CN105188743A - 治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了针对脑膜炎奈瑟氏球菌感染免疫的方法，其包括以下步骤：a)用包含分别缀合至载体蛋白以形成至少一种、两种或三种细菌糖缀合物的至少一种、两种或三种细菌糖的细菌糖缀合物疫苗免疫0至1个月的第一年龄的人患者；和b)用包含分别缀合至载体蛋白的至少两种荚膜糖的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗免疫12至24个月的第二年龄的人患者，所述荚膜糖选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖(MenW135)和脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)，其中所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗与包含白喉类毒素和破伤风类毒素的疫苗共同施用。

Description

治疗方法
技术领域
本发明涉及使用针对脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的缀合物疫苗用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌感染的领域。具体而言，本发明涉及在已经用至少一种缀合物疫苗预免疫的群体中共同施用脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗与含有DTP的疫苗。本发明的进一步方面涉及使用进一步免疫。
背景
侵袭性脑膜炎奈瑟氏球菌感染引起严重疾病，死亡率为约10％，甚至当施用适当的抗生素和支持疗法时[1]。在美国，大多数侵袭性脑膜炎球菌病(IMD)由血清群B、C和Y引起[2]，而更少检测到作为在全球许多地区疾病爆发的重要原因[3,4]的血清群A、W-135和X。小于1岁的婴儿在美国具有最高的IMD发病率(约1:18,500群体；1998-2007)[2]。因此，为了抗击美国婴儿和儿童中的脑膜炎球菌疾病，脑膜炎球菌缀合物疫苗需要从早期年龄是有效的[5]。
脑膜炎球菌血清群C和Y疫苗，与Hib (HibMenCY-TT, MenHibrix™, GlaxoSmithKline Vaccines)组合，在婴儿和幼儿中进行的临床试验中证明免疫原性和安全性[7-14]之后，最近在美国批准用于婴儿中作为开始于2月龄的4剂量系列[6]。一种四价血清群A、C、W-135和Y (MenACWY)脑膜炎球菌缀合物疫苗在美国批准用于9-12个月龄的儿童(Menactra™, sanofi pasteur)：免疫实践咨询委员会(Advisory Committee on Immunization Practices, ACIP)推荐两个剂量的缀合物疫苗用于处于由于补体缺陷导致的IMD或由于在流行地区旅行/居住导致的暴露的增加风险中的儿童[15]。另一种MenACWY缀合物疫苗被批准用于从2岁开始使用(Menveo™, Novartis)。
GlaxoSmithKline Vaccines的具有缀合至破伤风类毒素(TT)的所有血清群的MenACWY疫苗(MenACWY-TT:Nimenrix™)在欧洲被批准作为单一剂量，但在美国仍在研究。临床试验已经表明，一个剂量的MenACWY-TT对于所有四种血清型是免疫原性的，并且在从12个月龄的幼儿、儿童、青少年和成人中是良好耐受的[16-23]。
儿科免疫时间表是拥挤的，仍然需要评估脑膜炎球菌缀合物疫苗当引入用其他儿科疫苗的免疫时间表时的安全性和免疫原性。确立与其他疫苗共同施用是否导致干扰问题或增强的免疫原性是有价值的。
本研究评估脑膜炎球菌缀合物疫苗当在生命的第二年作为进一步剂量施用时的免疫原性和安全性。具体而言，其报道了在生命的第二年期间与白喉-破伤风-无细胞(DTPa)疫苗的剂量共同施用的效果。
该研究已经意料之外地显示在生命的第二年共同施用多价脑膜炎球菌缀合物疫苗与含有DTPa的疫苗导致与当在不同时间点施用疫苗时相比针对脑膜炎球菌缀合物的增强的免疫应答。其中共同施用脑膜炎球菌缀合物和DTPa的一种更简单的免疫时间表导致较少就医和改善免疫原性的双重益处。
因此根据本发明的一个方面，提供了针对脑膜炎奈瑟氏球菌感染免疫的方法，其包括以下步骤：a)用缀合至第一载体蛋白以形成细菌糖缀合物的至少一种细菌糖免疫0至11个月的第一年龄的人患者；和b)用包含分别缀合至第二载体蛋白的至少两种荚膜糖的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗免疫12至24个月的第二年龄的人患者，所述荚膜糖选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖(MenW135)和脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)，其中所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗与包含白喉类毒素和破伤风类毒素的疫苗共同施用。
根据本发明的进一步方面，提供了多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗在预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的医学用途，其中人患者在时间表中免疫，所述时间表包括步骤a)和b)，其中步骤a)用缀合至第一载体蛋白以形成细菌糖缀合物的至少一种细菌糖免疫0至11个月的第一年龄的人患者；且步骤b)用包含分别缀合至第二载体蛋白的至少两种荚膜糖的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗免疫12至24个月的第二年龄的人患者，所述荚膜糖选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖(MenW135)和脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)，其中所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗与包含白喉类毒素和破伤风类毒素的疫苗共同施用。
附图说明
图1：研究从始至终的主体流程(Subject flow through the study)
对于第四剂量阶段期间为什么主体退出研究或从根据方案免疫原性组群排除的原因的细节，参见补充表3
* 主体不参加第四剂量阶段，因为他们不愿意参加(n=83)；错过随访(n=47)；或者没有资格参加(n=78)。
图2：在12-15个月龄用MenACWY-TT或HibMenCY-TT，在15-18个月龄用MenACWY-TT + DTaP或在15-18个月龄用DTaP(对照组)免疫之后一个月hSBA滴度≥1:8的主体的百分数(ATP免疫原性组群，第四剂量阶段)。
ATP = 根据方案；hSBA =使用人补体源的血清杀菌活性
图3：在12-15个月龄用MenACWY-TT或HibMenCY-TT，或在15-18个月龄用MenACWY-TT + DTaP或在15-18个月龄用DTaP(对照组)免疫之后一个月的hSBA GMT(ATP免疫原性组群，第四剂量阶段)。
ATP = 根据方案；hSBA =使用人补体源的血清杀菌活性；GMT =几何平均滴度
* 代表共同施用组和其他组之间观察到的差异。
图4：在12-15个月龄用MenACWY-TT或HibMenCY-TT，或在15-18个月龄用DTaP和MenACWY-TT(Coad组)免疫之后8天内的局部和一般寻求(solicited)症状(总共接种组群，第四剂量阶段)。
对于所有组，局部症状是指在MenACWY-TT或HibMenCY-TT注射部位具有至少一种局部症状的主体的百分数。任何发热(任何途径)≥38.0℃；3级：发红和肿胀>30mm；疼痛 - 当触动肢体/肢体自发疼痛时哭泣；发热(任何途径)>40℃；易怒/烦躁(Fussiness)和困倦 - 防止正常活动；失去食欲 – 完全无法进食。
详述
本发明公开了针对脑膜炎奈瑟氏球菌感染免疫的方法，其包括以下步骤：a)用缀合至第一载体蛋白以形成细菌荚膜糖缀合物的至少一种细菌荚膜糖免疫0至11个月的第一年龄的人患者；和b)用包含分别缀合至第二载体蛋白的至少两种荚膜糖的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗免疫12至24个月的第二年龄的人患者，所述荚膜糖选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖(MenW135)和脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)，其中所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗与包含白喉类毒素和破伤风类毒素的疫苗共同施用。
步骤a)是在生命的第一年的免疫，通常在0-8、1-7或2-6个月龄的人婴儿中发生。在一个实施方案中，步骤a)免疫包含流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)(Hib)糖缀合物和/或脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C(MenC)荚膜糖缀合物和/或脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y(MenY)荚膜糖缀合物。
在一个实施方案中，步骤a)中施用的所述或每种缀合物含有选自破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM197的载体蛋白。在一个优选实施方案中，其中步骤a)中施用多种缀合物，相同类型的载体蛋白独立地缀合至每种糖。在一个优选实施方案中，第一载体蛋白是破伤风类毒素。
在一个实施方案中，步骤a)的免疫涉及施用2或3个剂量的细菌糖缀合物，例如通过免疫2、4和6个月龄的人婴儿。
在一个实施方案中，在步骤a)期间，细菌荚膜糖缀合物，例如Hib、MenC和/或MenY，与包含白喉、破伤风和百日咳抗原(DTP)的疫苗同时施用。白喉抗原通常是白喉类毒素，破伤风抗原通常是破伤风类毒素，且百日咳抗原可以是全细胞百日咳或无细胞百日咳，任选包含一种或多种百日咳类毒素、FHA或百日咳杆菌粘附素。在一个实施方案中，DTP疫苗进一步包含乙型肝炎表面抗原和/或IPV。在一个实施方案中，步骤a)的免疫施用含有2.5μg缀合至破伤风类毒素的Hib PRP和5μg缀合至破伤风类毒素的MenC和Y荚膜糖中的每种的HibMenCY-TT疫苗，其中总TT含量为5-40、10-30、15-20 μg或约18μg。
步骤b)涉及免疫生命的第二年(即，12至24，优选13至20，12至18，14至18或15-18个月龄)的相同人患者。步骤b)免疫涉及共同免疫i)多价脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物疫苗与ii)包含白喉类毒素和破伤风类毒素的疫苗。多价脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物疫苗包含MenA、MenC、MenW135和MenY中的至少两种；例如，血清群C和Y荚膜多糖(MenCY)、血清群C和A荚膜多糖(MenAC)、血清群C和W135荚膜多糖(MenCW)、血清群A和Y荚膜多糖(MenAY)、血清群A和W135荚膜多糖(MenAW)、血清群W135和Y荚膜多糖(Men WY)、血清群A、C和W135荚膜多糖(MenACW)、血清群A、C和Y荚膜多糖(MenACY)；血清群A、W135和Y荚膜多糖(MenAWY)、血清群C、W135和Y荚膜多糖(MenCWY)；或血清群A、C、W135和Y荚膜多糖(MenACWY)的缀合物。
在一个实施方案中，多价脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物疫苗使用选自破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM 197的载体蛋白(第二载体蛋白)。在一个实施方案中，第二载体是破伤风类毒素。在一个优选实施方案中，第一载体蛋白和第二载体蛋白是相同的，优选为破伤风类毒素。
在一个实施方案中，共同施用的含有白喉类毒素和破伤风类毒素的疫苗是额外含有作为全细胞百日咳或无细胞百日咳的百日咳组分，例如含有百日咳类毒素、FHA和百日咳杆菌粘附素的DTP疫苗。在一个实施方案中，含有白喉类毒素和破伤风类毒素的疫苗包含其他抗原，例如HBV和/或IPV。
在一个实施方案中，共同施用多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗与含有白喉类毒素和破伤风类毒素的疫苗导致至少一种脑膜炎球菌组分(例如，MenC、MenY、MenW135、MenC 和MenY、MenC 和MenW135 或MenC、MenW135 和MenY)的免疫原性增加。在一个实施方案中，增加的免疫原性通过SBA测定(任选使用人补体来源)来测量，所述SBA测定任选在生命的第二年用多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗免疫后一个月采集的血清上进行。在一个实施方案中，与施用单独的多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗之后的GMT相比，用包含白喉类毒素和破伤风类毒素的疫苗共同施用之后的GMT增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或100%。
在一个实施方案中，步骤b)的载体蛋白以10-100、20-90、20-80、30-70、35-60 或40-50μg的总剂量存在于脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物剂量中。例如，对于以TT、DT或CRM197作为载体蛋白的四价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，考虑20-80 μg的总载体蛋白剂量。对于二价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，考虑20-40μg的TT、DT或CRM197的总载体蛋白剂量。
上述关于免疫方法记载的细节同样适用于多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗在预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的用途。
在一个实施方案中，至少一种、两种、三种、四种或每种脑膜炎奈瑟氏球菌多糖的平均大小(或分子量)为50KDa - 1500kDa、50kDa - 500kDa、50 kDa - 300 KDa、101kDa - 1500kDa、101kDa - 500kDa或101kDa - 300kDa，如通过MALLS所测定。
在一个实施方案中，MenA多糖，当存在时，具有50-500kDa、50-100kDa、100-500kDa、55-90KDa、60-70kDa或70-80kDa或60-80kDa的分子量，如通过MALLS所测定。
在一个实施方案中，MenC多糖，当存在时，具有100-200kDa、50-100kDa、100-150kDa、101-130kDa、150-210kDa或180-210kDa的分子量，如通过MALLS所测定。
在一个实施方案中，MenY多糖，当存在时，具有60-190kDa、70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa或110-140kDa、50-100kDa、100-140kDa、140-170kDa或150-160kDa的分子量，如通过MALLS所测定。
在一个实施方案中，MenW多糖，当存在时，具有60-190kDa、70-180kDa、80-170kDa、90-160kDa、100-150kDa、110-140kDa、50-100kDa或120-140kDa的分子量，如通过MALLS所测定。
本文的多糖的分子量或平均分子量是指在缀合前测量的多糖的重均分子量(Mw)，且通过MALLS所测量。
MALLS技术是本领域众所周知的，且通常如实施例2中所述实施。对于脑膜炎球菌糖的MALLS分析，可以组合使用两个柱(TSKG6000和5000PWxl TOSOH Bioscience)，且将糖洗脱在水中。糖使用光散射检测器(例如装备488nm的10mW氩激光器的Wyatt Dawn DSP)和干涉测量折光计(例如装备P100单元(cell)和498nm红色滤光片的Wyatt Otilab DSP)检测。
在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌多糖是天然多糖，或者是在正常提取过程中大小减小的天然多糖。
在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌多糖通过机械切割(例如通过微流化或超声处理)调整大小。微流化和超声处理具有将较大天然多糖的大小足够减小足以提供可过滤缀合物的优势。大小调整的倍数不多于×20、×10、×8、×6、×5、×4、×3、×2 或×1.5。
在一个实施方案中，免疫原性组合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物，所述缀合物由天然多糖和大小调整不多于×20倍的多糖的混合物制成。例如，来自MenC和/或MenA的多糖是天然的。例如，来自MenY和/或MenW的多糖大小调整不多于×20、×10、×8、×6、×5、×4、×3、×2或×1.5倍。例如，免疫原性组合物含有由MenY和/或MenW和/或MenC和/或MenA 制成的缀合物，所述MenY 和/或MenW 和/或MenC和/或MenA 大小调整不多于×20、×10、×8、×6、×5、×4、×3、×2或×1.5倍和/或进行微流化。例如，免疫原性组合物含有由天然的MenA和/或MenC和/或MenW和/或MenY 制成的缀合物。例如，免疫原性组合物包含由天然MenC制成的缀合物。例如，免疫原性组合物包含由天然MenC和MenA制成的缀合物，所述MenC和MenA大小调整不多于×20、×10、×8、×6、×5、×4、×3、×2或×1.5倍和/或进行微流化。例如，免疫原性组合物包含由天然MenC和MenY制成的缀合物，所述天然MenC和MenY大小调整不多于×20、×10、×8、×6、×5、×4、×3、×2或×1.5倍和/或进行微流化。
在一个实施方案中，多糖的多分散性是1-1.5、1-1.3、1-1.2、1-1.1或1-1.05，在缀合至载体蛋白之后，缀合物的多分散性是1.0-2.5、1.0-2.0、1.0-1.5、1.0-1.2、1.5-2.5、1.7-2.2或1.5-2.0。所有多分散性测量都通过MALLS进行。
多糖任选地调整大小直至从细菌分离的多糖的大小的1.5、2、4、6、8、10、12、14、16、18或20倍。
在一个实施方案中，多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗进一步包含来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的抗原。所述抗原任选地是来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B(MenB)的荚膜多糖或调整大小的多糖或由其衍生的寡糖。所述抗原任选地是如EP301992、WO 01/09350、WO 04/14417、WO 04/14418 和WO 04/14419中所述的来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的外膜囊泡制备物。
在一个实施方案中，多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗进一步包含缀合至载体蛋白的流感嗜血杆菌b (Hib)荚膜糖。
包括于本发明的药物组合物中的脑膜炎奈瑟氏球菌多糖(和任选地Hib荚膜糖)缀合至载体蛋白，诸如破伤风类毒素、破伤风类毒素片段C、破伤风毒素的无毒突变体、白喉类毒素、CRM197、白喉毒素的其他无毒突变体[诸如CRM176、CRM 197、CRM228、CRM 45(Uchida等人 J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973)；CRM 9、CRM 45、CRM102、CRM 103和CRM107 以及Nicholls和Youle在Genetically Engineered Toxins, Ed：Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992中描述的其他突变；Glu-148的缺失或突变至Asp、Gln或Ser和/或Ala 158突变至Gly以及US 4709017或US 4950740中公开的其他突变；至少一种或多种残基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突变以及US 5917017或US 6455673中公开的其他突变；或US 5843711中公开的片段]。
在一个实施方案中，本发明的多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗在脑膜炎奈瑟氏球菌多糖中的至少两种、三种、四种或每种中使用相同的载体蛋白(独立地)。在Hib存在的一个实施方案中，如脑膜炎奈瑟氏球菌多糖中的至少一种、两种、三种、四种或每种Hib可以缀合至相同的载体蛋白。例如，脑膜炎奈瑟氏球菌多糖中的1、2、3或4种独立地缀合至破伤风类毒素以制备1、2、3或4种缀合物。
在一个实施方案中，单一载体蛋白可以携带多于一种糖抗原(WO 04/083251)。例如，单一载体蛋白可以缀合至MenA和MenC；MenA和MenW；MenA和MenY；MenC和MenW；MenC和MenY；Men W和MenY；MenA、MenC和MenW；MenA、MenC和MenY；MenA、MenW和MenY；MenC、MenW和MenY；MenA、MenC、MenW和MenY；Hib和MenA；Hib和MenC；Hib和MenW；或Hib和MenY。
多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗任选地包含至少一种脑膜炎球菌糖(例如MenA；MenC；MenW；MenY；MenA和MenC；MenA和MenW；MenA和MenY；MenC和Men W；Men C和MenY；Men W和MenY；MenA、MenC和MenW；MenA、MenC和MenY；MenA、MenW和MwnY；MenC、MenW和MenY或MenA、MenC、MenW和MenY) 缀合物，具有Men糖与载体蛋白(特别是破伤风类毒素)的比率为1:5至5:1，1:2至5:1，1:0.5至1:2.5或 1:1.25至1:2.5(w/w)。
缀合物中糖与载体蛋白的比率(w/w)可以使用灭菌的缀合物来确定。蛋白的量使用Lowry测定(例如Lowry等人(1951) J. Biol. Chem. 193, 265-275或Peterson等人Analytical Biochemistry 100, 201-220 (1979))测定，糖的量使用ICP-OES(电感耦合等离子体-光发射光谱学)(对于MenA)、使用DMAP测定(对于MenC)和间苯二酚测定(对于MenW和MenY)进行测定(Monsigny等人(1988) Anal. Biochem. 175, 525-530)。
在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖和/或Hib糖经由接头，例如双官能接头，缀合至载体蛋白。接头任选地是异双官能的或同双官能的，具有例如反应性氨基基团和反应性羧酸基团、2个反应性氨基基团或者两个反应性羧酸基团。接头具有例如4至20，4至12，5至10个碳原子。可能的接头是ADH。其他接头包括B-丙酰胺基(WO 00/10599)、硝基苯基-乙胺(Gever等人(1979) Med. Microbiol. Immunol. 165; 171-288)、卤代烷基卤化物(US4057685)、糖苷键(US4673574、US4808700)、己二胺和6-氨基己酸(US4459286)。
用于本发明中的多糖缀合物可以通过任何已知的偶联技术制备。缀合方法可以依赖于用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化糖以形成氰酸酯。活化的糖可以因此直接地或经由间隔基(接头)基团偶联至载体蛋白上的氨基。例如，间隔基可以是胱胺或半胱胺以提供硫醇化多糖，所述硫醇化多糖可以经由硫醚键偶联至载体，所述硫醚键在与马来酰亚胺-活化的载体蛋白(例如使用GMBS)或卤代乙酰化载体蛋白(例如使用碘代乙酰亚胺或溴乙酸N-琥珀酰亚胺酯(N-succinimidyl bromoacetatebromoacetate))反应后获得。任选地，氰酸酯(任选地通过CDPA化学法制得)与己二胺或ADH偶联，并且氨基-衍生化的糖使用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学法缀合至载体蛋白。此类缀合物描述于PCT公开申请WO 93/15760 Uniformed Services University和WO 96/08348和WO 96/29094中。
其他合适的技术使用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对-硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。许多描述于WO 98/42721中。缀合可以涉及羰基接头，其可以通过使糖的游离羟基基团与CDI反应(Bethell等人 J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572-4, Hearn等人 J. Chromatogr. 1981. 218; 509-18)、随后与蛋白反应以形成氨基甲酸酯连接而形成。其可以涉及将异头末端还原为伯羟基，任选地进行伯羟基与CDI的伯羟基反应的保护/脱保护以形成CDI氨基甲酸酯中间体以及使CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白上的氨基偶联。
缀合物也可以如US 4365170(Jennings)和US 4673574(Anderson)中所述通过直接还原氨化方法来制备。其他方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中。
进一步方法涉及将溴化氰(或CDAP)活化的糖通过碳二亚胺缩合 (Chu C.等人 Infect. Immunity, 1983 245 256)，例如使用EDAC，偶联至蛋白载体，所述糖用己二酸酰肼(ADH)衍生化。
在一个实施方案中，糖上的羟基(任选地为活化的羟基，例如通过氰酸酯活化的羟基)直接或间接(通过接头)连接至蛋白上的氨基或羧基。当存在接头时，糖上的羟基任选地连接至接头上的氨基，例如通过使用CDAP缀合。接头(例如ADH)中的其他氨基基团可以缀合至蛋白上的羧酸基团，例如通过使用碳二亚胺化学法，例如通过使用EDAC。在一个实施方案中，在接头缀合至载体蛋白之前，首先将Hib或脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合至接头。
在一个实施方案中，Hib糖，当存在时，使用CNBr、或CDAP、或CDAP和碳二亚胺化学法(诸如EDAC)的组合、或CNBr和碳二亚胺化学法(诸如EDAC)的组合而缀合至载体蛋白。任选地，Hib使用CNBr和碳二亚胺化学法(任选地EDAC)缀合。例如，CNBr用于接合糖和接头，然后碳二亚胺化学法用于接合接头和蛋白载体。
在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖中的至少一种直接缀合至载体蛋白的；任选地MenW和/或 MenY和/或MenC糖直接缀合至载体蛋白。例如，MenW；MenY；MenC；MenW和MenY；MenW和MenC；MenY和MenC；或MenW、MenY和MenC直接连接至载体蛋白。任选地，脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖中的至少一种通过CDAP直接缀合。例如，MenW；MenY；MenC；MenW和MenY；MenW 和MenC；MenY和MenC；或MenW、MenY和MenC通过CDAP直接连接至载体蛋白(参见WO 95/08348和WO 96/29094)。在一个实施方案中，所有脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖均缀合至破伤风类毒素。
任选地，MenW和/或Y糖与载体蛋白的比率是1:1.05至1:2(w/w)，和/或MenC糖与载体蛋白的比率是1:0.5至1:4或1:1.25-1:1.5或1:0.5至1:1.5(w/w)，尤其是当这些糖任选地使用CDAP直接连接至蛋白时。
在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖中的至少一种经由接头，例如双官能接头，缀合至载体蛋白。所述接头任选地是异双官能的或同双官能的，具有例如反应性氨基基团和反应性羧酸基团、2个反应性氨基基团或2个反应性羧酸基团。接头具有例如4至20，4至12，5至10个碳原子。可能的接头是ADH。
在一个实施方案中，MenA；MenC；或MenA和MenC经由接头缀合至载体蛋白(例如破伤风类毒素)。
在一个实施方案中，至少一种脑膜炎奈瑟氏球菌多糖经由接头使用CDAP和EDAC缀合至载体蛋白。例如，如上所述，MenA；MenC；或MenA和MenC经由接头(例如在其末端具有两个肼基(hydrozino groups)的接头诸如ADH)使用CDAP和EDAC缀合至蛋白。例如，CDAP用于将糖缀合至接头，EDAC用于将接头缀合至蛋白。任选地，对于MenA；MenC；或MenA 和MenC，经由接头的缀合导致多糖与载体蛋白的比率为1:0.5至1:6；1:1至1:5或1:2至1:4。
在一个实施方案中，MenA荚膜多糖，当存在时，是至少部分O-乙酰化的，使得至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的重复单元在至少一个位置是O-乙酰化的。O-乙酰化例如存在于至少50%、60%、70%、80%、90%、95% 或98%的重复单元的至少O-3位置。
在一个实施方案中，MenC荚膜多糖，当存在时，是至少部分O-乙酰化的，使得至少 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或98% 的(α2→9)-连接的NeuNAc重复单元在至少一个或两个位置是O-乙酰化的。O-乙酰化例如存在于至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或98%的重复单元的O-7和/或O-8位置。
在一个实施方案中，MenW荚膜多糖，当存在时，是至少部分O-乙酰化的，使得至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或98% 的重复单元在至少一个或两个位置是O-乙酰化的。O-乙酰化例如存在于至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或98%的重复单元的O-7和/或O-9位置。
在一个实施方案中，MenY荚膜多糖，当存在时，是至少部分O-乙酰化的，使得至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或98% 的重复单元在至少一个或两个位置是O-乙酰化的。O-乙酰化存在于至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或98%的重复单元的7和/或9位。
O-乙酰化的百分数是指含有O-乙酰化的重复单元的百分数。这可以在缀合前和/或缀合后在多糖中进行测量。
术语“糖”包括多糖或寡糖。多糖从细菌分离，或者从细菌分离且通过已知方法(参见例如EP 497524和EP497525)和任选地通过微流化大小调整至一定程度。可以调整多糖的大小，以减少多糖样品的粘度和/或改善缀合产品的过滤性。寡糖的特征在于通常是具有少量重复单元(通常具有5-30个重复单元)的水解多糖。
平均剂量通过添加所有其他多糖的剂量且除以其他多糖的数目而确定。其他多糖是免疫原性组合物内除了Hib以外的所有多糖，且可以包括脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖。“剂量”是向人施用的免疫原性组合物或疫苗的量。
Hib糖是流感嗜血杆菌b型的多聚核糖基磷酸酯(polyribosyl phosphate)(PRP)荚膜糖，或者由其衍生的寡糖。
在一个实施方案中，多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有0.1-20μg；1-10μg；2-10μg，2.5-5μg，约或恰好5μg；或约或恰好2.5μg的剂量的每种脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖。
为了本发明的目的，“约”或“近似”被定义为给定数字的10％上下以内。
在本发明的一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌糖缀合物中的至少两种、三种、四种或每种中的每一种的糖剂量任选地是相同的或近似相同的。
多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗任选地含有1:1:1:1或2:1:1:1或1:2:1:1或2:2:1:1或1:3:1:1或1:4:1:1 (w/w)的糖剂量比率的MenA、MenC、MenW135和MenY。
用于本发明的方法或用途中的疫苗任选地含有药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方案中，将多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗缓冲或调节至pH7.0 至8.0、pH 7.2至7.6或约或恰好pH 7.4。
多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗任选地在稳定剂例如多元醇诸如蔗糖或海藻糖存在的情况下进行冻干。
任选地，多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有足以增强对免疫原的免疫应答的量的佐剂。合适的佐剂包括，但不限于，铝盐(磷酸铝或氢氧化铝)、角鲨烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽、皂苷衍生物、分枝杆菌细胞壁制备物、单磷酰脂质A、霉菌酸衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱毒素B亚单位、聚磷腈和衍生物、和免疫刺激复合物(ISCOM)诸如Takahashi等人. (1990) Nature 344:873-875中所述的那些。
对于以上讨论的脑膜炎奈瑟氏球菌或HibMen组合，不使用任何铝盐佐剂，或者根本不使用任何佐剂可能是有利的。
正如所有免疫原性组合物或疫苗，免疫原的免疫有效量必须凭经验确定。待考虑的因素包括免疫原性，免疫原是否与佐剂或载体蛋白或其他载体复合或共价结合至佐剂或载体蛋白或其他载体，施用途径和待施用的免疫剂量的数目。此类因素是疫苗领域中已知的，且其完全在免疫学家在无需过多实验下进行此类确定的技术之内。
本发明的药物组合物或疫苗中可以存在不同浓度的活性剂。通常，物质的最低浓度是实现其意欲用途必需的量，而最高浓度是保留于溶液中或均匀悬浮于初始混合物内的最大量。例如，治疗剂的最小量任选地是提供单一治疗有效剂量的量。对于生物活性物质，最低浓度是在重构之后的生物活性必需的量，且最高浓度是在无法维持均匀悬浮的点。在单一剂量单位的情况下，所述量是单一治疗应用的量。通常，预期每个剂量包含1-100μg的蛋白抗原，任选地5-50μg或5-25μg。细菌糖的剂量的实例是10-20μg、5-10μg、2.5-5μg或1-2.5μg。物质的优选量在物质之间不同，但由本领域技术人员可容易确定。
本发明的疫苗制剂可用于借助经由全身或粘膜途径施用所述疫苗而保护或治疗易受感染的人患者。人患者任选为婴儿(小于12个月)，或幼儿(12-24、12-16或12-14个月)。这些施用可以包括经由肌内、腹膜内、皮内或皮下途径的注射；或经由粘膜施用于口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。除了单一施用途径以外，还可以使用2种不同的施用途径。例如，可以ID(皮内)施用病毒抗原，而可以IM(肌内)或IN(鼻内)施用细菌蛋白。如果存在糖，则它们可以IM(或ID)施用，且细菌蛋白可以IN(或ID)施用。此外，本发明的疫苗，对于引发剂量，可以IM施用，对于加强剂量，可以IN施用。
本发明人已经进一步确定，以后加强剂量的包含至少两种选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖(MenW135)和脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)的荚膜糖的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗可以产生针对荚膜糖抗原的甚至更强的免疫应答。实施例3中提供的数据显示，初始免疫之后几年给予的加强免疫给出高得多的GMT，如通过SBA测定评价。额外加强剂量的脑膜炎球菌缀合物疫苗可以延长疫苗诱导的保护的持续时间。额外的加强剂量可以被认为是本发明的独立方面或本发明的共同施用方面的进一步步骤。
因此，提供了针对脑膜炎奈瑟氏球菌感染免疫的方法，其包括以下步骤：用包含分别缀合至载体蛋白的至少两种荚膜糖的多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗免疫12至24个月龄的人患者，所述荚膜糖选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖(MenW135)和脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)，且用包含各自分别缀合至载体蛋白的MenA、MenC、MenW135和MenY中的至少两种的加强脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗再次免疫4至20、5至15、5至11、5至9或5至6岁龄的人患者。
在一个实施方案中，多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenC和MenY缀合物和/或加强脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenC和MenY缀合物。
在一个实施方案中，多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenA、MenC、MenW135和MenY缀合物和/或加强脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenA、MenC、MenW135和MenY缀合物。
在一个实施方案中，加强脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗中的各荚膜糖缀合至选自破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM197的载体蛋白，优选地，所述载体蛋白是破伤风类毒素或CRM197，更优选地，所述载体蛋白是破伤风类毒素。
在一个实施方案中，多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗中的各荚膜糖缀合至选自破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM197的载体蛋白，优选地，所述载体蛋白是破伤风类毒素或CRM197，更优选地，所述载体蛋白是破伤风类毒素。
应当理解的是，脑膜炎球菌糖和上文对于本发明的初始方面记载的缀合物的属性也适用于本发明的第二方面。因此，脑膜炎球菌糖和上文记载的缀合物的描述任选地存在于多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗和加强脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗中。
疫苗制备物通常描述于Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York)中。脂质体内的包囊作用描述于Fullerton，美国专利4,235,877中。
发明人意欲，在每种情况下，本文的术语“包含(comprising)”、“ 包含(comprise)”和“包含(comprises)”可以分别与术语“由…组成(consisting of)”、“由…组成(consist of)”和“由…组成(consists of)”任选地替换。
本专利说明书内引用的所有参考文献或专利申请均通过引入并入本文。
为了可以更好地理解本发明，记载以下实施例。这些实施例仅用于说明的目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1
研究设计
根据良好临床规范和赫尔辛基宣言(1996 Somerset West)，在美国的59个中心中进行该阶段III、随机、对照研究。在登记之前从每个主体的父母/监护人获得书面知情同意书。
登记健康婴儿，且5:1随机化，以便在2、4和6个月龄用HibMenCY-TT和DTaP-HBV-IPV，或Hib-TT + DTaP-HBV-IPV接种(表1，图1)。在12-15个月龄(第四剂量阶段)，将用HibMenCY-TT + DTaP-HBV-IPV接种的儿童再次随机化(2:2:1)，以便在12-15个月龄接受MenACWY-TT，随后在15-18个月龄接受DTaP(MenACWY-TT组)；在15-18个月龄接受与DTaP共同施用的MenACWY-TT(Coad组)；或在12-15个月龄接受HibMenCY-TT，随后在15-18个月龄接受DTaP(HibMenCY-TT组)。Hib-TT + DTaP-HBV-IPV-引发的儿童没有再次随机化，且在15-18个月龄接受DTaP(对照组)。因为在进行研究时在美国持续缺少Hib缀合物疫苗，所以Coad、MenACWT-TT和对照组中的主体没有接受Hib加强接种。推迟Hib加强接种，直至Hib缀合物疫苗再一次可用的时间[25]。在美国批准用于<2岁儿童中使用的脑膜炎球菌缀合物疫苗的可用之前进行本研究；因此，对照组在研究期间没有接受脑膜炎球菌接种。允许所有主体接受ACIP推荐的常规疫苗。
由于疫苗的不同表现，本研究在初级阶段是单盲的。在第四剂量之前，由于各治疗组的不同数量的疫苗和血清采样时间点，父母/监护人被告知他们的孩子在初级阶段已经接受了何种疫苗，且知道其在第四剂量阶段的治疗组。
随机化列表用于对疫苗编号。使用中央、基于网络的***进行每个研究阶段的随机分配，其包括最小化程序，以确保在个别中心的各组之间的平衡分配。
研究主体和疫苗
参与者是6-12周龄、妊娠至少36周后出生的健康婴儿。排除标准包括出生以来先前接受任何血液产品，或者第一剂量的30天内接受除了肺炎球菌缀合物疫苗或人轮状病毒疫苗以外的疫苗。允许乙型肝炎疫苗的出生剂量。在研究之外进行的由于脑膜炎奈瑟氏球菌、Hib、白喉、破伤风、百日咳、乙型肝炎或脊髓灰质炎导致的疾病史，或针对任何这些疾病的接种导致从初级和第四剂量阶段排除。为了纳入第四剂量阶段，主体必须接受所有3个初始接种剂量。
一个0.5 ml剂量的HibMenCY-TT含有2.5µg缀合至TT的Hib磷酸多核糖基核糖醇(PRP)和各5 µg缀合至TT的MenC多糖和MenY多糖(总TT含量~18µg)。一个0.5 ml剂量的MenACWY–TT含有各5µg缀合至TT的脑膜炎球菌血清群A、C、W-135和Y多糖(总TT含量~44µg)。冻干的脑膜炎球菌疫苗用无菌注射盐水重构，且肌内施用至左大腿或手臂中。
其他地方描述了批准的DTaP-HBV-IPV (Pediarix™, GlaxoSmithKline Vaccines)和Hib-TT (ActHIB™, Sanofi Pasteur)疫苗的组成[10]。DTaP (Infanrix™, GlaxoSmithKline Vaccines)的组成与DTaP-HBV-IPV的DTaP组分相同。
研究目标
主要目标是1)表明在针对血清群C和Y的血清杀菌活性(使用人补体源：hSBA)滴度≥1:8的主体的百分数和几何平均滴度(GMT)方面有和无共同施用DTaP的MenACWY-TT相比于HibMenCY-TT的第四剂量的非劣效性；2)表明在针对血清群A和W-135的hSBA滴度≥1:8的主体的百分数方面有和无共同施用DTaP的MenACWY-TT的单一剂量的免疫原性；和3)表明在抗白喉和抗破伤风抗体浓度≥1.0 IU/ml的主体的百分数和抗百日咳几何平均浓度方面与MenACWY-TT共同施用的DTaP相比于单独的DTaP施用的非劣效性。本文描述了根据预先定义的统计标准的脑膜炎球菌端点。表2中总结了端点和免疫应答。其他地方报道了与DTaP加强疫苗相关的端点[24]。
免疫原性评价
在15-18个月龄时，在Coad组中，在接种后一个月(表1)和接种之前从主体采集血液样品(以评价用HibMenCY-TT的3剂量婴儿接种之后在15-18个月龄时的hSBA持续性)。
安全性和反应原性评价
在第四剂量接种之后持续8天(第0-7天)，由父母将具体的局部和全身症状记录于日记卡上。接种之后持续31天，记录所有其他不良事件(AE)。经由标准化电话脚本从剂量1记录严重不良事件(SAE)和表明新发生慢性疾病的特定AE的发生以及促进至急诊室(ER)就医的状况，直至最后接种之后6个月。在第四剂量阶段期间记录皮疹的发生。SAE被定义为导致死亡或危及生命的事件；需要住院或延长住院时间的事件；导致主体的残疾或无能的事件；或研究人员视为严重的任何其他事件。
统计分析
根据方案(ATP)免疫原性组群进行免疫原性的分析，所述组群包括遵守方案定义的程序的所有接种的主体。以分层方式评价主要目标；也就是说，只有符合所有先前目标之后，才可以认为正式符合目标。
Coad组中的接种前血液样品的收集(表1)允许计算该组中接种之前和之后的疫苗应答率和GMT比率。疫苗应答被定义为初始血清阴性主体中接种后抗体滴度≥1:8，和初始血清阳性主体中的接种前抗体滴度增加≥4倍。
如果达到指定截止值的主体的百分数在2组之间的差异的渐近标准化95％置信区间(CI)不包括0，或者如果各组之间的GMT比率的95％CI不包括1，则在探索性分析中强调了各组之间的可能差异。应当考虑不调整多重性而谨慎解释这些探索性分析。
对总接种组群进行安全性的分析，所述总接种组群包括所有接种主体。对各组以精确95％CI计算症状的发病率和强度。
使用SAS®软件版本9.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, United States)和ProcStatXact 7.0进行分析。
结果
研究主体
在初始接种阶段中登记和接种总共1554个主体，其中1447个完成了该研究阶段。对于第四剂量阶段，登记和接种1303个幼儿(图1)，其中1238个主体完成该研究的第四剂量接种阶段，且1209个完成延长的安全性随访阶段。主体退出研究或从ATP组群排除的原因总结列于表3(补充表)。两个主体(一个来自MenACWY-TT组且一个来自HibMenCY-TT组)，在第四剂量接种阶段由于AE退出。两个主体在DTaP的计划第五剂量前经历了热性惊厥：一个在第四剂量之后38天发作，一个在第四剂量之后43天发作。无一事件被研究人员认为与接种相关。ATP免疫原性组群中存在955个主体。Co-ad组中的男性比女性更多(分别165相比于138)，且对照组中的女性比男性更多(分别97相比于78)。研究组另外在人口学特征方面是相当的 表4：补充)。
免疫原性
在12-15个月龄用HibMenCY-TT或MenACWY-TT或在15-18个月龄用MenACWY-TT + DTaP接种之后，100%主体具有针对血清群C和Y的≥1:8的hSBA滴度(图2)，他们先前已经针对血清群C和Y进行引发。用MenACWY-TT接种的主体中的至少96.1％也具有针对血清群A和W-135的≥1:8的hSBA滴度(图2)。对照组中的非常少的主体(≤7.8%)具有针对任何疫苗血清型的≥1:8的hSBA滴度。
在接种后一个月hSBA滴度≥1:8的主体的百分数方面，探索性分析没有检测血清群C和Y的与HibMenCY-TT组相比MenACWY-TT和Coad组之间的任何差异。然而，结果表明1) MenACWY-TT和Coad组与HibMenCY-TT组相比，针对血清群C和Y和2) Coad组与MenACWY-TT组相比，针对血清群C、W-135和Y，的较高接种后GMT(图3)。
Coad组中具有疫苗响应的主体的百分数针对血清群A为95.9% (95% CI 92.3%；98.1%)，针对血清群C为99.2% (97.3%；99.9%)，针对血清群W-135为97.7% (94.8%；99.3%)且针对血清群Y为98.9% (96.8%；99.8%)。初始血清阴性主体中的至少96.1％具有针对一种或多种血清群的疫苗应答。
Coad组中接种之前，在用HibMenCY-TT 3剂量引发之后，90.7%和96.3%的主体维持针对血清群C和Y的血清保护性hSBA滴度(≥1:4)。在Coad组中，从接种前至接种后，针对血清群C的GMT增加107倍，且针对血清群Y的GMT增加53倍，表明HibMenCY-TT引发之后的加强应答；且针对血清群A的GMT增加44倍，且针对血清群W-135的GMT增加244倍，显示对于首次暴露于这些疫苗抗原的良好免疫原性。
在MenACWY-TT和Coad组中以及在剂量4不接受W-135疫苗抗原的HibMenCY-TT受体中，针对血清群W-135的剂量4后的血清保护率和GMT较高。在对照中没有观察到针对血清群W-135的响应。
反应原性
在3个研究组中，报道局部和全身症状的主体的百分数在相同范围内(图4)。从初始接种开始直至第四剂量后6个月在ER随访中报道SAE、慢性疾病的新发生和AE结果的主体的百分数在3组间是类似的(表5)。两个主体中报道的三个SAE被认为是疫苗相关的：存在一例松软婴儿(floppy infant)，其在剂量4后47天发生(Coad组)，其在2天后恢复(resolved)。此外，存在首次初始接种剂量后65天发生的一个报道的惊厥病例(HibMenCY-TT组)，其在婴儿中恢复，所述婴儿后来在剂量1后89天死于第二SAE(婴儿猝死综合征)。在研究期间存在其他三例死亡(所有都在初始阶段)，其中无一被认为是疫苗相关的：一个主体在剂量1后33天死于婴儿猝死综合征；一个主体在剂量1后43天死于脱水、溶血性尿毒综合征和败血性休克，且一个主体死于白血病(剂量3后57天发作)和最终呼吸衰竭。
实施例 2 －使用 MALLS 测定分子量
检测器与HPLC大小排阻柱偶联，从HPLC大小排阻柱洗脱样品。一方面，激光散射检测器测量大分子溶液在16度角散射的光强度，另一方面，在线设置的干涉测量折光仪(interferometric refractometer)允许测定洗脱样品的量。从这些强度，可以测定溶液中大分子的大小和形状。
重均分子量(Mw)被定义为所有物质的重量的总和乘以它们各自分子量，且除以所有物质的重量总和。
a) 重均分子量：-Mw-
b) 数均分子量：-Mn-
c) 均方根半径：-Rw-和R2w是如下定义的方半径(square radius)：
R2w或(r2)w
(-mi-是散射中心i的质量，且-ri-是大分子的散射中心i和重心之间的距离)。
d) 多分散性被定义为比率-Mw/Mn-。
脑膜炎球菌多糖通过MALLS通过上样至组合使用的两个HPLC柱(TSKG6000和5000PWxl)上进行分析。将25 μl多糖上样至柱上且用0.75 ml过滤水进行洗脱。使用光散射检测器(装备有488 nm的10 mW氩气激光的Wyatt Dawn DSP)和干涉测量折光仪(装备有P100单元和498nm红色滤光片的Wyatt Otilab DSP)来检测多糖。
通过Debye方法使用Astra 4.72软件的多项拟合分阶来计算所有样品的分子量多分散性和回收率。
实施例 3 –加强免疫的影响
进一步研究评估健康儿童中与脑膜炎球菌血清群C缀合物疫苗(MenC-CRM197, Wyeth LLC)相比用脑膜炎球菌血清群A、C、W-135、Y缀合物疫苗(MenACWY-TT, GlaxoSmithKline Vaccines)加强免疫之后12个月的抗体持续性。
方法：在芬兰的该阶段III、开放标签、对照的多中心研究(NCT00955682)中，12–23个月龄的先前随机化(3:1)且用单剂量的MenACWY‐TT或MenC-CRM197引发的儿童(NCT00474266)在引发后48个月接受加强剂量的相同疫苗。使用兔(rSBA；截止值1:8)和人(hSBA；截止值1:4)补体用血清杀菌抗体测定在第60个月(M)(加强后12个月)评估免疫原性。记录疫苗相关的严重不良事件(SAE)，直到M60。
结果：在293个加强的儿童中，286个在M60回复(returned)，在M60持续性的根据方案组群中包括277个(MenACWY‐TT:N=231；MenC-CRM197:N=46)。在M60，所有MenACWY-TT受体保留≥1:8的rSBA滴度(除了MenC，97.4％)和≥1:4的hSBA滴度(除了MenA，95.5％)(表格)。在M60的hSBA几何平均抗体滴度(GMT)与M49(加强后1个月)相比下降，但高于初始接种后。MenC血清阳性率和GMT(rSBA，hSBA)在各组之间是相当的。没有报道任何疫苗相关的SAE。
结论：rSBA和hSBA测定评估的针对每种血清群的抗体在>97%的儿童中持续MenACWY-TT加强接种之后12个月。这些数据表明，额外加强剂量的MenACWY-TT可以延长疫苗诱导的保护的持续时间。

Claims (96)

1.针对脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)感染免疫的方法，其包括以下步骤：a)用包含分别缀合至载体蛋白以形成至少一种、两种或三种细菌糖缀合物的至少一种、两种或三种细菌糖的细菌糖缀合物疫苗免疫0至11个月的第一年龄的人患者；和b)用包含分别缀合至载体蛋白的至少两种荚膜糖的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗免疫12至24个月的第二年龄的人患者，所述荚膜糖选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖(MenW135)和脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)，其中所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗与包含白喉类毒素和破伤风类毒素的疫苗共同施用。
2.权利要求1的方法，其中步骤a)的所述至少一种、两种或三种细菌糖包含流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza) (Hib)糖。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤a)的所述至少一种、两种或三种细菌糖包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C (MenC)荚膜糖。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中步骤a)的所述至少一种、两种或三种细菌糖包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y (MenY)荚膜糖。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中步骤a)的所述载体蛋白是破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM197。
6.权利要求5的方法，其中步骤a)的所述载体蛋白是破伤风类毒素，任选以5-40、10-30、15-20 μg或约18μg/剂量的总TT含量。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中步骤a)的免疫涉及施用2或3个剂量的细菌糖缀合物，任选在2、4和6个月龄。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中与单独施用脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗相比，步骤b)中的共同施用脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗与包含白喉毒素和破伤风毒素的疫苗导致针对MenA、MenC、MenW135或MenY中的至少一种的免疫原性增加至少10％，任选地通过SBA测定测量。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中步骤a)过程中，所述细菌糖缀合物疫苗与包含DTP的疫苗同时施用。
10.权利要求9的方法，其中所述包含DTP的疫苗含有乙型肝炎抗原。
11.权利要求9或10的方法，其中所述包含DTP的疫苗含有IPV。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中步骤b)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenA。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中步骤b)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenC。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中步骤b)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenW135。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中步骤b)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenY。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中步骤b)的所述载体蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM197。
17.权利要求16的方法，其中步骤b)的所述载体蛋白是破伤风类毒素。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中步骤a)的所述载体蛋白和步骤b)的所述载体蛋白是相同的。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中包含白喉类毒素和破伤风类毒素的疫苗是DTPa疫苗。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中步骤b)免疫12至18个月龄的人患者。
21.权利要求20的方法，其中步骤b)免疫15-18个月龄的人患者。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其包括进一步的步骤c)：用包含分别缀合至载体蛋白的至少两种荚膜糖的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗免疫4至20、5至15或5至11岁的第三年龄的人患者，所述荚膜糖选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖(MenW135)和脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)。
23.权利要求22的方法，其中所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗与权利要求1-18中任一项的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗是相同的。
24.权利要求22的方法，其中所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有各自分别缀合至破伤风类毒素载体蛋白的MenA、MenC、MenW135和MenY的荚膜糖。
25.用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中人患者在时间表中免疫，所述时间表包括步骤a)和b)，其中步骤a)用包含缀合至载体蛋白以形成至少一种、两种或三种细菌糖缀合物的至少一种、两种或三种细菌糖的细菌糖缀合物疫苗免疫0至11个月的第一年龄的人患者；且步骤b)用包含分别缀合至载体蛋白的至少两种荚膜糖的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗免疫12至24个月的第二年龄的人患者，所述荚膜糖选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖(MenW135)和脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)，其中所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗与包含白喉类毒素和破伤风类毒素的疫苗共同施用。
26.根据权利要求25的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤a)的所述至少一种、两种或三种细菌糖包含流感嗜血杆菌(Hib)糖。
27.根据权利要求25或26的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤a)的所述至少一种、两种或三种细菌糖包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C (MenC)荚膜糖。
28.根据权利要求25-27中任一项的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤a)的所述至少一种、两种或三种细菌糖包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y (MenY)荚膜糖。
29.根据权利要求25-28中任一项的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤a)的所述载体蛋白是破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM197。
30.根据权利要求29的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤a)的所述载体蛋白是破伤风类毒素，任选以5-40、10-30、15-20 μg或约18μg/剂量的总TT含量。
31.根据权利要求25-30中任一项的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤a)的免疫涉及施用2或3个剂量的细菌糖缀合物，任选在2、4和6个月龄。
32.根据权利要求25-31中任一项的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中与单独施用脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗相比，步骤b)中的共同施用脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗与包含白喉毒素和破伤风毒素的疫苗导致针对MenA、MenC、MenW135或MenY中的至少一种的免疫原性增加至少10％，任选地通过SBA测定测量。
33.根据权利要求25-32中任一项的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤a)过程中，所述细菌糖缀合物疫苗与包含DTP的疫苗同时施用。
34.根据权利要求33的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中所述包含DTP的疫苗含有乙型肝炎抗原。
35.根据权利要求33或34的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中所述包含DTP的疫苗含有IPV。
36.根据权利要求25-35中任一项的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenA。
37.根据权利要求25-36中任一项的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenC。
38.根据权利要求25-37中任一项的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenW135。
39.根据权利要求25-38中任一项的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenY。
40.根据权利要求25-39中任一项的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)的所述载体蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM197。
41.权利要求40的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)的所述载体蛋白是破伤风类毒素。
42.根据权利要求25-41中任一项的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤a)的所述载体蛋白和步骤b)的所述载体蛋白是相同的。
43.根据权利要求25-42中任一项的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中包含白喉类毒素和破伤风类毒素的疫苗是DTP疫苗。
44.根据权利要求25-43中任一项的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)免疫12至18个月龄的人患者。
45.根据权利要求44的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)免疫15-18个月龄的人患者。
46.根据权利要求25-45中任一项的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其包括进一步的步骤c)：用包含分别缀合至载体蛋白的至少两种荚膜糖的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗免疫4至20、5至15或5至11岁的第三年龄的人患者，所述荚膜糖选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖(MenW135)和脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)。
47.根据权利要求46的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗与权利要求25-42中任一项的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗是相同的。
48.根据权利要求46的用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有各自分别缀合至破伤风类毒素载体蛋白的MenA、MenC、MenW135和MenY的荚膜糖。
49.根据任一前述权利要求的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有具有高于50kDa、75kDa、100kDa、110kDa、120kDa或130kDa的平均大小的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖。
50.根据任一前述权利要求的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，其各自为天然多糖或平均大小相对于天然多糖降低不多于10倍。
51.根据任一前述权利要求的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有至少一种作为天然多糖的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖。
52.根据任一前述权利要求的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有至少一种大小通过微流化降低的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖。
53.根据任一前述权利要求的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有至少一种选自MenY和MenW135的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，其被微流化，任选地以使平均大小相对于天然荚膜多糖降低不多于10倍。
54.根据任一前述权利要求的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有至少一种作为天然多糖的选自MenA和MenC的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖。
55.根据任一前述权利要求的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有具有高于50kDa、75kDa、100kDa的平均大小或者50-100kDa或55-90KDa或60-80kDa的平均大小的MenA荚膜糖。
56.根据任一前述权利要求的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有具有高于50kDa、75kDa、100kDa的平均大小或者100-200kDa、100-150kDa、80-120kDa、90-110kDa、150-200kDa、120-240kDa、140-220kDa、160-200kDa或190-200kDa的平均大小的MenC荚膜糖。
57.根据任一前述权利要求的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有具有高于50kDa、75kDa、100kDa的平均大小或者60-190kDa或70-180kDa或80-170kDa或90-160kDa或100-150kDa、110-145kDa或120-140kDa的平均大小的MenY荚膜糖。
58.根据任一前述权利要求的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有具有高于50kDa、75kDa、100kDa的平均大小或者60-190kDa或70-180kDa或80-170kDa或90-160kDa或100-150kDa、140-180kDa、150-170kDa或110-140kDa的平均大小的MenW135荚膜糖。
59.根据任一前述权利要求的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有各自具有1:5-5:1或1:1-1:4(w/w)的多糖:载体比率的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物。
60.根据任一前述权利要求的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有至少一种直接缀合至第二载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖缀合物。
61.根据权利要求60的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有直接缀合至第二载体蛋白的Men W和/或MenY、MenW和/或MenC、MenY和/或MenC、或MenW和MenC和MenY。
62.根据权利要求60或61的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有至少一种通过CDAP化学法直接缀合的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖缀合物。
63.根据权利要求60-62中任一项的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有缀合物，其中Men W和/或Y荚膜糖与第二载体蛋白的比率为1:0.5至1:2。
64.根据权利要求60-3中任一项的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有MenC缀合物，其中MenC多糖与载体蛋白的比率为1:0.5至1:2。
65.根据任一前述权利要求的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有一种或多种经由接头缀合至载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖。
66.根据权利要求65的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中所述接头是双官能的。
67.根据权利要求65或66的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中所述接头具有两个反应性氨基。
68.根据权利要求65-67中任一项的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中所述接头具有4至12个碳原子。
69.根据权利要求65-68中任一项的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中所述接头是ADH。
70.根据权利要求65-69中任一项的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中所述脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖用CDAP化学法缀合至所述接头。
71.根据权利要求65-70中任一项的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中所述载体蛋白使用碳二亚胺化学法、任选地使用EDAC缀合至所述接头。
72.根据权利要求65-71中任一项的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中MenA经由接头缀合至载体蛋白。
73.根据权利要求72的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中MenA多糖与载体蛋白的比率为1:2至1:5。
74.根据权利要求65-73中任一项的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中MenC经由接头缀合至载体蛋白。
75.根据权利要求74的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中MenC多糖与载体蛋白的比率为1:2至1:5。
76.根据任一前述权利要求的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗进一步包含缀合至载体蛋白的流感嗜血杆菌b荚膜糖。
77.根据任一前述权利要求的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗含有脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B抗原、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B外膜囊泡制备物和/或脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B蛋白。
78.根据任一前述权利要求的方法或用于预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中步骤b)和/或步骤c)的载体蛋白以10-100、20-90、30-80、30-70、35-60或40-50μg的总剂量存在于所述脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物剂量中。
79.针对脑膜炎奈瑟氏球菌感染免疫的方法，其包括以下步骤：用包含分别缀合至载体蛋白的至少两种荚膜糖的多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗免疫12至24个月龄的人患者，所述荚膜糖选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖(MenW135)和脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)，且用包含各自分别缀合至载体蛋白的MenA、MenC、MenW135和MenY中的至少两种的加强脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗再次免疫4至20、5至15、5至11、5至9或5至6岁龄的人患者。
80.权利要求79的方法，其中所述多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenC和MenY缀合物。
81.权利要求79或80的方法，其中所述加强脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenC和MenY缀合物。
82.权利要求79-81中任一项的方法，其中所述多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenA、MenC、MenW135和MenY缀合物。
83.权利要求79-82中任一项的方法，其中所述加强脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenA、MenC、MenW135和MenY缀合物。
84.权利要求79-83中任一项的方法，其中所述加强脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗中的每种荚膜糖缀合至选自破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM197的载体蛋白。
85.权利要求84的方法，其中所述载体蛋白是破伤风类毒素。
86.权利要求79-85中任一项的方法，其中所述多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗中的每种荚膜糖缀合至选自破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM197的载体蛋白。
87.权利要求86的方法，其中所述载体蛋白是破伤风类毒素。
88.用于针对脑膜炎奈瑟氏球菌感染免疫的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中用包含分别缀合至载体蛋白的至少两种荚膜糖的多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗免疫12至24个月龄的人患者，所述荚膜糖选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A荚膜糖(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群C荚膜糖(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清群W135荚膜糖(MenW135)和脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y荚膜糖(MenY)，且用包含各自分别缀合至载体蛋白的MenA、MenC、MenW135和MenY中的至少两种的加强脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗再次免疫4至20、5至15、5至11、5至9或5至6岁龄的人患者。
89.根据权利要求88的用于针对脑膜炎奈瑟氏球菌感染免疫的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中所述多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenC和MenY缀合物。
90.根据权利要求88或89的用于针对脑膜炎奈瑟氏球菌感染免疫的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中所述加强脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenC和MenY缀合物。
91.根据权利要求88-90中任一项的用于针对脑膜炎奈瑟氏球菌感染免疫的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中所述多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenA、MenC、MenW135和MenY缀合物。
92.根据权利要求88-91中任一项的用于针对脑膜炎奈瑟氏球菌感染免疫的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中所述加强脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗包含MenA、MenC、MenW135和MenY缀合物。
93.根据权利要求88-92中任一项的用于针对脑膜炎奈瑟氏球菌感染免疫的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中所述加强脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗中的每种荚膜糖缀合至选自破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM197的载体蛋白。
94.权利要求84的方法，其中所述载体蛋白是破伤风类毒素。
95.根据权利要求88-94中任一项的用于针对脑膜炎奈瑟氏球菌感染免疫的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中所述多价脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗中的每种荚膜糖缀合至选自破伤风类毒素、白喉类毒素或CRM197的载体蛋白。
96.权利要求95的用于针对脑膜炎奈瑟氏球菌感染免疫的脑膜炎奈瑟氏球菌缀合物疫苗，其中所述载体蛋白是破伤风类毒素。
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