图1所示，所述的多硫酸软骨素不仅与肝素钠主峰的分离性良好(3.28)，而且主峰与硫酸皮肤素的分离度也达到5.08。

专属性考察

对供试品中的各个物质，即0.20mg/mL的多硫酸软骨素溶液、0.20mg/mL的硫酸皮肤素溶液、20.0mg/mL的肝素钠溶液以及***适用性溶液含(20.0mg/mL的肝素钠、0.20mg/mL的多硫酸软骨素和0.20mg/mL的硫酸皮肤素)进行测定；并利用高纯水作为阴性对照液，发现在峰值位置无干扰，具有良好的专属性。

线性关系考察

取肝素钠、多硫酸软骨素、硫酸皮肤素的对照品用超纯水配置成一系列标准溶液：0.01～0.60mg/mL(肝素钠均为20.0mg/mL)。然后以峰面积为横坐标，以多硫算软骨素以及硫酸皮肤素的含量为纵坐标绘制标准曲线，然后回归方程，相关系数均达到0.999以上，结果表明多硫酸软骨素和硫酸皮肤素在0.01～0.60mg/mL范围内线性关系良好。

精密度试验

取对照溶液，连续进行5次测定，计算其相对标准偏差。结果表明多硫酸软骨素的相对标准偏差为0.18％，硫酸皮肤素的相对标准偏差为0.23％。

稳定性试验

取对照溶液，每5小时测定一次共测定5次，计算其相对标准偏差。结果表明多硫酸软骨素的相对标准偏差为0.15％，硫酸皮肤素的相对标准偏差为0.36％。

回收率试验

采用USP标准品，精密称取肝素钠，加入一定量的多硫酸软骨素和硫酸皮肤素，测定多硫酸软骨素的平均回收率为98.81％，硫酸皮肤素的回收率为98.57％。

检测限

在肝素钠含量为20mg/mL的情况下，多硫酸软骨素的检测限为0.02％，硫酸皮肤素的检测限为0.01％。

比较例1

与实施例1相比，区别在于：流动相A为超纯水，流动相B为高纯水的混合溶液，该混合溶液由磷酸二氢钠、二甲基甲酰胺、乙二醇和高纯水形成；其中，磷酸二氢钠的含量为2.0mol/L、二甲基甲酰胺的含量为0.5mol/L、乙二醇的含量为0.2mol/L。其余条件与实施例1相同。在该比较例中，多硫酸软骨素与肝素钠主峰的分离度为1.51，但肝素钠主峰与硫酸皮肤素的分离度仅为1.05不能实现完全分离。

比较例2

与实施例1相比，区别在于：流动相A为超纯水，流动相B为高纯水的混合溶液，该混合溶液由磷酸锂、二甲基甲酰胺和高纯水形成；其中，磷酸锂的含量为2.0mol/L、二甲基甲酰胺的含量为0.5mol/L。其余条件与实施例1相同。在该比较例中，多硫酸软骨素与肝素钠主峰的分离度仅为1.23，而且硫酸皮肤素的峰不明显。

比较例3

与实施例1相比，区别在于：流动相A为超纯水，流动相B为高纯水的混合溶液，该混合溶液由磷酸锂、乙二醇和高纯水形成；其中，磷酸锂的含量为2.0mol/L、乙二醇的含量为0.2mol/L。其余条件与实施例1相同。在该比较例中，多硫酸软骨素与肝素钠主峰的分离度为1.48，未达到通常的1.50的分离度条件，而且主峰响应值较低，而且硫酸皮肤素的峰不明显。

以上所述仅为本发明的优选实施例，不能解释为以此限定本发明的范围，凡在本发明的权利要求书要求保护的范围内所做出的等同的变形和改变的实施方式均在本发明所要求保护的范围内。

Claims

1.一种肝素钠中多硫酸软骨素和硫酸皮肤素的高灵敏度检测方法，其特征在于：采用CIM-QA整体柱，整体柱的直径为12mm，整体柱的高度为3mm；流动相A为超纯水，流动相B为高纯水的混合溶液，该混合溶液由磷酸锂、二甲基甲酰胺、乙二醇和高纯水形成；其中，磷酸锂的含量为2.0mol/L、二甲基甲酰胺的含量为0.5mol/L、乙二醇的含量为0.2mol/L；采用梯度洗脱方法进行洗脱，洗脱条件为：0～2min：90v％A+10v％B～90v％A+10v％B，2～6min：90v％A+10v％B～72v％A+28v％B，6～8min：72v％A+28v％B～72v％A+28v％B，8～25min：72v％A+28v％B～100v％B。

2.根据权利要求1所述的高灵敏度检测方法，其特征在于：梯度洗脱时流速为0.18mL/min，柱温为30℃，检测波长为203nm。

3.根据权利要求1所述的高灵敏度检测方法，其特征在于：采用的高效液相色谱仪包括LC-10Ai泵，CBM-20A控制器，SPD-20A紫外检测器，和LCsolution工作站。

4.根据权利要求1所述的高灵敏度检测方法，其特征在于：所述检测方法包括对照溶液的制备：分别取肝素钠、多硫酸软骨素、硫酸皮肤素，精密称定，用超纯水作为溶剂，配置成含20.0mg/mL的肝素钠、0.20mg/mL的多硫酸软骨素和0.20mg/mL的硫酸皮肤素的对照溶液。

5.根据权利要求1所述的高灵敏度检测方法，其特征在于：所述检测方法包括供试品溶液的制备：取肝素钠供试品，用超纯水配制成含肝素钠20.0mg/mL的溶液。

6.根据权利要求1所述的高灵敏度检测方法，其特征在于：在肝素钠含量为20mg/mL的情况下，多硫酸软骨素的检测限为0.02％，硫酸皮肤素的检测限为0.01％。