CN105192665B - 一种虾风味液及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种虾风味液及其制备方法与应用。所述制备方法包括如下步骤：1)制备虾头酶解液：将虾头和水混合粉碎，得到虾头粉碎液；再将所述虾头粉碎液和蛋白酶混合进行酶解，得到虾头酶解液；2)制备虾风味液：将还原糖、氨基酸和所述虾头酶解液混合进行美拉德反应，得到虾风味液。制备方法简单、可行，其产品质量基本可达到同类产品的要求，采用了酶解耦合美拉德反应的方法，得到了色泽良好、营养丰富、虾味浓郁的虾风味液。一方面能充分利用虾头等宝贵资源，变废为宝；另一方面也可以解决虾头对环境的污染问题。可用作食品风味添加剂，为虾头的综合利用开辟了一条新路，如作为方便面、肉制品加工等领域的重要配料，市场前景非常广阔。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种虾风味液及其制备方法与应用。
背景技术
近年来，世界各国不断发展虾养殖业，促使虾养殖业为全球经济发展、食物供给、粮食安全、就业和扶贫等做出了巨大贡献。中国的南美白对虾(penaeus vannamei)产量在全世界位居第一，南美白对虾，学名凡纳对虾，是世界上养殖虾类产盆最高的三大种类之一，原产于中、南美洲的太平洋沿岸水域，现已成为我国主要的养殖虾类。对虾不仅营养丰富，味道鲜美，价格便宜，而且还对人体具有保健功能，一直深受消费者的青睐。王凌燕等研究表明，对虾的水分含量较高，在自然条件下极易腐败变质，难以贮藏和运输，从而造成对虾营养价值的损失和资源的浪费。因此，为有效利用这一海洋生物资源，要对刚收获的虾进行加工处理，我国出口对虾以去头虾为主，在对虾加工过程中会产生大量的虾头，每年产生的虾头以万吨计。目前由于加工技术的滞后，这部分资源仅有少部分被加工成动物饲料及被用来提炼虾青素、甲壳素、氨基酸等加以利用，绝大部分被作为垃圾丢弃，这不仅造成资源的极大浪费，还给环境带来严重的污染，影响当地居民的生活。
据报导，在中国食品界，风味调味品还是新兴产品，发展史不超30年。而现有的国内外调味品的研究方法主要分为三种，第一种是由辛香料、天然香料和合成香料调香制成；第二种是以水解动、植物蛋白为基料，添加辛香料、天然香料和合成香料调配而成；第三种是以水解动、植物蛋白热反应产物为基料，添加辛香料、天然香料和合成香料调配而成。
发明内容
本发明的目的是提供一种虾风味液及其制备方法。
本发明所提供的制备方法，包括如下步骤：
1)制备虾头酶解液：将虾头和水混合粉碎，得到虾头粉碎液；再将所述虾头粉碎液和蛋白酶混合进行酶解，得到虾头酶解液；
2)制备虾风味液：将还原糖、氨基酸和步骤1)中所述虾头酶解液混合进行美拉德反应，得到虾风味液。
上述制备方法中，步骤1)中，所述虾头具体为南美白对虾虾头，南美白对虾虾头的头和胸部统称为头部，从南美白对虾的内部结构和外部形态可以看出，虾头集中了南美白对虾体内的绝大部分器官，在体长和重量上约占整个虾的1/3。
所述虾头和水的质量比为1：(1-2)，具体可为1:1。
为了更好的与水混合，在使用虾头之前，先将冷冻保藏的虾头拿出解冻，再用研钵捣碎。
所述粉碎可于打浆机中进行，所述粉碎的粒径具体为120-180μm。
所述蛋白酶为复合蛋白酶(型号为Protamex)，酶活1.04×105U/g、风味蛋白酶(型号为Flavourzyme 500MG)，酶活1.5AU/g、水解蛋白酶(型号为Alcalase2.4L FG)，酶活0.6AU/g或中性蛋白酶(型号为Neutrase)，酶活0.5AU/g，均购自诺维信(中国)生物技术有限公司。
所述蛋白酶的添加量为所述虾头粉碎液质量的0.5％-1.5％。
所述酶解的条件如下：酶解温度为40-60℃、酶解时间为2-6h、酶解pH为6.5-7.5。
当所述蛋白酶为复合蛋白酶时，所述复合蛋白酶的添加量为所述虾头粉碎液质量的0.5％-1.5％，优选为1.4％。
所述酶解的条件如下：酶解温度为50-60℃、酶解时间为2-4h、酶解pH为7.0-7.5，优选为酶解温度为60℃、酶解时间为3h、酶解pH为7.4。
当所述蛋白酶为风味蛋白酶时，所述风味蛋白酶的添加量为所述虾头粉碎液质量的0.5％-1.5％，优选为0.8％。
所述酶解的条件如下：酶解温度为40-60℃、酶解时间为3-5h、酶解pH为6.5-7.0，优选为酶解温度为50℃、酶解时间为4h、酶解pH为6.6。
当所述蛋白酶为水解蛋白酶时，所述水解蛋白酶的添加量为所述虾头粉碎液质量的0.5％-1.0％，优选为0.8％。
所述酶解的条件如下：酶解温度为40-60℃、酶解时间为3-5h、酶解pH为6.5-7.5，优选为酶解温度为60℃、酶解时间为4h、酶解pH为7.0。
当所述蛋白酶为中性蛋白酶时，所述中性蛋白酶的添加量为所述虾头粉碎液质量的0.5％-1.5％，优选为1.4％。
所述酶解的条件如下：酶解温度为40-60℃、酶解时间为2-6h、酶解pH为6.5-7.5，优选为酶解温度为60℃、酶解时间为3h、酶解pH为7.2。
上述制备方法中，步骤1)中，还包括对所述虾头酶解液进一步纯化的步骤：将所述虾头酶解液于95-105℃下灭酶5-15min；再离心取上清液，并对上清液进行过滤，得到纯化后的虾头酶解液。
上述制备方法中，步骤2)中，所述还原糖选自单糖和/或二塘，所述单糖具体可选自戊糖或己糖，所述戊糖具体选自核糖、***糖或木糖，所述己糖具体选自半乳糖、甘露糖或葡萄糖；所述二糖具体选自麦芽糖、乳糖或蔗糖。
所述还原糖进一步选自葡萄糖、木糖、蔗糖和核糖中的至少一种，优选为葡萄糖和/或木糖，最优选为质量比为1：(2-5)(如：1:4)的木糖和葡萄糖的混合糖。
所述氨基酸选自胱氨酸、半胱氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸中的至少一种，具体选自胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸中的至少一种，优选为质量比为1：(0.5-3)(如：1:1)的甘氨酸和精氨酸的混合氨基酸。
所述还原糖、所述氨基酸和步骤1)中所述虾头酶解液的质量比为(2-6)：(1-5)：100，具体可为(2-4)：(2-4)：100，优选为4：2：100。
所述美拉德反应的条件如下：反应温度为80-120℃、反应时间为20-60min、反应体系的pH为4-8，进一步为反应温度为100-120℃、反应时间为40-60min、反应体系的pH为6-8，优选为反应温度为100℃、反应时间为50min、反应体系的pH为8。
上述制备方法中，步骤2)中，所述虾风味液的最优制备条件如下：
所述还原糖为质量比为1:4的木糖和葡萄糖的混合糖
所述氨基酸为质量比为1:1的甘氨酸和精氨酸的混合氨基酸。
所述还原糖、所述氨基酸和步骤1)中所述虾头酶解液的质量比为4：2：100。
所述美拉德反应的反应温度为100℃，反应时间为50min，反应体系的pH为8。
本发明的再一个目的是提供上述制备方法所得到的虾风味液。
此外，本发明还提供了上述制备方法中所得到的虾头酶解液。
本发明上述制备方法所制备得到的虾风味液和/或虾头酶解液在制备食品风味添加剂中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明以虾头为原料，采用了酶解耦合美拉德反应的方法，制备方法简单、可行，其产品质量基本可达到同类产品的要求，得到了色泽良好、营养丰富、虾味浓郁的虾风味液。一方面能充分利用虾头等宝贵资源，变废为宝，产生经济价值；另一方面也可以解决虾头对环境的污染问题。为虾头的综合利用开辟了一条新路，如作为方便面、肉制品加工等领域的重要配料，市场前景非常广阔。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述各实施例中所用的材料和试剂如下：
南美白对虾虾头，兆丰水产食品有限公司；甲醛(37.0％～40.0％)：分析纯，广州化学试剂厂；氢氧化钠：分析纯，广州化学试剂厂；酶制剂：试验选用的酶制剂见下表1所示：
表1、试验选用酶制剂
葡萄糖，生化试剂级，国药集团化学试剂有限公司；蔗糖，生化试剂级，广东汕头市西陇化工厂；D-核糖，生化试剂级，上海源叶生物科技有限公司；D-(+)-木糖，生化试剂级，国药集团化学试剂有限公司；甘氨酸，生化试剂级，上海伯奥生物科技有限公司；L-精氨酸，生化试剂级，上海源叶生物科技有限公司；L-丙氨酸，生化试剂级，上海源叶生物科技有限公司；L-冬氨酸，生化试剂级，上海源叶生物科技有限公司；L-胱氨酸，生化试剂级，上海源叶生物科技有限公司；L-脯氨酸，生化试剂级，国药集团化学试剂有限公司；L-谷氨酸，生化试剂级，国药集团化学试剂有限公司；L-半胱氨酸，生化试剂级，阿拉丁工业公司。
下述各实施例中所用的仪器如下：SQ2121多功能食品加工机：上海帅佳电子科技有限公司；数显恒温水浴锅：HH-4，常州澳华仪器有限公司；pH计：PHS-3C型，上海精密科学仪器有限公司；电子天平：PL303，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；台式离心机：MGLD4-2A，北京中西远大科技有限公司；循环水式真空泵：SHZ-D9(III)，巩义市予华仪器有限责任公司；打浆机，型号SQ2121，上海帅佳电子科技有限公司；离心机，型号D-37520，ThermoElectron LED GmbH；
实施例1、制备虾风味液：
一、制备虾头酶解液：
样品蛋白质含量的测定采用微量凯氏定氮法，参照GB/T5009.5-2010；氨基酸态氮的测定采用ZBX66038—87甲醛电位滴定法；不同蛋白质水解液氨基酸组成的测定参照GB/T18246—2000。
1)酶解工艺流程：南美白对虾虾头→称重→打浆(固液质量比1:1)得到虾头粉碎液→调pH值→加酶→恒温水浴振荡酶解→钝化酶(沸水浴10min)→酶解液→离心→取上清液过滤→氨基酸态氮的测定；
具体的酶解工艺的优化如下：
加酶量对氨基态氮含量的影响：以选定的酶，加酶量分别为上述虾头粉碎液质量的0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％，进行酶解反应，测定氨基态氮的含量，确定最佳加酶量。
酶解pH值对氨基态氮含量的影响：酶解pH值分别为6.6、6.8、7.0、7.2、7.4，在已确定的条件下进行酶解反应，测定其氨基态氮含量，确定最佳酶解pH值。
酶解温度对氨基态氮含量的影响：温度分别为40、45、50、55、60℃，在已确定的条件下进行酶解反应，测定氨基态氮含量，确定最佳酶解温度。
酶解时间对氨基态氮含量的影响：在已确定的条件下，酶解时间分别为2、3、4、5、6h，进行酶解反应，测定氨基态氮含量，确定最佳酶解时间。
2)结果和讨论：
a)采用微量凯氏定氮法测得南美白对虾虾头的蛋白质含量达到14.47％。
b)不同酶处理南美白对虾虾头对氨基态氮含量的影响：
b-1)复合蛋白酶对氨基态氮含量的影响：
b-1-1)不同加酶量对氨基态氮含量的影响：每个南美白对虾虾头150g，酶解温度50℃，酶解时间4h，pH7.0，加入不同量的复合蛋白酶进行水解，所得到氨基态氮的含量见表2。
表2、不同量的复合蛋白酶与氨基态氮含量的关系
由表2可知：加酶量达到1.4％之前，各种加酶量下的酶解效果差不多，当加酶量为1.4％时，酶解效果明显高于其他加酶量时的酶解效果。所以在其它条件相同下，当酶用量在1.4％时，虾头水解所得到的氨基态氮含量最多。
b-1-2)不同酶解pH对氨基态氮含量的影响：每个南美白对虾虾头150g，酶用量1.4％，酶解温度50℃，酶解时间4h，采用不同酸碱度进行水解，所得到氨基态氮的含量见表3。
表3、不同酶解pH与氨基态氮含量的关系
由表3可知：氨基态氮含量随酶解pH的增加而逐步上升。所以在其它条件相同下，当酶解pH为7.4时，虾头水解所得到的氨基态氮含量最多。
b-1-3)不同酶解温度对氨基态氮含量的影响：每个试样虾头150g，酶用量1.4％，酶解时间4h，pH7.4，采用不同酶解温度进行水解，所得到氨基态氮的含量见表4。
表4、不同酶解温度与氨基态氮含量的关系
由表4可知：酶解温度达到60℃之前，各种酶解温度下酶解效果差不多，当酶解温度为60℃时，酶解效果明显高于其他酶解温度时的酶解效果。所以在其它条件相同下，当酶解温度在60℃时，虾头水解所得到的氨基态氮含量最多。
b-1-4)不同酶解时间对氨基态氮含量的影响：每个试样虾头150g，酶用量1.4％，酶解温度60℃，pH7.4，采用不同酶解时间进行水解，所得到氨基态氮的含量见表5。
表5、不同酶解时间与氨基态氮含量的关系
由表5可知：酶解时间少于3h时，氨基态氮含量随酶解时间的延长而逐步上升，而酶解时间多于3h时，氨基态氮含量明显下降。随酶解时间的延长而呈现先增加后降低的趋势。所以在其它条件相同下，当酶解时间在3h时，虾头水解所得到的氨基态氮含量最多。
综合表2、表3、表4和表5可以看出，利用复合蛋白酶水解虾头生产虾调味汁(即虾头酶解液)的最佳条件是酶用量1.4％，酶解pH7.4，酶解温度60℃，酶解时间3h。
b-2)风味蛋白酶对氨基态氮含量的影响：
b-2-1)不同加酶量对氨基态氮含量的影响：每个试样虾头150g，酶解温度50℃，酶解时间4h，pH7.0，加入不同量的风味蛋白酶进行水解，所得到氨基态氮的含量见表6。
表6、不同量的风味蛋白酶与氨基态氮含量的关系
由表6可知：加酶量小于0.8％时，氨基态氮含量随加酶量的增加而逐步上升，而加酶量大于0.8％时，氨基态氮含量明显下降。随加酶量的增加而呈现先增加后降低的趋势。这可能是因为当酶浓度达到一定值，所有酶分子已被底物所饱和，即酶分子与底物结合部位已被占据，速度增加趋缓。所以在其它条件相同下，当酶用量在0.8％时，虾头水解所得到的氨基态氮含量最多。
b-2-2)不同酶解pH对氨基态氮含量的影响：每个试样虾头150g，酶用量0.8％，酶解温度50℃，酶解时间4h，采用不同酸碱度进行水解，所得到氨基态氮的含量见表7。
表7、不同酶解pH与氨基态氮含量的关系
由表7可知：酶解pH大于6.6之后，各种酶解pH下酶解效果差不多，酶解pH为6.6时的酶解效果明显高于其他酶解pH时的酶解效果。所以在其它条件相同下，当酶解pH为6.6时，虾头水解所得到的氨基态氮含量最多。
b-2-3)不同酶解温度对氨基态氮含量的影响：每个试样虾头150g，酶用量0.8％，酶解时间4h，pH6.6，采用不同酶解温度进行水解，所得到氨基态氮的含量见表8。
表8、不同酶解温度与氨基态氮含量的关系
由表8可知：酶解温度低于50℃时，氨基态氮含量随着温度的升高而逐步上升，而酶解温度高于50℃时，氨基态氮含量明显下降，酶解温度为55℃、60℃时，二者酶解效果差不多。所以在其它条件相同下，当酶解温度在50℃时，虾头水解所得到的氨基态氮含量最多。
b-2-4)不同酶解时间对氨基态氮含量的影响：每个试样虾头150g，酶用量0.8％，水解温度50℃，pH6.6，采用不同酶解时间进行水解，所得到氨基态氮的含量见表9。
表9、不同酶解时间与氨基态氮含量的关系
由表9可知：酶解时间少于4h时，氨基态氮含量随酶解时间的延长而逐步上升，而酶解时间多于4h时，氨基态氮含量明显下降。随酶解时间的延长而呈现先增加后降低的趋势。其原因是，随着酶水解反应的进行，底物浓度减小，被酶作用的肽链数量减少；产物浓度增加，其竞争性抑制变强；酶活性随反应的进行而降低。所以在其它条件相同下，当酶解时间在4h时，虾头水解所得到的氨基态氮含量最多。
综合表6、表7、表8、表9可以看出，利用风味蛋白酶水解虾头生产虾调味汁(即虾头酶解液)的最佳条件是酶用量0.8％，酶解pH6.6，酶解温度50℃，酶解时间4h。
b-3)水解蛋白酶对氨基态氮含量的影响：
b-3-1)不同加酶量对氨基态氮含量的影响：每个试样虾头150g，酶解温度50℃，酶解时间4h，pH7.0，加入不同量的复合蛋白酶进行水解，所得到氨基态氮的含量见表10。
表10、不同量的水解蛋白酶与氨基态氮含量的关系
由表10可知：加酶量小于0.8％时，氨基态氮含量随加酶量的增加而逐步上升，而加酶量大于0.8％时，氨基态氮含量明显下降。随加酶量的增加而呈现先增加后降低的趋势。这也可能是因为当酶浓度达到一定值，所有酶分子已被底物所饱和，即酶分子与底物结合部位已被占据，速度增加趋缓。所以在其它条件相同下，当酶用量在0.8％时，虾头水解所得到的氨基态氮含量最多。
b-3-2)不同酶解pH对氨基态氮含量的影响：每个试样虾头150g，酶用量0.8％，酶解温度50℃，酶解时间4h，采用不同酸碱度进行水解，所得到氨基态氮的含量见表11。
表11、不同酶解pH与氨基态氮含量的关系
由表11可知：酶解pH小于7.0时，氨基态氮含量随酶解pH的增加而逐步上升，而酶解pH大于7.0时，氨基态氮含量明显下降，即氨基态氮含量随酶解pH的增加而呈现先增加后降低的趋势。所以在其它条件相同下，当酶解pH为7.0时，虾头水解所得到的氨基态氮含量最多。
b-3-3)不同酶解温度对氨基态氮含量的影响：每个试样虾头150g，酶用量0.8％，酶解时间4h，pH7.0，采用不同酶解温度进行水解，所得到氨基态氮的含量见表12。
表12、不同酶解温度与氨基态氮含量的关系
由表12可知：酶解温度达到60℃之前，各种温度下酶解效果差不多，当酶解温度为60℃时的酶解效果明显高于其他酶解温度时的酶解效果。所以在其它条件相同下，当酶解温度在60℃时，虾头水解所得到的氨基态氮含量最多。
b-3-4)不同酶解时间对氨基态氮含量的影响：每个试样虾头150g，酶用量0.8％，酶解温度60℃，pH7.0，采用不同酶解时间进行水解，所得到氨基态氮的含量见表13。
表13、不同酶解时间与氨基态氮含量的关系
由表13可知：酶解时间少于4h时，氨基态氮含量随酶解时间的延长而逐步上升，而酶解时间多于4h时，氨基态氮含量明显下降，酶解时间为5h、6h时，二者酶解效果差不多。所以在其它条件相同下，当酶解时间在4h时，虾头水解所得到的氨基态氮含量最多。
综合表10、表11、表12、表13可以看出，利用水解蛋白酶水解虾头生产虾调味汁的最佳条件是酶用量0.8％，酶解pH7.0，酶解温度60℃，酶解时间4h。
b-4)中性蛋白酶对氨基态氮含量的影响：
b-4-1)不同加酶量对氨基态氮含量的影响：每个试样虾头150g，酶解温度50℃，酶解时间4h，pH7.0，加入不同量的中性蛋白酶进行水解，所得到氨基态氮的含量见表14。
表14、不同量的中性蛋白酶与氨基态氮含量的关系
由表14可知：氨基态氮含量随加酶量的增加而逐步上升。所以在其它条件相同下，当酶用量在1.4％时，虾头水解所得到的氨基态氮含量最多。
b-4-2)不同酶解pH对氨基态氮含量的影响：每个试样虾头150g，酶用量1.4％，酶解温度50℃，酶解时间4h，采用不同酸碱度进行水解，所得到氨基态氮的含量见表15。
表15、不同酶解pH与氨基态氮含量的关系
由表15可知：酶解pH从6.8增加到7.2时，氨基态氮含量随酶解pH的增加而逐步上升，而酶解pH为6.6、7.4时，二者酶解效果差不多，且都明显低于酶解pH为7.2时的酶解效果。所以在其它条件相同下，当酶解pH为7.2时，虾头水解所得到的氨基态氮含量最多。
b-4-3)不同酶解温度对氨基态氮含量的影响：每个试样虾头150g，酶用量1.4％，酶解时间4h，pH7.2，采用不同酶解温度进行水解，所得到氨基态氮的含量见表16。
表16、不同酶解温度与氨基态氮含量的关系
由表16可知：酶解温度达到60℃之前，各种酶解温度下酶解效果差不多，当酶解温度为60℃时的酶解效果明显高于其他酶解温度时的酶解效果。所以在其它条件相同下，当酶解温度在60℃时，虾头水解所得到的氨基态氮含量最多。
b-4-4)不同酶解时间对氨基态氮含量的影响：每个试样虾头150g，酶用量1.4％，水解温度60℃，pH7.2，采用不同酶解时间进行水解，所得到氨基态氮的含量见表17。
表17、不同酶解时间与氨基态氮含量的关系
由表17可知：酶解时间从3h增加到5h时，氨基态氮含量随酶解时间的延长而逐步下降，而酶解时间为2h、6h时，二者酶解效果差不多，且都明显低于酶解时间为3h时的酶解效果。所以在其它条件相同下，当酶解时间在3h时，虾头水解所得到的氨基态氮含量最多。
综合表14、表15、表16、表17可以看出，利用中性蛋白酶水解虾头生产虾调味汁的最佳条件是酶用量1.4％，酶解pH7.2，酶解温度60℃，酶解时间3h。
c)不同蛋白酶水解液氨基酸组成测定结果：将制备的虾头酶解液分别通过真空浓缩和真空冷冻干燥后制成粉末送检，检测机构参照GB/T18246-2000检测游离氨基酸含量。酶解液的游离氨基酸检测结果见表18，酶解液中含有大量的谷氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸和亮氨酸，是很好的滋味成分。酶解液在反应结束时，灭酶后酶解液已经有较好的风味，清香特征明显。其游离氨基酸含量丰富，虾的特征挥发性风味也较浓郁，可作为一种调味基料使用。如果单独从游离氨基酸的含量来衡量水解的优劣程度，那么蛋白酶水解的优劣程度为：水解蛋白酶＞中性蛋白酶＞风味蛋白酶＞复合蛋白酶，在此条件下，水解蛋白酶的游离氨基酸含量总和为71.391mg/100g，所以水解蛋白酶水解出的游离氨基酸的量最多，即水解蛋白酶的水解程度最优。
表18、虾头中游离氨基酸的类型及样品百分含量(单位：mg/100g)
综上可得出如下结论：
复合蛋白酶单独水解虾头的最佳工艺条件为：酶用量1.4％，酶解pH7.4，酶解温度60℃，酶解时间3h，在最佳条件下制备酶解液，氨基酸含量可达66.512g/100g。
风味蛋白酶单独水解虾头的最佳工艺条件为：酶用量0.8％，酶解pH6.6，酶解温度50℃，酶解时间4h。在最佳条件下制备酶解液，氨基酸含量可达67.438g/100g。
水解蛋白酶单独水解虾头的最佳工艺条件为：酶用量0.8％，酶解pH7.0，酶解温度60℃，酶解时间4h。在最佳条件下制备酶解液，氨基酸含量可达71.391g/100g。
中性蛋白酶单独水解虾头的最佳工艺条件为：酶用量1.4％，酶解pH7.2，酶解温度60℃，酶解时间3h。在最佳条件下制备酶解液，氨基酸含量可达70.438g/100g。
二、利用美拉德反应制备虾风味液：
1)采用步骤一中的条件制备得到虾头酶解液，具体步骤如下：将冷冻保藏的虾头拿出解冻，先用研钵捣碎，然后按质量比1:1的比例加入蒸馏水。将混合物搅拌均匀置于打浆机中打浆，直至混合物完全粉碎，得到虾头粉碎液。调节虾头粉碎液的pH至7，加入所述虾头粉碎液质量0.8％水解蛋白酶，混合均匀置于60℃水浴锅中酶解4h，4h后灭酶，离心取上清液，过滤后，即得所需虾头酶解液。
2)制备虾风味液：向反应试管中加入虾头酶解液、还原糖和氨基酸作为反应前体物质，调制合适的pH值后，放入一定温度下的高压锅或恒温水浴锅中反应一段时间，得到虾风味液。
2-1)还原糖的选择：根据美拉德反应的原理和特征，先以温度100℃、pH＝7、时间40min作为反应条件，分别添加4％的还原糖进行热反应。将获得的热反应产物进行分析，分析出最适还原糖。
复合还原糖比例的确定：保持基本条件不变，总还原糖量不变，控制风味最强两种糖的比例进行热反应。对热反应产物的虾味浓郁程度进行排序检验，然后使用Friedman检验和Page检验对被检样品之间是否有显著差异作出判断。确定产生虾风味最强的两种还原糖比例。
2-2)氨基酸的确定：以温度100℃、pH＝7、时间40min、最佳还原糖4％作为反应条件，分别添加各氨基酸3％进行热反应。将获得的热反应产物进行分析，分析出最适外加氨基酸。
复合氨基酸的确定：保持基本条件不变，总氨基酸量不变，控制风味最强两种氨基酸的比例进行热反应。对热反应产物的虾味浓郁程度进行排序检验，然后使用Friedman检验和Page检验对被检样品之间是否有显著差异作出判断。确定产生虾风味最强的两种氨基酸比例。
2-3)还原糖添加量单因素实验：以温度100℃、pH＝7、时间40min、氨基酸添加量3％作为反应条件，还原糖加入量分别为2％、3％、4％、5％、6％进行美拉德反应。
2-4)氨基酸添加量单因素实验：以温度100℃、pH＝7、时间40min、还原糖添加量4％作为反应条件，氨基酸加入量分别为1％、2％、3％、4％、5％进行美拉德反应。
2-5)反应pH单因素实验：以还原糖4％、氨基酸3％、时间为40min、温度为100℃为反应条件，pH分别为4、5、6、7、8美拉德进行反应。
2-6)反应时间单因素实验：以温度100℃、pH＝8、还原糖4％、氨基酸3％为反应条件，反应时间分别为20、30、40、50、60min。
2-7)反应温度单因素实验：以pH＝8、还原糖4％、氨基酸3％，时间为50min，温度分别为80℃、90℃、100℃、110℃、120℃为条件进行美拉德反应。
2-8)正交实验设计：为了获得最佳热反应条件，对时间、温度、pH三因素三水平正交试验，产物用评分检验法进行感官分析。
3)虾风味液的结果分析：结果分析为感官分析，感官分析为简单分析法(评价员对样品特征的某个指标或各个指标进行定性描述，尽量完整地描述出样品品质的方法)、排序检验法(比较数个样品，按照其某项品质程度的大小进行排序的方法，称为排序检验法)、评分检验法(评分法是指按照预先设定的评价基准，对试样的特性和嗜好程度以数字标度进行评定，然后换成得分的一种评价方法)。
相应的评分标准如下表19所示：
表19、感官评分标准
3)美拉德反应前体物质的确定：美拉德反应的前体物质为氨基酸和还原糖，虽然虾头酶解液中含有丰富的氨基酸，但不能产生饱满的虾风味，故需加入某些氨基酸和葡萄糖来使风味更适合大众人群。
3-1)还原糖的确定：不同的还原糖与虾头酶解液反应速度，以及产生的风味都各不相同。戊糖褐变速度是己碳糖的10倍，己碳糖的速度快于二糖。还原性单糖中戊糖褐变速度排序为：核糖>***糖>木糖，己碳糖排序为：半乳糖>甘露糖>葡萄糖，常见的二糖有麦芽糖、乳糖、蔗糖等。综合还原糖类型和反应速度，选择葡萄糖、木糖、蔗糖、核糖。以未添加还原糖的热产物为参考标准，对加入还原糖的热产物进行感官分析。
表20、不同还原糖反应的感官评价
从表20中可以看出，蔗糖并不适合在反应中添加。核糖的效果与葡萄糖或木糖相近，但核糖价格较贵，故选择木糖和葡萄糖作为添加物。
还原糖比例的确定：木糖的反应速度快于葡萄糖，且虾风味各异，它们之间不同的配比产生的风味也将不同。因此本实验将葡萄糖与木糖设定了5:0、4:1、3:2、2:3、1:4、0:5六个不同比例进行反应，分别标号为A、B、C、D、E、F，反应结果用评分法进行评定。评分结果的秩次与秩和见表21：
表21、葡萄糖与木糖不同比例的产物秩次与秩和
使用Kramer检定法来分析数据，查顺位检验法检验表的临界值分为上下段，把每个样品的秩和与上段的最大值Rimax和最小值Rimin相比较。若样品的秩和不小于Rimax或不大于Rimin，则说明样品间有显著差异。再通过下段检查样品间的差异程度若样品的Rn落在下段范围内，则可将其划为一组，表明其间无差异；若样品的Rn落在下段的范围之外，则落在上限之外和落在下限之外的样品就可分别组成一组。
查顺位检验法检验表，α＝5％和α＝1％，相应于J＝6和P＝6的临界值：
5％显著水平 1％显著水平
上段 11～31 9～33
下段 14～28 12～30
通过上述1％显著水平上段可知，最大Rimax＝33＝RB，所以六个样品在1％显著水平有显著差异。通过下段可知，RB＝33>Rimax＝30，RC＝30＝Rimax，RA＝10<Rimin＝12，RC、RD、RE、RF都在12～30的范围内，所以样品可划分为三个组：B CDEF A
结论：在1％的显著水平上，B样品最好，C、D、E、F样品次之，A样品最不好。故选择的还原糖比例为木糖比葡萄糖为1:4。
3-2)氨基酸的确定：不同的氨基酸与还原糖反应，能够产生各自不同的特征风味，对于何种氨基酸参与反应比较有利于产生虾香味，至今没有相关的报道，所以本实验选择了八种氨基酸参与反应，即胱氨酸、半胱氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。相应的感官评价如表22：
表22、不同氨基酸反应的感官评价
由表22可知，胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸的加入有助于虾味的增强，所以我们选择上述四种氨基酸两两复配与还原糖进行热反应。
复合氨基酸的确定：根据表22，我们选择胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸等四种氨基酸两两复配与还原糖进行反应，各种氨基酸的质量比例为1:1，反应结果应用排序检验法进行感官评定，用Kramer检定法分析，氨基酸互配表如表23所示：
表23、氨基酸互配表
表24、样品的秩次与秩和
查顺位检验法检验表α＝5％和α＝1％，相应于J＝6和P＝6的临界值：
5％显著水平 1％显著水平
上段 11～31 9～33
下段 14～28 12～30
通过上述可知，最大Rimax＝33＝RD，最小Rimin＝9>8.5，所以六个样品在1％显著水平有显著差异。通过下段可知，RD＝33>Rimax＝30，Rc＝8.9<12，RA、RB、RE、RF都在12～30的范围内，所以样品可划分为三个组：D ABEF C
结论：在1％的显著水平上，D样品最好，A、B、E、F样品次之，C样品最不好。故选择的复合氨基酸为甘氨酸和精氨酸，由于甘氨酸与精氨酸的1:1复合比例产生令人满意的虾风味，故选择复合比例为1:1。
3-3)反应基本参数的确定：还原糖、氨基酸、反应时间、反应温度及反应pH五个因素的确定。
3-3-1)还原糖添加量单因素实验：以温度100℃、pH＝7、时间40min、氨基酸3％作为反应条件，还原糖加入量分别为2％、3％、4％、5％、6％进行反应，并分别标号A、B、C、D、E。用感官评分法进行打分，相应结果如表24所示，然后使用Friedman检验被检样品之间是否有显著差异作出判断，采用多重比较和分组来确定最佳还原糖添加量。
表24、感官评定的秩次与秩和
通过Friedman检验对A、B、C、D、E对应的五个样品之间是否存在显著性差异进行分析。先用下面的公式求出统计量F。
式I中，J表示品评员数；P表示样品数；R1，R2，···，RP表示每种样品的秩和。
查Friedman秩和近似临界值表，若计算出的F大于或等于对应于P、J、α的临界值，则可以判定样品之间有显著差异；若小于相应临界值，则可以判定样品之间没有显著差异。
根据上面公式计算得F＝18.8，查临界值表得X(6，5，0.05)＝9.49，所以可以判定在5％的显著水平下，样品之间有显著差异。
判定了样品之间存在显著差异后，采用多重比较和分组来判别各样品间的显著差异。根据各样品的秩和RP，从小到大将样品初步排序，排序为：
计算临界值r(I，α)的公式如下：
根据公式，r(I，α)＝3.87q(I，α)，q(I，α)值可查表。根据计算得r(5，0.05)＝14.94；r(4，0.05)＝14.04；r(3，0.05)＝12.81；r(2，0.05)＝10.72；
RC-RE＝29-7.5＝21.5>r(5，0.05)
RC-RD＝29-12.5＝16.5>r(4，0.05)
RC-RB＝29-18.5＝10.5<r(3，0.05)
以上秩和相减顺序为，RC-RA，RA-RE，RA-RD，RA-RB，RB-RE，RB-RD，RD-RE；比较样品之间的秩和之差与r的大小，若秩和之差大于或等于相应的r，则表示这两样品之间有显著差异；若秩和之差小于相应的r，则表示这两样品之间无显著差异，在样品下划线。
综合上述的分析结果和差异程度可得出，C AB DE
有差异程度可知，4％的还原添加量风味最好，2％、3％添加量的次之，5％、6％添加量的最差。所以，综合考虑选择还原糖的添加量为4％的水平。
3-3-2)氨基酸添加量单因素实验：以温度100℃、pH＝7、时间40min、还原糖4％作为反应条件，氨基酸加入量分别为1％、2％、3％、4％、5％进行反应，并分别标号A、B、C、D、E。用感官评分法进行打分，然后使用Friedman检验被检样品之间是否有显著差异作出判断，采用多重比较和分组来确定最佳氨基酸添加量。五个样品感官的秩次与秩和见表25。
表25、感官评定的秩次与秩和
根据表25分析可得，F＝16.26>X(6，5，0.05)＝9.49，所以可以判定在5％的显著水平下，样品之间有显著差异。经过多重比较和分组的进一步分析得：CD ABE
有差异程度可知，3％和4％的氨基酸添加量风味最好，1％、2％、5％添加量的次之。考虑到经济成本和原始虾风味的保存，故选择氨基酸的添加量为3％的水平。
3-3-3)反应pH单因素试验：还原糖4％、氨基酸3％、时间为40min、温度为100℃，pH分别为4、5、6、7、8进行反应，并分别标号A、B、C、D、E。用感官评分法进行打分，然后使用Friedman检验被检样品之间是否有显著差异作出判断，采用多重比较和分组来确定最佳反应pH。五个样品感官的秩次与秩和见下表26。
表26、感官评定的秩次与秩和
根据表26分析可得，F＝14.2>X(6，5，0.05)＝9.49，所以可以判定在5％的显著水平下，样品之间有显著差异。经过多重比较和分组的进一步分析得：CDE AB
有差异程度可知，C、D、E的反应pH风味最好，A、B反应pH的次之。所以，综合考虑选择反应pH为8的水平。
3-3-4)反应时间单因素试验：以温度100℃、pH＝8、还原糖4％、氨基酸3％为反应条件，反应时间分别为20、30、40、50、60min。样品分别标号A、B、C、D、E，用感官评分法进行打分，然后使用Friedman检验被检样品之间是否有显著差异作出判断，采用多重比较和分组来确定最佳反应时间。五个样品感官的秩次与秩和见下表27。
表27、感官评定的秩次与秩和
根据表27分析可得，F＝16.4>X(6，5，0.05)＝9.49，所以可以判定在5％的显著水平下，样品之间有显著差异。经过多重比较和分组的进一步分析得：DE ABD
有差异程度可知，D和E的反应时间风味最好，A、B、D反应时间的次之。所以，综合考虑选择反应时间为50min的水平。
3-3-5)反应温度单因素试验：以pH＝8、还原糖4％、氨基酸3％，时间为50min，温度分别为80、90、100、110、120为条件进行反应，并分别标号A、B、C、D、E。用感官评分法进行打分，然后使用Friedman检验被检样品之间是否有显著差异作出判断，采用多重比较和分组来确定最佳反应温度。五个样品感官的秩次与秩和见下表28。
表28、感官评定的秩次与秩和
根据表28分析可得，F＝17.2>X(6，5，0.05)＝9.49，所以可以判定在5％的显著水平下，样品之间有显著差异。经过多重比较和分组的进一步分析得：CB DEA
有差异程度可知，C和B的反应温度风味最好，A、D、E反应温度的次之。所以，综合考虑选择反应温度为100℃的水平。
3-3-6)反应基本参数的优化：根据上面的单因素试验，从还原糖、氨基酸添加量和反应时间三个因素中选择三个较佳水平，根据L9(33)进行正交试验，试验因数和结果见表29、表30、表31：
表29、正交试验因素水平表
表30、正交实验安排及结果
Ti表示各因素同一水平水平之和，Ki表示各因素同一水平水平之和的平均值。
表31、正交试验方差分析表
F检验结果表明，三个因素对反应效果的影响都不显著。究其原因可能是本例试验误差大且误差自由度小(仅为2)，使检验的灵敏度低，从而掩盖了考察因素的显著性。
由于各因素对增重影响都不显著，不必再进行各因素水平间的多重比较。此时，可从表中选择平均数大的水平A2、B1、C2组合成最优水平组合A2B1C2，即还原糖添加量4％、氨基酸加量2％、反应时间50min为最佳组合。
综上可得知：前体物质确定最佳添加还原糖为葡萄糖和木糖，质量比例为4:1；最佳添加氨基酸为甘氨酸和精氨酸，质量比例为1:1。单因素试验得出最佳反应条件为：还原糖4％、氨基酸3％、pH＝8、反应时间50min、温度100℃。三因素三水平优化试验得出最佳还原糖为4％、氨基酸2％、时间50min。故实验最后得出，最佳虾风味液制备条件为：还原糖(葡萄糖：木糖＝4:1)4％、氨基酸(甘氨酸：精氨酸＝1：1)2％、pH＝8、温度100℃、时间50min。
Claims (6)
1.一种虾风味液的制备方法，包括如下步骤：
1)制备虾头酶解液：将虾头和水混合粉碎，得到虾头粉碎液；再将所述虾头粉碎液和蛋白酶混合进行酶解，得到虾头酶解液；
所述虾头粉碎液和蛋白酶混合前，调节所述虾头粉碎液的pH值；
所述蛋白酶为复合蛋白酶时，所述复合蛋白酶的添加量为所述虾头粉碎液质量的1.0％-1.5％；
所述酶解的条件如下：酶解温度为50-60℃、酶解时间为3h、酶解pH为7.0-7.5；
所述蛋白酶为风味蛋白酶时，所述风味蛋白酶的添加量为所述虾头粉碎液质量的0.5％-1.0％；
所述酶解的条件如下：酶解温度为45-55℃、酶解时间为4h、酶解pH为6.5-7.0；
步骤1)中，所述虾头为南美白对虾虾头；
步骤1)中，还包括对所述虾头酶解液进一步纯化的步骤：将所述虾头酶解液于95-105℃下灭酶5-15min；再离心取上清液，并对上清液进行过滤，得到纯化后的虾头酶解液；
2)制备虾风味液：将还原糖、氨基酸和步骤1)中所述虾头酶解液混合进行美拉德反应，得到虾风味液；
所述还原糖、所述氨基酸和步骤1)中所述虾头酶解液的质量比为(2-6)：(1-5)：100；
所述还原糖为质量比为1：(2-5)的木糖和葡萄糖的混合糖；
所述氨基酸为质量比为1：(0.5-3)的甘氨酸和精氨酸的混合氨基酸。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述虾头和水的质量比为1：(1-2)；
所述粉碎的粒径为120-180μm。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述还原糖、所述氨基酸和步骤1)中所述虾头酶解液的质量比为(2-4)：(2-4)：100。
4.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述美拉德反应的条件如下：反应温度为80-120℃、反应时间为20-60min、反应体系的pH为4-8。
5.权利要求1-4中任一项所述的制备方法得到的虾风味液或虾头酶解液。
6.权利要求5所述的虾风味液和/或虾头酶解液在制备食品风味添加剂中的应用。
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