CN105199095B - 一种基于巯基物质检测的两亲性分子探针及其合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种基于巯基物质检测的两亲性分子探针及其合成方法。首先利用Sonogashira偶联反应通过“一锅法”合成寡聚苯撑乙炔(OPE)结构的刚性单元，以实现其荧光性；随后通过酰胺化反应接上带有双硫键的吡啶基团；最后用连有巯基的氨基聚乙二醇(SH‑PEG‑NH2)链替换吡啶基团，实现两亲性分子探针的制备。这种新型的分子探针具有非常好的水溶性(在水溶液中形成的纳米颗粒尺寸为5‑6纳米)和生物相容性，在巯基分子存在下，该探针分子中的双硫键迅速被打断，使得原探针的两亲性丧失，在水中形成强烈的分子间聚集导致荧光的急剧下降，从而可视化监测巯基分子的存在。
Description
技术领域
本发明属于生物功能化传感材料技术领域，具体涉及一种对巯基分子具有特异性响应的双光子荧光探针的合成以及在细胞内巯基分子检测中的应用。
背景技术
细胞内巯基化合物(包括半胱氨酸、高半胱氨酸和还原型谷胱甘肽等)在维持生命体系的氧化还原动态平衡方面起着重要的作用。而且某些巯基化合物水平的高低与很多疾病密切相关，如：癌症、老年痴呆症和心血管疾病等。相比于其他检测方法，荧光分析法因其具有灵敏度高、选择性好、动态响应范围宽及易于进行原位分析等优点而在生物分子检测中受到人们的广泛关注。同时，与紫外光相比，近红外光因具有较深的组织穿透能力和较小的组织伤害更加适合于临床应用。因此，开发一类对巯基分子具有高效响应性的近红外荧光分子探针在生物医学领域具有重要意义。
发明内容
技术问题：本发明的目的是提供一种对细胞内巯基分子具有高灵敏度和高特异性响应的近红外荧光探针的合成方法以及对细胞外/细胞内巯基分子的高效检测应用。
技术方案：本发明的一种基于巯基物质检测的两亲性分子探针具有如下分子结构：
其中，n为重复单元个数，x为PEG链的平均分子量；n值为5，11，17；x值为1000，2000。
本发明的的基于巯基物质检测的两亲性分子探针的合成方法具体如下：
合成的具体步骤如下：
1)、化合物1的合成：
将4-溴苯酚，无水碳酸钾和四丁基溴化胺加入到一容器中，抽真空氮气保护下加入溶剂丙酮，随后加入溴代十二烷，然后将反应体系升温到58～60摄氏度，回流反应；反应结束后抽滤除去碳酸钾，滤液旋干后用乙醇重结晶，最终得到白色鳞状晶体；
2)、化合物2的合成：
将化合物1、1,4-二乙炔基苯、5-溴间苯二甲酸二甲酯、催化剂四(三苯基膦)钯和碘化亚铜加入到一反应瓶中；将整个反应体系密封抽真空，然后充入氮气，保持整个反应过程在氮气氛围中进行，注入溶剂二异丙胺，避光条件下80～83摄氏度搅拌反应20～24小时，反应结束后减压蒸干溶剂，粗产物经硅胶柱提纯,最终得到的产物为淡黄色固体粉末；
3)、化合物3的合成：
将化合物2溶于四氢呋喃中，再加入氢氧化钾水溶液和四丁基溴化铵,混合溶液在50～60摄氏度下搅拌回流4～5小时，反应结束后，向体系中加入过量的稀盐酸水溶液，直到产生大量的絮状沉淀，过滤，滤渣用水反复洗涤，真空干燥，得到黄色固体产物；
4)、化合物4，5的合成
将2，2'-二硫二吡啶和巯基乙胺溶于甲醇中，室温搅拌7～10小时，后旋干溶剂得到氨基取代的二硫吡啶中间产物；再向反应瓶中加入N,N-二甲基甲酰胺,超声溶解后投入化合物3、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌20～24小时得到不纯的化合物4；反应结束后直接投入过量的SH-PEG-NH2，滴加醋酸，室温搅拌2～3天；反应结束后用截留分子量3000～3500Da的透析袋在去离子水中进行透析，透析过程持续2～3天；用滤膜推滤透析袋中的液体，得到澄清透明的水溶液后再冷冻干燥，最终得到的化合物5为淡黄色固体粉末，即基于巯基物质检测的两亲性分子探针。
本发明基于巯基物质检测的两亲性分子探针在巯基物质检测中的应用，将该探针分子中的双硫键能被含有巯基的生物分子迅速打断，使得原探针的两亲性丧失，在水中形成强烈的分子间聚集导致荧光的急剧下降，从而可视化监测巯基分子的存在，具体方法如下：
1)、细胞外检测：将所制备的两亲性分子探针和目标检测物半胱氨酸在PBS缓冲溶液37摄氏度中共孵育，实时检测不同时间点溶液荧光的变化，并通过动态光散射DLS和透射电镜TEM观察粒子尺寸及形貌的变化；为了验证探针检测的特异性，选取一系列含不同官能团的氨基酸和探针共孵育，用同样的方法观察检测效果，其中所用两亲性分子探针的n值为11，x值为1000，
2)、细胞内检测：将所制备的两亲性分子探针和肿瘤细胞Hela进行共孵育，在双光子激发下观察不同时间点细胞内荧光的变化；选取正常细胞NIH-3T3和加入巯基抑制剂的Hela细胞进行对照实验，结果为：Hela细胞在探针存在下培养1小时后荧光明显减弱，而NIH-3T3细胞和加入巯基抑制剂的Hela细胞在培养1小时后荧光没有明显变化。
实验证明该探针在巯基物质检测方面具有很好的特异性。
有益效果：本发明首先通过“一锅法”Sonogashira偶联反应合成一端连有疏水性烷基链的寡聚苯撑乙炔(OPE)刚性单元，再利用另一端的羧基进行酰胺化反应接上带有双硫键的吡啶基团，最后通过巯基PEG链的替换反应很方便的实现了两亲性荧光探针的制备。本发明中所涵盖的材料具有好的水溶性、生物相容性、优异的发光性能以及具有对巯基分子高特异性高灵敏度的响应。该探针在水溶液中分散后形成的纳米颗粒极小(5-6纳米)，可以很方便的被细胞摄取，一旦和肿瘤细胞中过量表达的巯基分子(谷胱甘肽)接触后，能迅速发生特异性反应导致荧光的急剧淬灭，从而达到检测的目的。通过调节疏水性烷基链和亲水性PEG链的相对长度，可以优化出检测性能最佳的荧光探针。同时，PEG末端的氨基可以进一步修饰以实现其生物多功能化。再者，该类探针的双光子吸收性质为其实现深层组织检测和高空间分辨率成像提供了保障。总之，该类分子探针在生物医学检测领域可以发挥重要作用，是一类非常理想的生物传感材料。
具体实施方式
采用Sonogashira不对称偶联反应等步骤，合成主链含寡聚苯撑乙炔，两端分别连有疏水性的烷基链和双硫键连接的亲水性聚乙二醇链的两亲性分子探针。该类具有近红外吸收的两亲性巯基分子探针的结构如下：
其中，n为重复单元个数，x为PEG链的平均分子量。
n值为5，11，17；x值为1000，2000。
当n值为11，x值为1000时，上述化合物的分子结构式如下：
本发明的上述化合物的合成方法如下：
1)、化合物1的合成：
将4-溴苯酚，无水碳酸钾和四丁基溴化胺加入到一容器中，抽真空氮气保护下加入溶剂丙酮，随后加入溴代十二烷，然后将反应体系升温到58～60摄氏度，回流反应；反应结束后抽滤除去碳酸钾，滤液旋干后用乙醇重结晶，最终得到白色鳞状晶体；
2)、化合物2的合成：
将化合物1、1,4-二乙炔基苯、5-溴间苯二甲酸二甲酯、催化剂四(三苯基膦)钯和碘化亚铜加入到一反应瓶中；将整个反应体系密封抽真空，然后充入氮气，保持整个反应过程在氮气氛围中进行，注入溶剂二异丙胺，避光条件下80～83摄氏度搅拌反应20～24小时，反应结束后减压蒸干溶剂，粗产物经硅胶柱提纯,最终得到的产物为淡黄色固体粉末；
3)、化合物3的合成：
将化合物2溶于四氢呋喃中，再加入氢氧化钾水溶液和四丁基溴化铵,混合溶液在50～60摄氏度下搅拌回流4～5小时，反应结束后，向体系中加入过量的稀盐酸水溶液，直到产生大量的絮状沉淀，过滤，滤渣用水反复洗涤，真空干燥，得到黄色固体产物；
4)、化合物4，5的合成
将2，2'-二硫二吡啶和巯基乙胺溶于甲醇中，室温搅拌7～10小时，后旋干溶剂得到氨基取代的二硫吡啶中间产物；再向反应瓶中加入N,N-二甲基甲酰胺,超声溶解后投入化合物3、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌20～24小时得到不纯的化合物4；反应结束后直接投入过量的SH-PEG-NH2，滴加醋酸，室温搅拌2～3天；反应结束后用截留分子量3000～3500Da的透析袋在去离子水中进行透析，透析过程持续2～3天；用滤膜推滤透析袋中的液体，得到澄清透明的水溶液后再冷冻干燥，最终得到的化合物5为淡黄色固体粉末，即基于巯基物质检测的两亲性分子探针。
为了更好地理解本发明，下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。实例1(两亲性分子探针的n值为11，x值为1000)的合成方法如下：
1)、化合物1的合成：
将4-溴苯酚，无水碳酸钾和四丁基溴化胺加入到一容器中，抽真空氮气保护下加入溶剂丙酮，随后加入溴代十二烷，然后将反应体系升温到58～60摄氏度，回流反应；反应结束后抽滤除去碳酸钾，滤液旋干后用乙醇重结晶，最终得到白色鳞状晶体1；1H NMR(CDCl3,ppm):δ7.35(d,2H),6.78(d,2H),3.91(t,2H),1.76(m,2H),1.26(m,18H),0.88(t,3H)。
2)、化合物2的合成：
将化合物1、1,4-二乙炔基苯、5-溴间苯二甲酸二甲酯、催化剂四(三苯基膦)钯和碘化亚铜加入到一反应瓶中；将整个反应体系密封抽真空，然后充入氮气，保持整个反应过程在氮气氛围中进行，注入溶剂二异丙胺，避光条件下80～83摄氏度搅拌反应20～24小时，反应结束后减压蒸干溶剂，粗产物经硅胶柱提纯,最终得到的产物为淡黄色固体粉末2。1HNMR(CDCl3,ppm):δ8.63(s,1H),8.37(s,2H),7.49(m,6H),6.89(d,2H),3.97(m,8H),1.79(m,2H),1.26(s,18H),0.88(t,3H)。
3)、化合物3的合成：
将化合物2溶于四氢呋喃中，再加入氢氧化钾水溶液和四丁基溴化铵,混合溶液在50～60摄氏度下搅拌回流4～5小时，反应结束后，向体系中加入过量的稀盐酸水溶液，直到产生大量的絮状沉淀，过滤，滤渣用水反复洗涤，真空干燥，得到黄色固体产物3；1H NMR(dimethyl sulfoxide-d6,ppm):δ8.44(s,1H),8.25(s,2H),7.47-7.68(m,6H),6.95(d,2H),3.98(t,2H),1.69(m,2H),1.22(m,18H),0.83(t,3H)。13C NMR(dimethyl sulfoxide-d6,ppm):δ166.3,159.7,136.1,133.6,132.5,131.9,130.5,123.9,115.4,70.2,68.1,56.5,31.8,29.5,29.2,25.9,22.6,14.4。MALDI-TOF,m/z:Calcd,550.3；Found,550.3(M+)。
4)、化合物4，5的合成
将2，2'-二硫二吡啶和巯基乙胺溶于甲醇中，室温搅拌7～10小时，后旋干溶剂得到氨基取代的二硫吡啶中间产物；再向反应瓶中加入N,N-二甲基甲酰胺,超声溶解后投入化合物3、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌20～24小时得到不纯的化合物4；反应结束后直接投入过量的SH-PEG-NH2，滴加醋酸，室温搅拌2～3天；反应结束后用截留分子量3000～3500Da的透析袋在去离子水中进行透析，透析过程持续2～3天；用滤膜推滤透析袋中的液体，得到澄清透明的水溶液后再冷冻干燥，最终得到的化合物5为淡黄色固体粉末，即基于巯基物质检测的两亲性分子探针。1H NMR(CDCl3,ppm):δ8.24,7.49,6.81-7.00(m,benzene ring),5.22-5.51(br,NH2),3.97(Ph-O-CH2),3.64(PEGchain),2.75-3.25(CH2-CH2-S-S),1.25(alkyl chain)。MALDI-TOF MS(the highest peak,m/z):4665.3(M+).
应用研究
1、方法：采用Sonogashira不对称偶联反应等步骤，合成主链含寡聚苯撑乙炔，两端分别连有疏水性烷基链和双硫键连接的亲水性聚乙二醇链的两亲性分子探针。基于该探针中的双硫键能被含有巯基的生物分子特异性切断从而产生荧光信号的变化，我们通过调节探针的亲水/疏水平衡，最终优化出检测效果最好的结构。由于PEG是一种低毒性、生物相容性非常好的物质，所以该类探针可以很容易地进入生物细胞体内，达到检测的作用，是一种非常理想的生物传感材料。2、实验步骤：实验分细胞外和细胞内两部分进行。
细胞外检测：将所制备的两亲性分子探针和目标检测物半胱氨酸在PBS缓冲溶液中共孵育(37摄氏度)，实时检测不同时间点溶液荧光的变化，并通过动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)观察粒子尺寸及形貌的变化。为了验证探针检测的特异性，我们选取一系列含不同官能团的氨基酸和探针共孵育，用同样的方法观察检测效果。其中所用探针的n值为11，x值为1000；
细胞内检测：将所制备的两亲性分子探针和肿瘤细胞Hela进行共孵育，在双光子激发下观察不同时间点细胞内荧光的变化；选取正常细胞NIH-3T3和加入巯基抑制剂的Hela细胞进行对照实验。
Claims (4)
1.一种基于巯基物质检测的两亲性分子探针，其特征在于该两亲性分子探针具有如下分子结构：
其中，n为重复单元个数，x为PEG链的平均分子量；n值为5，11，17；x值为1000，2000。
2.一种如权利要求1所述的基于巯基物质检测的两亲性分子探针的合成方法，其特征在于该合成方法具体如下：
3.如权利要求2所述的基于巯基物质检测的两亲性分子探针的合成方法，其特征在于合成的具体步骤如下：
1)、化合物1的合成：
将4-溴苯酚，无水碳酸钾和四丁基溴化铵加入到一容器中，抽真空氮气保护下加入溶剂丙酮，随后加入溴代十二烷，然后将反应体系升温到58～60摄氏度，回流反应；反应结束后抽滤除去碳酸钾，滤液旋干后用乙醇重结晶，最终得到白色鳞状晶体；
2)、化合物2的合成：
将化合物1、1,4-二乙炔基苯、5-溴间苯二甲酸二甲酯、催化剂四(三苯基膦)钯和碘化亚铜加入到一反应瓶中；将整个反应体系密封抽真空，然后充入氮气，保持整个反应过程在氮气氛围中进行，注入溶剂二异丙胺，避光条件下80～83摄氏度搅拌反应20～24小时，反应结束后减压蒸干溶剂，粗产物经硅胶柱提纯,最终得到的产物为淡黄色固体粉末；
3)、化合物3的合成：
将化合物2溶于四氢呋喃中，再加入氢氧化钾水溶液和四丁基溴化铵,混合溶液在50～60摄氏度下搅拌回流4～5小时，反应结束后，向体系中加入过量的稀盐酸水溶液，直到产生大量的絮状沉淀，过滤，滤渣用水反复洗涤，真空干燥，得到黄色固体产物；
4)、化合物4，5的合成
将2，2'-二硫二吡啶和巯基乙胺溶于甲醇中，室温搅拌7～10小时，后旋干溶剂得到氨基取代的二硫吡啶中间产物；再向反应瓶中加入N,N-二甲基甲酰胺,超声溶解后投入化合物3、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌20～24小时得到不纯的化合物4；反应结束后直接投入过量的SH-PEGx-NH2，其中x＝1000或2000，滴加醋酸，室温搅拌2～3天；反应结束后用截留分子量3000～3500Da的透析袋在去离子水中进行透析，透析过程持续2～3天；用滤膜推滤透析袋中的液体，得到澄清透明的水溶液后再冷冻干燥，最终得到的化合物5为淡黄色固体粉末，即基于巯基物质检测的两亲性分子探针。
4.一种如权利要求1所述的基于巯基物质检测的两亲性分子探针在巯基物质检测中的应用，其特征在于，将该探针分子中的双硫键能被含有巯基的生物分子迅速打断，使得原探针的两亲性丧失，在水中形成强烈的分子间聚集导致荧光的急剧下降，从而可视化监测巯基分子的存在，具体方法如下：
1)、细胞外检测：将所制备的两亲性分子探针和目标检测物半胱氨酸在PBS缓冲溶液37摄氏度中共孵育，实时检测不同时间点溶液荧光的变化，并通过动态光散射DLS和透射电镜TEM观察粒子尺寸及形貌的变化；为了验证探针检测的特异性，选取一系列含不同官能团的氨基酸和探针共孵育，用同样的方法观察检测效果，其中所用的两亲性分子探针的n值为11，x值为1000，
2)、细胞内检测：将所制备的两亲性分子探针和肿瘤细胞Hela进行共孵育，在双光子激发下观察不同时间点细胞内荧光的变化；选取正常细胞NIH-3T3和加入巯基抑制剂的Hela细胞进行对照实验，结果为：Hela细胞在探针存在下培养1小时后荧光明显减弱，而NIH-3T3细胞和加入巯基抑制剂的Hela细胞在培养1小时后荧光没有明显变化。
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