CN105203507B - 远心、宽场荧光扫描成像***和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种远心宽场荧光扫描***和方法。双远心光学成像***包括成像光学器件，其被布置和定位为使得第一远心空间产生或存在于样本平台和入口孔径光阑之间，其中来自所述样本平台上的多个场点的主要或主光线在穿过第一滤光片时彼此平行；并且使得第二远心空间产生或存在于光检测器和出口孔径光阑之间，其中来自多个场点的主要或主光线在穿过第二滤光片时彼此平行。以这种方式，从所述视场中的不同点收集的光以相同角度穿过所述第一滤光片，并且也以相同角度穿过所述第二滤光片，由此降低或消除角谱位移效应。

Description

远心、宽场荧光扫描成像***和方法

技术领域

本发明涉及定量荧光成像，并且更具体地涉及宽场荧光成像***和方法。各种实施例使得能够以对贯穿整个视场的接近完美的记录和测量，精确、定量、快速、连续宽场荧光成像，诸如激光线扫描。

背景技术

近年来，科研团体存在一种在组织成像工具中包括荧光检测的增长的期望。荧光检测提供一种更可控、稳定的方式，例如以识别某些药物的影响。现在，许多自动显微***包括荧光成像能力。这些***大多数通过使显微镜的载物台自动化，或者向自动扫描仪添加显微成像器而建立。通常已经使它们的焦距自动执行典型的病理学家在他/她在显微镜下检查组织载玻片时而执行的任务。这意味着这种***必须首先是显微镜。显微成像提供很大的优点，包括亚细胞细节，以及匹配病理学家通过显微镜直接观察的图像的潜力，但是同时其趋向于非常缓慢。显微镜物镜对非常小的区域成像。例如，20X NA＝0.75物镜以～0.4μm的解析度对小于0.5mm宽的区域成像。所以，50mm x 25mm的载玻片面积将需要以停走倾斜成像的5000个图像。通常，这对于彩色成像不是问题，如成像H&E(苏木精和伊红)染色，因为短曝光时间足以检测信号。然而，对于荧光成像，低丰度标记将需要更长曝光时间，并且因此这些方法导致扫描时间更长。更长扫描时间与典型实验要求扫描多个载玻片使得确定进一步研究的感兴趣区域的事实结合意味着每次实验的总处理周期可能变为几小时，要不就是几天。

在较快速显微镜自动技术中，其中之一为现在是徕卡生物***一部分的AperioTechnologies公司的Soenksen研发的美国专利8,385,619中公开的技术。Soenksen意识到加快显微镜***中的载玻片成像以及作为减少切片(带)的图像数目的具体实施线成像自动化的需求。Soenksen使用线扫描时间延迟积分(TDI)相机以及物镜和聚焦光学器件，以一次对一条线成像。TDI相机允许宽位照明(通过灯或LED)，并且一次读取作为一条线的图像。这种技术确实提高了显微镜自动化，并且实现了更快的扫描结果以及较少拼图失配问题。所实现的扫描时间似乎对于直接彩色成像(H&E染色)可接受，其中每个成像线的曝光时间可能短，所以其覆盖较宽区域的总时间可能是合理的。但是，对于荧光成像，这种技术仍需要每条线的较长曝光时间，并且结果是总扫描时间长得多。这对其中研究者将在他/她还未了解他在寻找何物之前存在需要检查的一系列载玻片的情况产生瓶颈。仅基于扫描载玻片的时间，仍存在一种对快速优先分配步骤的需求，以在自动化显微镜***上确定哪个载玻片具有将值得扫描的区域。期望这种优先分配步骤敏感，使得其不丢失下游***可能检测到的图像。同样也期望相对位置以及相对信号再现的精确性，使得精确地评定是否进行至过程中的下一步骤，并且如果进行至下一步骤，确切地以高解析度扫描何处。

诸如美国专利8,385,619中公开的基于显微镜的***允许通过使用较低放大率的物镜“显微成像”，从而对单通以更宽视场成像，并且因而以较少时间覆盖较大面积。然而，这种方法存在至少两种主要限制的问题。首先，这种方法每线图像需要的曝光时间长得多，因为低放大率物镜的NA比高放大率物镜低得多。例如，与变为光收集效率小～(0.75/0.075)^2＝100倍的用于20X的NA＝0.75相比，典型的2X物镜具有低于0.075的NA。其次，显微镜的视场越大，朝着视场周界的衰减和畸变越大。这继而分别变为横跨视场的敏感性变化以及多次通过之间的不精确记录。这些限制是基于物镜的成像***工作方式所固有的。

显微和宏观两者的荧光成像的现有技术的另一关键缺点在于由于干涉滤光片的角谱位移导致的信号吞吐量和横跨视场的光学背景抑制的变化。许多荧光染料的发射光谱窄并且具有陡坡。图1示出用于LI-COR的

800cw的典型吸收和发射光谱。在图1中，也在图形上重叠用于在发射路径中选择某个窗口的典型长通滤光片。其显示两种入射光条件下的滤光片的发射光谱：零度入射角(曲线3a)和20度入射角(曲线3b)。在用于

800cw的大多数情况下，将需要将长通滤光片的边缘布置在发射曲线2的陡坡上，以便允许激发光匹配吸收曲线1的空间。这意味着，如果在光穿过滤光片时入射角度改变，则所收集的光量(在该角度下)改变。如果从视场的不同点收集的光最终以不同角度穿过滤光片，则即使以相同的激发光量照亮两个位置，结果测量值也不同。

n<sub>eff</sub>＝	2
			λ<sub>0</sub>＝	800	nm
			θ	Δλ＝λ(θ)·λ<sub>0</sub>
0°	0.00	nm
			10°	3.02	nm
20°	11.77	nm
			30°	25.38	nm

表1

表1示出典型干涉滤光片的光谱位移量。在许多应用中，该量不大，显微镜应用中尤其如此，其中存在可能限制其对于量化测量的有用性，例如其对焦距可变性的敏感性的其它更重要因素。对于大多数显微镜***，包括美国专利8,385,619中公开的***，都不存在避免这种问题的措施，并且因此滤光片通常都位于物镜和聚焦光学器件之间，其中通过物镜的成像清晰度，来自不同场点的光必须以不同角度在与样本侧相反的物镜侧穿过(例如，参见美国专利8,385,619的说明书附图2的元件(以附图标记50在其中标记)，以及美国专利申请2011/0121199的说明书附图2的Tanikawa元件(以附图标记13在其中标记))。

本发明人认识到需要平均地提高横跨整个视场的背景抑制并且将其应用于对小动物成像的需求。例如参见美国专利7,286,232。图2示出该方法的一个实施例，其中在成像光学器件12和检测器阵列13之间产生远心空间18，使得从目标10上的不同点收集的光以相同的角度范围穿过发射滤光片15。也在目标区域10和成像光学器件12之间添加拒波滤光片14，以进一步提高拒波滤波。通过在成像光学器件12的前焦距平面处设置光圈16而产生远心空间。这对于该目的以及任何类似的单拍宏观成像都运行良好。不需要担心如本情况下的对目标扫描以覆盖更大区域，并且因此也不关注光穿过拒波滤光片时的角度变化。然后，拒波滤光片的目标在于作为对放置在远心空间内的主发射滤波器的改进而抑制反射光。不存在不牺牲信号地(即，降低成像NA)将这种前光圈技术应用于拒波滤光片的明确方式，并且不期望诸如组织截面和组织阵列中的低丰度标记。

其他人已经认识到实现各种任务但是不具有这里需要的功能的远心突出体的有用性，即通过横跨整个视场的光谱滤光均匀性连续地、宽场成像。Sung-Ho Jo的美国专利申请2012/0313008提供一种荧光检测器设计，其具有位于荧光选择单元(滤波器)和光接收单元(检测器)之间的远心透镜。使用这种远心透镜的目的在于保持从不同井(well)收集的光分离。因此，这不是一种其中同时对连续区域或线成像的成像应用。此外，荧光选择单元仍处于非远心空间内。Gutekunst的美国专利7,687,260中的类似设计提供从地点(井)阵列收集光。这里，通过在井的顶部上使用场透镜而在物侧上产生远心空间。这也未解决滤光可变性。Guntekunst的美国专利7,687,260的说明书附图1中显示的成像滤光片(以附图标记9在其中标记)仍处于非远心空间中。此外，这不是其中关注对失真和相对位置精确性更严要求的宽场、连续成像。这种技术自身不适用于，与其它上述技术的组合也不适用于本宽场成像问题。

其它基于远心的理念也存在于流式细胞仪，其也不是宽场成像应用。例如，Imanishi的美国专利8,467,055公开了使用透镜(以附图标记48在其中标记)，以在检测器阵列侧上产生远心空间，使得光栅(以附图标记47在其中标记)产生的不同光束以类似的角度进入检测器。这里也不存在关注，并且因此未特别提供其中布置光谱滤光片的空间。

因此，仍存在一种不具有取决于场中光所发源的角度的限制的更鲁棒、定量、快速宏观荧光成像器的需求。此外，仍存在一种对精确地保持荧光在样本上的起源的相对位置的需求，使得精确地对齐多通图像，并且因而消除当前宏观宽场成像器中存在的焦距相关位置位移。

发明内容

本公开涉及定量荧光成像，并且更具体地涉及宽场荧光成像***和方法。

根据实施例，提供一种荧光成像***，其通常包括：源子***，其具有保持荧光材料的样本平台；光源，其以处于荧光材料的吸收带中的激发光照亮荧光材料；和第一滤光片，其使除了激发光之外的光的波长通过，第一滤光片位于样本平台和双远心光学成像***的入口孔径光阑之间的第一光路径中。该荧光成像***通常也包括：检测器子***，以检测来自荧光材料的光，包括具有感测位置阵列的光检测器；和第二滤光片，其使荧光材料的发射带中的光的波长通过，第二滤光片位于光检测器和双远心光学成像***的出口孔径光阑之间的第二光路径中。该荧光成像***通常还包括双远心光学成像***，其包括成像光学器件，其被布置和定位为使得第一远心空间产生或存在于样本平台和入口孔径光阑之间的第一光路径中，其中来自样本平台上的多个场点的主要或主光线在穿过第一滤光片时彼此平行；并且使得第二远心空间产生或存在于光检测器和出口孔径光阑之间的第二光路径中，其中来自多个场点的主要或主光线在穿过第二滤光片时彼此平行。以这种方式，从视场中的不同点收集的光以相同的角度穿过第一滤光片，并且也以相同的角度穿过第二滤光片，由此降低或消除角谱位移效应。

在某些方面，该双远心光学成像***包括奥夫纳中继镜***布置，其包括具有球面镜表面的第一镜元件以及具有球面镜表面的第二镜元件，其中入口孔径光阑和出口孔径光阑每个都包括第一镜元件的一部分。在某些方面，第一镜元件存在凸状镜表面，并且其中第二镜元件存在凹状镜表面。

在某些方面，该双远心光学成像***包括双远心透镜布置，其中入口孔径光阑包括第一折射透镜元件，并且其中出口孔径光阑包括第二折射透镜元件。

在某些方面，样本平台上的连续场点同时成像到光检测器上的连续感测位置上。在某些方面，光检测器包括CCD阵列检测器或其它光检测器或传感器。

根据另一实施例，提供一种对荧光材料成像的方法，该荧光材料吸收处于波长的吸收带内的光，并且发射处于波长的发射带内的荧光。该方法通常包括：以具有吸收带内的激发光的照明光束照亮样本平台上的荧光材料的第一部分；和使用检测器***检测来自荧光材料的第一部分的发射，该检测器***包括：具有感测位置的阵列的光检测器；双远心光学成像***；使除了激发光之外的光的波长通过的第一滤光片，该第一滤光片位于样本平台和双远心光学成像***的入口孔径光阑之间的第一光路径中；和使处于发射带内的光的波长通过的第二滤光片，该第二滤光片位于光检测器和双远心光学成像***的出口孔径光阑之间的第二光路径中。该方法中使用的双远心光学成像***通常包括成像光学器件，其被布置和定位为：第一远心空间存在于样本平台和入口孔径光阑之间的第一光路径中，其中来自样本平台上的多个场点的主光线在穿过第一滤光片时彼此平行；并且使得第二远心空间存在于光检测器和出口孔径光阑之间的第二光路径中，其中来自多个场点的主光线在穿过第二滤光片时彼此平行，并且其中样本平台上的连续场点同时成像到检测器上的连续感测位置上，以形成第一检测器图像。

参考本说明的其余部分，包括附图和权利要求，将认识到本发明的其它特征和优点。下面关于附图详细地描述本发明的进一步特征和优点，以及本发明的各种实施例的结构和操作。在附图中，相同附图标记指示相同或功能类似的元件。

附图说明

图1示出用于LI-COR的

800cw的典型吸收和发射光谱。

图2示出在成像光学器件和检测器阵列之间产生的远心空间，使得从目标上的不同点收集的光以相同角度范围穿过发射滤光片。

图3a描绘了包括一次对整个区域成像的区域成像。

图3b描绘了一次对一条线成像的线成像。

图4a和4b分别示出根据一个实施例的荧光成像***的前视图和侧视图。

图5a和5b分别示出根据另一实施例的荧光成像***的前视图和侧视图。

图6a和6b示出可能与图5a和5b中示出的实施例一起使用的激光线发生器301的实例。

图7示出在根据实施例的一个***中与图5a和5b的双远心、线成像光学元件组合在一起的图6a和6b的线发生器光学元件。

图8a和8b分别示出根据另一实施例的荧光成像***的前视图和侧视图。

图9a和9b分别示出根据另一实施例的荧光成像***的前视图和侧视图。

具体实施方式

为了以荧光成像，以具有第一光谱成分(激发光)的光学信号照亮目标(例如，含荧光材料)，其中一部分这种信号被至少一部分目标吸收，并且作为第二光谱成分(发射光)的光学信号重新发射。然后，发射光被检测***检测为该位置的该目标存在的量的测量值。因此，对标以荧光的区域成像需要传输至目标区域的激发光；从目标区域收集光并且将其投射到光学检测器(例如，检测器阵列)上的成像***；和使所发出的荧光与穿过成像***的该部分激发光分离的装置。通常，后者包括一个或多个干涉滤光片。

这里考虑的宽场成像包括以保留每个点在连续区域中的相对位置的方式，同时从连续区域收集光以及将其投射到反射器阵列上，诸如CCD或具有感测位置或像素的阵列的其它检测器。这与在一个时间点收集光，并且继而在不同时间点扫描，使得覆盖更大区域，即点扫描成像不同。这也与从大区域收集光，并且将大量的光聚集到检测器上，并且将其作为总信号读取不同。后者通常用于不需要特定位置信息的许多测量技术。

本领域技术人员应理解，可使用其它类型的有用传感器或检测器以及传感器阵列，诸如CCD和CMOS传感器。其它有用的传感器可包括光电二极管、雪崩光电二极管、硅光电倍增器装置、光电倍增管阵列、焦平面阵列等等。

两种宽场成像包括区域成像和线扫描。图3a描绘了区域成像，其包括一次对整个区域102a成像，其尺寸取决于各种设计因素，包括期望解析度、可用组件(检测器、成像透镜等等)、成本、敏感度和速度。通过连续地对不同子区域成像并且通过软件将它们拼接在一起而覆盖比一次曝光可能成像大的目标区域。这一分类中存在许多技术，每种都对具体应用最优化和/或关注特殊优点。在该图示中，荧光标记的目标区域处于样本平台或培养基101(例如，载玻片)的顶部，并且可能覆盖平台或其一部分上的整个x-y表面区域。宽场成像***103将子区域102a成像到阵列检测器104上。如果需要对比102大的区域成像，则平台101和/或成像***就沿x和/或y方向平移，并且获取另外的子区域图像。

图3b描述了线扫描，其中一次对一条线成像。与区域成像的情况一样，也由类似的设计因素规定线102b的长度。这里，宽场成像***103以连续方式对线102b成像，使得同时对沿该线的每个点成像。取决于期望的特定测量，阵列检测器104可能包括一个或多个线性阵列。为了覆盖这里的区域，样本平台101和/或成像***通常沿x轴平移，并且然后沿y轴步进以获取另一通过。

在区域成像和线成像应用两者中，可通过下列方式实现扫描，即在检测***和目标保持固定的同时横跨目标区域移动照明灯，例如使用扫描镜或类似的元件，其使照明光束随着时间依次瞄准不同目标位置，并且因而检测***瞄准这些位置。作为另一实例，可通过下列方式实现扫描，即相对于固定的照明光束和固定的检测***移动样本平台，或者通过在保持样本平台固定的同时移动照明和检测***两者。

远心成像涉及其中来自图像的所有点的主光线都彼此平行。一种设计可能在下列物镜空间中为远心的，其中主要或主光线在成像光学器件的第一元件和样本之间的空间中彼此平行。另一方面，在图像空间中为远心的一种设计在最后成像光学器件和检测器阵列之间的其主要或主光线彼此平行。再次参考图2，沿样本10长度的每个点xa、xb产生绕称为主光线的中心光线17a、17b的光锥11a、11b。这种光锥穿过光圈16，其中主光线17a、17b穿过其中心，并且然后由成像透镜12聚焦。由于来自样本10的所有主光线都穿过其继而位于透镜12的前焦距长度F上的光圈16的中心，所以这些主光线将在透镜12的另一侧(检测器一侧)上平行(产生远心空间18)。通过这种方式，所有的光锥都将具有相同平行方向，即它们的主光线在远心空间18中彼此平行。因而，每个光锥11a、11b以及其间的每个点都将经过滤光片15的相同过滤效果，使得对于在滤光片15上的等量入射光，就存在等量的离开光。远心性的另一优点在于，当远心空间中的距离，例如图2中的透镜12和检测器13之间的距离改变时，检测器13处的主光线之间的距离保持不变。光圈16和样本10之间的非远心一侧就不是这种情况。如果光圈16和样本10之间的前距离改变，则不仅焦距改变，而且主光线17a、17b之间的距离也改变，并且拍摄样本10之间的每一距离也改变，这使得该侧上的缩放比例对焦距误差敏感。

图4a和4b分别示出根据一个实施例的荧光成像***210的前视图和侧视图。所示荧光显示***210包括奥夫纳中继镜***，其具有一起产生接近完美成像的双远心1：1成像***的主镜元件203a和次镜元件203b。镜元件203a和203b每个都存在大致球形镜表面，至少在光与每个元件相互作用的位置如此。这种设计达到了在这种镜***中存在对称性的目的，从而产生物体空间和图像空间远心区域两者，使得能够如图所示地布置拒波滤光片207和发射滤光片206两者，而不牺牲任何光收集能力或成像性能。例如，如图所示，拒波滤光片207位于物体空间远心区域中，并且发射滤光片206位于图像空间远心区域中。以这种方式，通过彼此平行的主光线完成所有滤光，并且在调节焦距时，主光线之间的距离不变。这种成像技术的放大率，并且因此位置精确性对焦距误差非常不敏感，并且因此图像-图像或通过-通过记录非常鲁棒。孔径光阑限定光学***收集或允许进入光学***的光锥的尺寸。如图4a中所示，镜元件203b起入口孔径光阑和出口孔径光阑两者的作用。也就是说，物体空间远心区域产生或存在于样本平台200和限定入口孔径光阑的镜元件203b的一部分之间的光路径中，并且图像空间远心区域产生或存在于检测器205和限定出口孔径光阑的该部分镜元件203b之间的光路径中。孔径光阑也存在于主光线穿过其中心，即横穿光学轴(对于反射镜，光在其射中反射镜后改变方向)的位置处；镜元件203b存在于主光线射中中心(该反射镜的光学轴)的位置处。

在某些方面，拒波滤光片207包括一个或多个滤光片元件，其拒绝(或滤出)激发光波长，同时视需要允许其它光波长通过。类似地，发射滤光片206包括一个或多个滤光片元件，其允许发射带波长通过，同时视需要拒绝其它波长。有用滤光片的实例包括：陷波滤光片，以阻断大部分激发光；和带通滤光片，以进一步阻断通过陷波滤光片渗漏的任何残余激发光。

参考图4a，光源201产生优选接***行的激发光束202，其照亮样本区域200的一部分。光源201可包括激光源(例如，二极管激光器或其它激光源)、LED、宽带灯等等以及适当的可选光学元件，以视需要使光束成型。激发光束202可被配置成照亮如图所示的样本上用于区域成像应用的区域，或者可被配置成照亮样本上用于线扫描应用的线。从样本区域200上的每一点，存在光锥208，其包括处于其中心的以远心方式穿过拒波滤光片207的主光线，主光线被奥夫纳镜元件203a和203b再次聚焦至图像侧，其中主光线在也与其垂直地以远心方式达到检测器阵列205之前，也以远心方式穿过发射滤光片206。使用可选折叠镜204以重新引导路径，以易于封装。图4b示出也在y-z平面中远心地成像。通过这种成像***，也可在完全远心滤光条件下以荧光对条区域成像。通过扫描样本平台或成像***至其它不同区域，并且将所有图像拼接在一起而覆盖更大样本区域，从而产生期望总区域的均匀、连续图像。

图5a和5b分别示出根据另一实施例的荧光成像***310的前视图和侧视图。荧光成像***310包括所有远心奥夫纳式荧光中继***的激光线扫描版本。参考图5a，光源301，诸如激光线光源产生激发光，并且发出聚焦线状光束，并且将其投射到样本300上。优选地，激光线被成型，以聚焦在垂直于入射平面的线上，其中照明线沿其长度基本均匀，并且在其它方向中窄，例如衍射受限。这种激发线产生的荧光信号从沿该线的每一点产生光锥，其中主光线处于其中心，主光线以远心方式穿过滤光片307，由奥夫纳中继镜303a和303b向另一侧再次成像，也以远心方式穿过发射滤光片306，并且也以远心方式照射在检测器阵列305上。图5b示出y-z平面图，其示出该实施例中的远心空间沿下列线，该线沿y轴成像。该线在x方向中的宽度小，由所需扫描步骤解析率限定。例如，对于5μm扫描解析率，线的宽度为约5至约20μm宽。线的长度匹配检测器阵列的长度或者稍微更长(例如，通常在约1mm至约10mm的级别)。

激光线扫描实施例存在许多另外的优点。例如，在通过引用以其整体并入本文的US2012/0257087中提供一种激光差分扫描方法，其减少来自散射型培养基，诸如组织或膜，以及成像路径中的光学组件的光学背景。也可将这种改进集成到本实施例中，以进一步提高***的敏感性。这通过使用检测器实现，其中对于每个激光照亮位置同时获取两条线图像，一个处于激光照亮位置，并且另一个处于其中主要激发光束不能到达的相邻区域中。后者被读取为背景的线图像，并且从荧光线图像中减去该图像。结果差异包含荧光信号和最小背景信号。

激光线扫描的另外优点包括一个方向(例如，x-z平面)的可用性，从而将滤光片反射的信号远离成像路径地倾斜，以进一步减少背景，而不负面地影响沿线(例如，y-z平面)的成像性能。在图5a中，示出拒波滤光器307为倾斜的(例如，倾斜角度可为约4至约8度或更大)，使得其反射的大部分都背离样本300处的测量区域。同样地，发射滤光片306也类似地在x-z平面中倾斜，使得其反射不穿回奥夫纳成像中继***和到达样本300。

奥夫纳成像中继***的又另一优点在于其反射性并且因此其是消色差的，这使得其易于组合超过一种颜色，而不需要任何颜色相关的调节或修正。

可在图5a和5b中表示的实施例中使用的组件的实例包括：

303a前表面凹镜，其中曲率半径R＝80mm

303b前表面凸镜，其中曲率半径R＝40mm

304前表面平镜

305CCD检测器

306发射带通滤光片，实例为510nm至550nm

307拒波滤光片，实例为500nm长通。

图6a和6b示出可与图5a和5b中所示的实施例一起使用的激光线发生器301的实例。激光线发生器301包括激光二极管式***，其产生均匀的激光线302并且将其聚焦在样本平面300上。激光二极管400被平行透镜401平行化，并且穿过激发滤光片402。来自滤光片402的平行、滤光输出通常为高斯光束的形式，然后进入线发生器透镜403，然后进入圆柱形透镜404和圆柱形透镜405，以产生沿线长度具有接***顶(均匀)轮廓并且在其它方向中为高斯轮廓的平行、均匀线。然后，这种平行线在高斯光束平面中聚焦到样本平面300上。可在图6a和6b表示的实施例中使用的组件实例为：

400激光二极管，实例为日亚公司的488nm激光二极管

401非球面透镜

402中心为激光二极管波长的带通滤光片

403鲍威尔透镜

404圆柱形透镜，实例为F＝12.5mm

405圆柱形透镜，实例为F＝15mm

图7示出图6a和6b的线发生器光学元件与图5a和5b的双远心、线成像光学元件在一个***中组合在一起。如图所示，包括另外的镜元件406和407以重新引导光束302。

图8a和8b分别示出根据实施例的荧光成像***510的前视图和侧视图。所示荧光成像***510包括双远心透镜式光学成像***503，其具有第一折射透镜元件503a和第二折射透镜元件503b。透镜元件503a包括入口孔径光阑，其中在目标平台300和透镜元件503a之间产生远心空间。类似地，透镜元件503b包括出口孔径光阑，其中在透镜元件503b和检测器305之间产生远心空间。两个孔径光阑可能相同或类似。拒波滤光片307位于物体空间远心区域中，并且发射滤光片306位于图像空间远心区域中。以这种方式，通过彼此平行的主光线完成所有滤光，并且在调节焦距时，主光线之间的距离不变。类似于图5a，光源301，诸如激光线光源产生激发光，并且发出聚焦的线状光束，并且将其投射到样本300上。

应理解，第一折射透镜元件和第二折射透镜元件每个都可包括超过一个透镜元件。也应理解，第一孔径光阑和第二孔径光阑每个都可处于空气中，或者分别位于第一和第二折射透镜元件内的所有透镜之前，或者分别处于第一和第二折射透镜元件中部的某处，或者分别位于第一和第二折射透镜元件内的所有透镜之后。例如，折射透镜元件内的透镜元件可包括孔径光阑。

图9a和9b分别示出根据实施例的荧光成像***510的前视图和侧视图。图9a和9b中示出的构造与图8a和8b中所示的类似，其中添加了定位为将激发光束302朝着样本300反射的二向色滤光片元件504。样本300处发射的荧光穿过二向色滤光片元件504，以到达双远心成像***503。二向色滤光片元件504也处于远心空间中，并且因此其光谱滤光以相同方式影响连续区域或线内的所有点。应明白，图8a和8b和9a和9b中所示的构造适用于区域成像和线成像应用。

通过引用将本文提及的所有专利、专利申请和其它参考文献整体并入本文。

虽然已经为了清楚和理解相当详细地描述了上述发明，但是本领域技术人员通过阅读本公开应明白，不偏离本发明的真实范围，可做出形式和细节的各种改变。例如，可能以各种组合使用上述所有技术和设备。在好象每个个别公开、发明、发明申请和/或其它文献都单独示为出于所有目的而引用并入的某种程度上，出于所有目的通过引用以其整体将本申请中列举的所有公开、发明、发明申请和/或其它文献并入。

Claims (17)

1.一种荧光成像***，包括：

源子***，所述源子***具有：

样本平台，所述样本平台保持荧光材料；

光源，所述光源以处于所述荧光材料的吸收带中的激发光照亮所述荧光材料；和

第一滤光片，所述第一滤光片使除了所述激发光之外的光的波长通过，所述第一滤光片位于所述样本平台和双远心光学成像***的入口孔径光阑之间的第一光路径中；

检测器子***，所述检测器子***用于检测来自所述荧光材料的光，包括：

光检测器，所述光检测器具有感测位置的阵列；和

第二滤光片，所述第二滤光片使所述荧光材料的发射带中的光的波长通过，所述第二滤光片位于所述光检测器和所述双远心光学成像***的出口孔径光阑之间的第二光路径中；和

双远心光学成像***，所述双远心光学成像***包括成像光学器件，所述成像光学器件被布置和定位为使得第一远心空间存在于所述样本平台和所述入口孔径光阑之间的所述第一光路径中，其中，来自所述样本平台上的多个场点的主光线在穿过所述第一滤光片时彼此平行；并且使得第二远心空间存在于所述光检测器和所述出口孔径光阑之间的所述第二光路径中，其中，来自所述多个场点的主光线在穿过所述第二滤光片时彼此平行。

2.根据权利要求1所述的成像***，其中，所述双远心光学成像***包括奥夫纳中继镜***布置，所述奥夫纳中继镜***布置包括具有球面镜表面的第一镜元件以及具有球面镜表面的第二镜元件，其中，所述入口孔径光阑和所述出口孔径光阑每个都包括所述第一镜元件的一部分。

3.根据权利要求2所述的成像***，其中，所述第一镜元件存在凸状镜表面，并且其中，所述第二镜元件存在凹状镜表面。

4.根据权利要求1所述的成像***，其中，所述双远心光学成像***包括双远心透镜布置，其中，所述入口孔径光阑包括第一折射透镜元件，并且其中，所述出口孔径光阑包括第二折射透镜元件。

5.根据权利要求1所述的成像***，其中，所述光源发出当照射在所述荧光材料上时具有线状轮廓的均匀照明光束。

6.根据权利要求1所述的成像***，其中，所述光源包括二极管激光器。

7.根据权利要求1所述的成像***，其中，所述光检测器包括CCD阵列检测器。

8.根据权利要求7所述的成像***，其中，所述样本平台上的连续场点同时成像到所述CCD阵列检测器上的连续感测位置上。

9.根据权利要求1所述的成像***，其中，所述样本平台上的连续场点同时成像到所述光检测器上的连续感测位置上。

10.一种对荧光材料成像的方法，所述荧光材料吸收处于波长的吸收带内的光，并且发射处于波长的发射带内的荧光，所述方法包括：

a)以具有所述吸收带内的激发光的照明光束照亮样本平台上的荧光材料的第一部分；和

b)使用检测器***检测来自所述荧光材料的第一部分的发射，所述检测器***包括：具有感测位置的阵列的光检测器；双远心光学成像***；使除了所述激发光之外的光的波长通过的第一滤光片，所述第一滤光片位于所述样本平台和所述双远心光学成像***的入口孔径光阑之间的第一光路径中；和使处于所述发射带内的光的波长通过的第二滤光片，所述第二滤光片位于所述光检测器和所述双远心光学成像***的出口孔径光阑之间的第二光路径中，

其中，所述双远心光学成像***包括成像光学器件，所述成像光学器件被布置和定位为：使得第一远心空间存在于所述样本平台和所述入口孔径光阑之间的第一光路径中，其中，来自所述样本平台上的多个场点的主光线在穿过所述第一滤光片时彼此平行；并且使得第二远心空间存在于所述光检测器和所述出口孔径光阑之间的第二光路径中，其中，来自所述多个场点的主光线在穿过所述第二滤光片时彼此平行，并且

其中，所述样本平台上的连续场点同时成像到所述检测器上的连续感测位置上，以形成第一检测器图像。

11.根据权利要求10所述的方法，进一步包括在平行于所述样本平台限定的表面的方向中移动所述样本平台和所述照明光束中的一个或两者，以便照亮所述荧光材料的第二部分，并且重复上述检测步骤b)，以形成第二检测器图像。

12.根据权利要求11所述的方法，进一步包括组合所述第一和第二检测器图像。

13.根据权利要求10所述的方法，进一步包括在平行于所述样本平台限定的表面的方向中重复地移动所述样本平台和所述照明光束中的一个或两者，以便照亮所述荧光材料的多个部分，并且重复上述检测步骤b)，以形成多个第二检测器图像，以及组合所述第一检测器图像和所述多个第二检测器图像。

14.根据权利要求10所述的方法，其中，所述照亮包括对激光束的输出整形，使得所述激光束当照射在所述样本平台上时具有线状轮廓。

15.根据权利要求10所述的方法，其中，所述双远心光学成像***包括奥夫纳中继镜***布置，所述奥夫纳中继镜***布置包括具有球面镜表面的第一镜元件以及具有球面镜表面的第二镜元件，其中，所述入口孔径光阑和所述出口孔径光阑每个都包括所述第一镜元件的一部分。

16.根据权利要求10所述的方法，其中，所述双远心光学成像***包括双远心透镜布置，其中，所述入口孔径光阑包括第一折射透镜元件，并且其中，所述出口孔径光阑包括第二折射透镜元件。

17.根据权利要求10所述的方法，其中，所述光检测器包括CCD阵列检测器。

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