CN105193808A

CN105193808A - Bdsf与伊曲康唑联用对临床耐药白念珠菌的协同药效

Info

Publication number: CN105193808A
Application number: CN201510662576.9A
Authority: CN
Inventors: 翁丽星; 李丹; 徐振华
Original assignee: Nanjing Post and Telecommunication University
Current assignee: Nanjing Post and Telecommunication University; Nanjing University of Posts and Telecommunications
Priority date: 2015-10-14
Filing date: 2015-10-14
Publication date: 2015-12-30

Abstract

本发明公开了BDSF与伊曲康唑联合用药对两株多耐药菌株(No.1和No.2)呈现协同作用，而BDSF与两性霉素B联合用药显示为无关作用。实时荧光定量PCR结果显示，对于No.1菌株，BDSF与伊曲康唑联合用药与伊曲康唑单用相比，cdr1和mdr1分别下降了49.4％和53.1％。而对于No.2菌株，BDSF与伊曲康唑联合用药与伊曲康唑单用相比，cdr1和mdr1分别下降了66.9％,70.9％。同时这两株耐药菌中，ddr48和upc2的表达均无明显变化。结果表明BDSF与伊曲康唑联合用药对两株多耐药菌株出现协同作用可能是通过cdr1和mdr1的途径而实现的，BDSF与唑类药物联合用药作为临床治疗白念珠菌的新方法值得进一步研究。

Description

BDSF与伊曲康唑联用对临床耐药白念珠菌的协同药效

技术领域

本发明属于生物药品技术领域。具体涉及一种小分子短链脂肪酸BDSF与伊曲康唑联用对临床耐药白念珠菌的协同药效方面相关生物功能的影响。

背景技术

真菌感染对人类的健康和生命产生持续而严重的威胁。随着现代医学的发展，细胞性毒物、广谱抗生素以及免疫抑制剂的广泛使用，器官及骨髓移植、恶性肿瘤和免疫缺陷患者的普遍增多，消化管道、血液透析、导管插管等先进医疗手段的逐渐应用，真菌感染的发生率越来越高。白念珠菌的耐药现象也日益严重，并已成为临床治疗面临的一大难题。有研究显示念珠菌对氟康唑敏感性下降(MIC≥16μg/mL)的菌株所占的百分率由1991～1996年的10.7％升高至1997～2003年的11.7％。另有来自台湾的报道，侵袭性念珠菌分离株对氟康唑敏感率为91％～96％，耐药率为0.7％～2.4％。联合用药具有更广泛的功能，能够比单一用药具有更大的药物效力，而且还可能提高用药的安全性和耐受性并减少耐药菌的数量，因而，联合用药被认为是一种有效抑制真菌耐药性增加的方法。30多年前，Bennettetal发现用两性霉素B和5-FC联合治疗隐球菌性脑膜炎比单独用药有效，此后，运用联合用药的方法治疗临床真菌疾病就一直被重视。迄今为止，有很多发表的报告研究各种体外抗真菌药物的联合作用。除了抗真菌药物联合作用外，许多研究者也在研究其他药物与抗真菌药物联合，以期找到更有效地治疗念珠菌的方法。BDSF是一种由Burkholderiacenocepacia分泌产生的小分子短链脂肪酸。虽然汪联辉、张玉倩等人对其以酵母相为起点的测定其对白念珠菌菌丝生长的影响以及在生物膜形成早期，cis-BDSF和trans-BDSF能够明显抑制白念珠菌生物膜的形成等方面进行了研究。

发明内容

发明目的为研究真菌的抗药性，本发明提供了一种小分子短链脂肪酸BDSF与伊曲康唑联用对临床耐药白念珠菌的协同药效的研究方案。

技术方案：BDSF与伊曲康唑联用用途，其特征在于用于临床耐药白念珠菌。BDSF与伊曲康唑联合用药于两株既耐伊曲康唑又耐两性毒素B菌株(No.1和No.2)；BDSF与唑类药物出现协同作用是通过cdr1和mdr1的途径而实现；

微量肉汤稀释法测定白念珠菌单独在伊曲康唑和两性霉素B中最低抑菌浓度(MIC)，然后再用联合作用的药敏试验(微量棋盘稀释法)和抑菌曲线法测定抑菌指数，最后实时荧光定量RT-PCR法分析联合其效果。

有益效果：

1、本研究中的BDSF与伊曲康唑联合时对多耐药白念珠菌有明显的协同作用，这为临床上治疗严重的念珠菌感染病人提供了新的方法，也是用于治疗临床产生的耐药菌株的方法。

2、本专利的创新点在于通过将白色念珠菌分别与BDSF和伊曲康唑单独作用以及协同作用比较杀菌效果。本专利使用的联合作用的药敏试验(微量棋盘稀释法)中，对于NO.1白色念珠菌来说，BDSF与伊曲康唑联合作用时，BDSF的联合抑菌浓度是8μg/ml，与单独作用时的≥256μg/ml相比，降低了32倍；而伊曲康唑则降低了16倍，由4μg/ml降至0.25μg/ml，FICI≤0.09。而对于NO.2菌株来说，BDSF与伊曲康唑联合作用时，BDSF的联合抑菌浓度是64μg/ml，与单独作用时的≥256μg/ml相比，降低了4倍；而伊曲康唑则降低了32倍，由8μg/ml降至0.25μg/ml，FICI≤0.28，对两株交叉耐药菌株而言，BDSF与氟康唑与伊曲康唑联合作用时有明显的协同作用。

3、再者本专利使用的抑菌曲线法中结果表明，对于NO.1白色念珠菌株，而伊曲康唑与BDSF联用比伊曲康唑单独作用时降低了4log₁₀CFUml^-1，对于No.2白色念珠菌株，BDSF与伊曲康唑联合作用比伊曲康唑单独作用时降低了4log₁₀CFUml^-1。故本专利中时间-杀菌曲线结果与微量棋盘稀释法检测的结果基本一致。

4、最后本实验中的实时荧光定量RT-PCR法结果表明，对于No.1白色念珠菌株，伊曲康唑和BDSF联合作用与伊曲康唑单独作用相比，cdr1和mdr1的mRNA表达水平分别降低了49.4％,53.1％。而对于No.2菌株，伊曲康唑与BDSF联合作用与伊曲康唑单独作用相比，伊曲康唑中cdr1和mdr1的mRNA表达水平则降低了66.9％,70.9％。这些数据都表明伊曲康唑与BDSF联合作用都比单独作用时有明显的抑菌效果。

5、此外，BDSF不是抗真菌药物，不会引起白念珠菌对其产生耐药性，因此，若BDSF与抗真菌药物联合起到协同作用，必定会为临床治疗白念珠菌提供帮助。

附图说明

图1.数据结果显示伊曲康唑以及两性霉素对109株白念珠菌的最低抑菌浓度(部分)。

图2.数据结果显示微量棋盘稀释法检测BDSF与伊曲康唑以及两性霉素两种抗真菌药物联合作用效果。

图3.数据结果显示BDSF与两种抗真菌药物的联合作用的时间-杀菌曲线

图4.数据结果显示BDSF与伊曲康唑联合作用可能是对mdr1和cdr1的mRNA表达水平产生影响，进一步影响到抗真菌作用的。

具体实施方式

研究BDSF与伊曲康唑联用对临床耐药白念珠菌的协同药效，采用如下步骤：

(1)肉汤稀释法测定白念珠菌单独在伊曲康唑和两性霉素B中最低抑菌浓度(MIC)。

(2)联合作用的药敏试验(微量棋盘稀释法)和抑菌曲线法测定抑菌指数。

步骤i.将伊曲康唑和两性霉素B(SigmachemicalCo.)用RPMI1640培养基倍比稀释成不同浓度后加入到96孔板中，第1-11孔加入100μL抗菌药物，第12孔不加药作为对照组。；

步骤ii.各菌株复苏后在SDA平板培养24h后挑取单菌落，用RPMI1640培养基将菌悬液稀释，使菌液浓度约为1-5*10³CFU，以此作为初始菌液；

步骤iii.向已制备好的MIC板中每孔加入100μL初始菌悬液，密封后置35℃静置培养24h。

步骤ⅳ.伊曲康唑和两性霉素B用RPMI1640培养基倍比稀释成不同浓度梯度依次加入2-8列，稀释后的不同浓度梯度BDSF依次加入A-G列。

步骤ⅴ.向已制备好的MIC板中每孔加入100μL初始菌悬液，密封后置35℃静置培养24h。

(3)实时荧光定量RT-PCR法分析联合作用机理。

步骤i.白色念珠菌用YPD培养基稀释并分别加入伊曲康唑/两性霉素B、BDSF、伊曲康唑/两性霉素B+BDSF及空白对照组于35℃,220rpm培养24h；

步骤ii.酵母RNA快速抽提试剂盒提取生物膜RNA，用DNaseI降解DNA。用TevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit合成cDNA，cDNA分装保存于-20℃；

步骤iii.cDNA用超纯水稀释1:16后作为定量PCR的模板，标线cDNA按4倍梯度稀释至1：45，定量PCR试剂盒和仪器应用于本实验。act基因用来作对照计算基因表达的变化，实验重复4次。

为了更好地理解本发明专利的内容，下面通过具体的实例来进一步说明本发明的技术方案。但这些实施实例并不限制本发明。

实施例1：肉汤稀释法测定白念珠菌单独在伊曲康唑和两性霉素B中最低抑菌浓度(MIC)实验，如图1所示:

(1)将各菌株接种于SDA平板，于37℃恒温静置培养24h，挑取单菌落于YPD培养基中过夜培养(30℃，160rpm，12-24h)，6000rpm离心后去上清，用无菌PBS清洗两次，重悬于20％甘油，保存于-80℃低温冰箱。使用时，将甘油管中菌株接种于SDA平板复苏，平板上菌株4℃保存，不超过一周。

(2)将伊曲康唑和两性霉素B(SigmachemicalCo.)用RPMI1640培养基倍比稀释成不同浓度后加入到96孔板中，第1-11孔加入100μL抗菌药物，第12孔不加药作为对照组。制备完成后，-20℃保存，备用。

(3)各菌株复苏后在SDA平板培养24h后挑取单菌落，并用0.85％生理盐水校正浓度至0.5麦氏比浊标准的菌悬液。后用RPMI1640培养基将菌悬液稀释，使菌液浓度约为1-5*10³CFU，以此作为初始菌液。向已制备好的MIC板中每孔加入100μL初始菌悬液。

(4)1-11孔的伊曲康唑和两性霉素B的浓度为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μg/ml。密封后置35℃静置培养24h，同时用酶标仪测定OD₅₃₀来验证最低抑菌浓度。实验均重复三次。

实施例2：联合作用的药敏试验(微量棋盘稀释法)和抑菌曲线法测定抑菌指数实验，如图2所示:

(1)伊曲康唑和两性霉素B用RPMI1640培养基倍比稀释成不同浓度梯度，最低梯度浓度为最低抑菌浓度的2倍，每个稀释浓度为最终测试浓度4倍。50μL稀释后的不同浓度梯度药物依次加入2-8列，50μL稀释后的不同浓度梯度BDSF依次加入A-G列。因此，H1孔因不含药物和BDSF而作为对照孔。

(2)菌株复苏后在SDA平板培养24h后挑取单菌落，并用0.85％生理盐水校正浓度，用RPMI1640培养基将菌悬液稀释，使菌液浓度约为1-5*10³CFU，以此作为初始菌液。向已制备好的MIC板中每孔加入100μL初始菌悬液。96孔板密封后于35℃静置培养24h后用酶标仪测定OD₅₃₀。

实施例3：时间-杀菌曲线(Time-KillCurve)法测定抑菌指数实验，如图3所示:

(1)各菌株复苏后在SDA平板培养24h后挑取单菌落，并用0.85％生理盐水校正浓度至0.5麦氏比浊标准的菌悬液。后用RPMI1640培养基将菌悬液稀释，使菌液浓度约为1～5*10³CFU，以此作为初始菌液。

(2)将定量伊曲康唑/两性霉素B(1/2MIC抗菌药物)、BDSF(1/2MICBDSF)、伊曲康唑/两性霉素B+BDSF(1/2MIC抗菌药物+1/2MICBDSF)试管和无药试管内接种同种定量菌悬液，于35℃培养。分别于0,2,6,12,24,36和48小时取定量试管内的培养物，经适当稀释后，均匀涂于SDA平板上，培养24h后测定每个SDA平板上的菌落数，并绘制所测定药物的“时间－杀菌”曲线。

实施例4：实时荧光定量RT-PCR分析联合作用机理的实验，如图4所示(A为1号菌，B为2号菌):

(1)cdr1、mdr1、upc2和ddr48以及内参基因act的全基因序列由国家生物技术信息中心网站(NCBI)获得，利用AccelrysDSGene1.5设计引物；

(2)各菌株在SDA平板培养24h后，挑取单菌落于YPD培养基(酵母浸出膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％)中培养至浓度为OD₅₃₀＝0.1。将培养物用YPD培养基稀释并分别加入伊曲康唑/两性霉素B(1/2MIC抗菌药物)、BDSF(1/2MICBDSF)、伊曲康唑/两性霉素B+BDSF(1/2MIC抗菌药物+1/2MICBDSF)及空白对照组于35℃,220rpm培养24h。

(3)用EASYspin酵母RNA快速抽提试剂盒(Yuanpinghao)提取生物膜RNA，之后用DNaseI(Tiangen)降解DNA。用TevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit(Fermentas)合成cDNA，cDNA分装保存于-20℃。

(4)cDNA用超纯水稀释1:16后作为定量PCR的模板，标线cDNA按4倍梯度稀释至1：45，定量PCR试剂盒SYBRPremixEXTagTMKit(Takara)和仪器StratageneMx3000pSystem应用于本实验。利用看家基因act作为对照计算基因表达的变化，实验重复4次。平均值和标准方差都是通过GrapPadPrism软件计算。

Claims

1.BDSF与伊曲康唑联用用途，其特征在于用于临床耐药白念珠菌用途与方法。

2.权利要求1所述的BDSF与伊曲康唑联用用途的作用，其特征在于，BDSF与伊曲康唑联合用药于既耐伊曲康唑又耐两性毒素B菌株。

3.权利要求1所述的BDSF与伊曲康唑联用用途的作用方法，其特征在于，BDSF与唑类药物出现协同作用是通过cdr1和mdr1的途径而实现。

4.权利要求1所述的BDSF与伊曲康唑联用用途的作用方法，其特征在于微量肉汤稀释法测定白念珠菌单独在伊曲康唑和两性霉素B中最低抑菌浓度(MIC)，然后再用联合作用的药敏试验(微量棋盘稀释法)和抑菌曲线法测定抑菌指数，最后实时荧光定量RT-PCR法分析联合其效果。

5.根据权利要求4所述的BDSF与伊曲康唑联用用途的作用方法，其特征在于采用BDSF与伊曲康挫联用以及BDSF单独单独使用有的方法分析抑菌效果。