CN105181658B - 感测装置及应用其的感测***及感测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的题目是感测装置及应用其的感测***及感测方法。一种供微感测的装置，用于液体样本的分析物及缓冲液，包括：至少一第一入口、至少一第二入口、微流道以及至少一感测分子固定组件。第一入口供输入液体样本。第二入口供输入缓冲液。微流道连通第一入口及第二入口。感测分子固定组件用以固定供分析物及缓冲液的感测分子于微流道内。本发明还提供一种感测***及感测方法。

Description

感测装置及应用其的感测***及感测方法
技术领域
本发明关于一种结合荧光显微镜的生物功能化纳米狭缝的感测装置及应用其的感测***及感测方法，以在简单且低成本的设置条件下，进行无须洗涤、实时且可用于标记分子的高速感测动力学(同时包含结合动力学及解离动力学)研究。
背景技术
蛋白质相互作用(protein interaction)的动力学监控能够洞察这些蛋白质的细胞功能，对于开发潜在的诊断测试以及生物治疗等项目，也是重要的关键。表面等离子体共振效应(Surface Plasmon Resonance, SPR)及石英晶体微天平(Quartz CrystalMicrobalance,QCM)为两种现有用于制药和生命科学领域的标准商业化技术，以提供分子相互作用且无须标记(label)的实时检测。然而，这些检测技术需要高成本的专用传感器表面，以及光学及机械组件的整合，反而增加了整体的检测成本和复杂的仪器设置。
更详细而言，表面等离子体共振需要较高成本的传感器表面以及复杂的设置，表面等离子体共振缺乏空间解析率且昂贵/复杂来实施、又具低灵敏度(约nM)、较大的试剂消耗量(约1000倍)、低连锁反应能力以及高感测芯片成本(约美金$300/个)。而石英晶体微天平无空间解析率且灵敏度低，石英晶体微天平甚至不具有连锁反应能力并且需要较大的试剂用量以及高感测芯片成本。
全内反射荧光显微镜(total internal reflection fluorescence microscopy,TIRFM)需要复杂的设备以及较大的试剂消耗量。整合的生物电子传感器则涉及复杂的制造工艺和电子技术。
上述的典型平台的灵敏度较低(纳摩尔等级)，且不适合用于较小量的样本消耗。
检测样本中的特定生物分子所需的时间，会受到检测器的灵敏度，以及能够被检测到的最低量分子接触传感器所需的时间所影响。虽然目前已有多种具备高灵敏度的检测装置(例如电化学传感器、光学传感器…)，然而当检测的目标是小区域或低浓度的样本时，扩散时间是大多数微流体感测平台的主要限制因素。因此，克服扩散的问题已经成为高速检测不可或缺的必要条件之一。应用于微全分析*** (micro-total analysis systems,microTAS)以及微数组技术的技术手段包括了利用于微流道或纳米流道内产生对流和往复流，以混合溶液，并且局部地增加生物分子的浓度，例如通过介电泳的方式。然而，即使检测时间能够藉由上述的方式由原本的数小时减少为数分钟，所述这些方法的主要缺点为较难执行，且其制造过程亦较为复杂。
发明内容
为了促进此技术的发展，微米或纳米级的流体设备的研究及开发，其可应用于单分子分析(single molecule analysis)、细胞分选、DNA分离以及快速的多重蛋白质检测(fast multiplexed protein detection)。纳米流流道与先进的生物传感技术的结合为定点照护临床诊断开启新页，起因为其可将此技术整合入实验室芯片(lab-on-a-chip)并将尺寸予以缩小。纳米流流道的生物传感器主要能够藉由缩短固定探针分子与在狭窄的流道流向分析物之间的扩散距离，进而提升分析速度以减少昂贵的生物检测试剂的消耗。
为达上述目的，依据本发明的一种供微感测的装置，用于液体样本的分析物及缓冲液，包括：至少一第一入口、至少一第二入口、微流道以及至少一感测分子固定组件。第一入口供输入液体样本。第二入口供输入缓冲液。微流道连通第一入口及第二入口。感测分子固定组件用以固定供分析物及缓冲液的感测分子于微流道内。
在一实施例中，感测分子能够对液体样本及缓冲液分别产生结合反应及反向的解离反应。
在一实施例中，流道具有足够长度使得分析物与感测分子的结合反应可被观察到。
在一实施例中，分析物与感测分子的结合反应呈现荧光。
在一实施例中，当液体样本流入微流道后，感测分子与液体样本的分析物产生结合反应。当缓冲液流入微流道后，感测分子与分析物产生分离反应。
在一实施例中，装置还包括：基板以及盖部。基板具有对应于第一入口、第二入口及微流道的多个槽道。盖部面向槽道并与基板结合。其中盖部与槽道形成第一入口、第二入口及微流道。感测分子固定组件设置在与微流道所对应的槽道上。
在一实施例中，基板的材料包括硅、二氧化硅、玻璃、和/或塑料，盖部的材料包括聚二甲基硅氧烷、硬质聚二甲基硅氧烷、聚倍半硅氧烷、塑料材料和/或涂布于玻璃上的塑料材料，感测分子固定组件以金、玻璃或塑料对所述基板进行表面处理而形成。
在一实施例中，液体样本沿着自第一入口往第二入口延伸的第一方向流动。微流道于介于第一入口及第二入口之间的长度的范围介于 100μm～5cm。基板与盖部之间的平均距离介于50nm～10μm。感测分子固定组件于第一方向上的长度的范围介于1μm至整个流道的长度。
在一实施例中，装置还包括容槽。容槽与第二入口连通，供存放所述缓冲液。
在一实施例中，微流道包括多个纳米狭缝。
为达上述目的，依据本发明的一种感测***包括感测装置、流体发生器、流体控制单元、取像单元以及计算单元。流体发生器连接感测装置的第一入口及第二入口。流体控制单元控制流体发生器产生流体并自第一入口流动至第二入口，藉以驱使液体样本或缓冲液流入微流道。取像单元对微流道取得至少一影像。计算单元根据影像产生感测结果。
在一实施例中，流体发生器包括产生压力驱动流的加压泵或毛细泵，或者是用于产生电渗流的电动泵。
在一实施例中，取像单元从微流道截取针对结合反应的第一旷时影像，并且从微流道截取针对解离反应的第二旷时影像。计算单元使用结合动力学及解离动力学根据第一旷时影像及第二旷时影像产生感测结果。
为达上述目的，依据本发明的一种感测方法包括以下步骤：驱动液体样本由第一入口流入微流道，使得分析物与感测分子结合；驱动缓冲液由第二入口流入微流道，使得分析物与感测分子解离；以及根据结合结果与解离结果以产生感测图的感测结果。
在一实施例中，产生步骤包括：根据结合结果取得结合动力学信息；根据解离结果取得解离动力学信息；以及根据结合动力学信息以及解离动力学信息结果以产生感测结果。
在一实施例中，产生步骤包括：从结合结果分析荧光强度以取得结合动力学信息；从解离结果分析另一荧光强度以取得解离动力学信息；以及根据结合动力学信息以及解离动力学信息结果以产生感测结果。
在一实施例中，感测方法还包括：驱动再生溶液至流道；以再生溶液浸润流道；以及自流道移除再生溶液。
本发明提供一种感测装置及应用其的感测***及感测方法，其实际应用为一种生物功能性纳米流道狭缝，并搭配传统的荧光显微镜技术使用，以提供一种应用于动力学研究中，简单、低成本但仍有效的生物感测平台。感测装置具有一个深度减少至亚微米(sub-micrometer) 等级的流道，并具有以下的优势：(1)大幅减少的扩散长度，使得在受限制的区域仍可以达成优化的目标捕捉效率，因此，输入至感测装置内的所有分析物皆可进行分析，且解离反应可简单地在结合反应完成后，于同一流道中通过反转流的方式进行，而无须经清洗后另外添加新的缓冲液进入流道中，从而可简化操作流程并节省操作时间；(2) 减量的样本需求，可利用传统的荧光显微镜进行感测分子固定组件(感测区)的分析，从而无须使用复杂或昂贵的实验仪器，例如表面等离子体共振效应、全内反射荧光显微镜或石英晶体微天平等技术；(3) 信噪比(signal to noise ratio)与流道高度成反比。
此外，本发明所提供的感测装置及应用其的感测***及感测方法，使大采样面积覆盖于一定数目的像素数之上，相较于传统不具有空间解析率的检测平台，本申请的检测装置、检测***及检测方法可减少统计误差(以具有更高的精确度)。
本申请藉由提供以下的功效，解决了已知技术的问题：(1)在提供更高的检测灵敏度以及简单的实验设置的前提下，藉由反转流操作减少动力学分析时间；(2)在微量的样品分析中进行有效率的分析物捕捉；(3)具有时空解析率的生物反应/结合动力学分析，以降低统计上的误差。
附图说明
图1A显示一种应用于蛋白质动力学研究的生物功能化纳米狭缝装置的示意图。受体探针分子(receptor probe molecules)被固定于位于纳米流道(nanochannel)底部的感测分子固定组件表面。荧光标记的目标分子藉由任何一种驱动流体输入，与探针固定传感器相互作用，蛋白质-受体的动力学反应以荧光显微镜进行实时的监测。
图1B显示利用图1A所示的纳米流控设备进行动力学分析的感测图表。于结合阶段(Association)，流动分析物会结合到位于传感器表面的固定受体分子，使荧光强度增加。达到平衡后，结合速率会等于解离速率，此时，缓冲溶液则以反转流的方式(方向)输入滞流道中，而受体-分析物复合物则会开始解离。于再生(regeneration)步骤中，再生溶液短暂地被用于破坏上述的结合，并产生自由的受体以应用于下一次的量测中。
图2显示用于纳米流流道内的异质免疫(heterogeneous immunoreaction)的有限元素仿真的二维模型，所述纳米流流道的长度 (L)为500微米，而流道高度(H)为450纳米，其中于流道的底部包含了长度为50微米的感测区域。浓度C0的分析物由左侧的入口以流速(v)被引入，并于流道内沿着x方向的对流流动。它们被允许在各个方向自由地扩散，并且被固定于反应区，表面探针密度为bm的探针捕捉。生物特异性反应的动力学藉由其结合速率(ka)及解离速率(kd) 定义。
图3显示生物功能化纳米狭缝封装程序以及流体连接方式。分析物溶液自其中一个入口进入，而另一入口则用以灌注缓冲液，以有效地通过反转缓冲流技术于单一实验中进行结合相及解离相的免疫反应研究。
图4显示应用于纳米狭缝中蛋白质动力学研究的金传感器的两种表面功能化架构示意图(尺寸仅为示意)。(a)模型I显示于1％的生物素巯基修饰表面的链亲和素-生物素结合；(b)模型II显示于10％的生物素巯基修饰表面的鼠抗兔IgG抗体/抗小鼠IgG抗体与链亲和素-生物素结合键结。端羟基硫醇化合物扮演间隔物的角色，以减少蛋白质在金表面上的非特异性吸附。纳米狭缝装置的照片已证实上述的说明。
图5A显示于生物功能性的纳米狭缝中，链亲和素-生物素结合的实时感测反应。各浓度的动力学曲线由不同的纳米流装置所测量得知 (误差线：标准误差)。感测反应依据有限元素法以及采取Langmuir 1:1 反应模型的均匀混合模式(well-mixed model)，以标准化至相对的荧光强度并配合计算模型。图5A中的实线(—)以及虚线(----)分别表示应用有限元素法及均匀混合模式所得的最佳拟合预测曲线。由于反应时间较长，链亲和素的最低浓度(10nM)的结合曲线亦同时显示于图5A中。
图5B为利用非线性最小二乘拟合为链亲和素浓度的函数所决定的初始反应速率常数(Kapp)的曲线图。此图显示R2值呈线性趋势(R2为0.9903)。
图6A为在Alexa Fluor-647鼠抗兔IgG(3nM)注射入抗小鼠的修饰纳米狭缝中的结合与解离过程中，所拍摄的荧光图像快照。结合反应结束后，藉由在纳米流道中反转流的方式进行解离反应。
图6B显示小鼠IgG/抗老小鼠IgG的实时感测反应，其于不同的分析物浓度(范围从0.46nM至15nM，误差线：标准误差)，通过生物功能性的纳米狭缝进行量测。上述数据经标准化至相对的荧光强度并适配至三种不同的模型：(1)有限元素法、(2)均匀混合模式以及(3)由BIA评估软件进行的整体-局部修正，采取Langmuir 1:1反应模型。图6B中显示的实线(—)、虚线(----)以及点线(……)分别表示应用有限元素法、均匀混合模式、进行的整体-局部修正所得的最佳拟合预测曲线。残留物与时间所呈现的关系图表亦依据不同的浓度进行呈现。
图6C显示所得的初始反应速率常数(Kapp)作为小鼠IgG浓度的函数关系图，显示R2值呈线性趋势(R2为0.9959)。
图6D则为老小鼠IgG/抗小鼠IgG的结合动力学感测图，其取得自类似表面等离子体共振效应测量方式。动力学曲线由BIA评估软件中的1：1整体分析模型进行校正(实线)。结合率及分解率分别为 7.3×105M-1s-1(标准偏差为3.0×103)及1.9×10-4s-1(标准偏差为8.0×10-6)。
图7显示于纳米狭缝中固定的抗小鼠IgG中，导入不同浓度的 Alexa Fluor-647鼠抗兔IgG抗体(migG-AF 647)标的的荧光强度变化，所述Alexa Fluor-647鼠抗兔IgG抗体浓度范围自0pM(无分析物的缓冲液)至100pM。
图8为生物功能性纳米狭缝的制造及芯片封装过程示意图。
图9为搭配压力驱动流的芯片组示意图。流体芯片颠倒地放置于铝制的垫片，其中，一块包含有四个容槽的特氟龙板设置于所述流体芯片之上。由特氟龙板所形成的压力输入应用于密封整个***，并通过O型环的协助以连接压力控制单元以及每个界面的特氟龙螺丝，以防止渗漏。
图10显示链亲和素-生物素结合的动力学常数。各种链亲和素浓度 (10、30、50及100nM)(×)的实验数据，与在不同的结合及解离速率常数下取得自有限元素计算模型的仿真曲线(—)同时绘示。表面探针密度和流速于各情况下保持相同。速率常数由最佳的预测结合曲线及实验结果，并依据决定系数加以判定。
图11显示应用于5nM的Alexa Fluor-647鼠抗兔IgG抗体 (migG-AF 647)的纳米狭缝生物传感器，其可允许再现性以进行多次检测。图11 显示了标准化荧光强度与时间的函数关系图，其中，图11 显示为使用同一仪器进行三重复的动力学分析实验结果(误差线：标准误差)。所述实验数据由金感测表面的同一区域(10×10像素)取得。传感器以再生溶液(10mM氨基乙酸HCl缓冲液)实施再生的步骤，并于下一循环的实验进行前，以缓冲液彻底地洗涤。相对标准偏差为 2.28％。
具体实施方式
本申请提供一种快速且经济有效的纳米流流道的生物传感器平台，以应用于感测生物分子的实时动力学量测。结合台式荧光显微镜 /检测***及微量样品的反转缓冲流技术，便能够在单一实验中评估结合动力学及解离动力学，而无须经过如传统微流体荧光分析中，不实际的缓冲液洗涤步骤。
于本申请中，利用有限元素法的模型以量化两个代表性的蛋白-配体结合对的动力学参数，包括：测链亲和素-生物素及老小鼠IgG/抗小鼠IgG。本公开和文献与表面等离子体共振效应测量的设备之间的萃取速率常数的良好的一致性表明，所述方法可以容易地适用于研究蛋白质之间的相互作用，其灵敏度可达1pM。
本申请相较于传统的ELISA及现有的技术，具有多重反应能力、仅需非常少量的反应试剂以及无须洗涤等优势。更佳地，在快速的分析时间(于30分钟内)之下，检测灵敏度甚至可达约1pM。此外，本申请实现了低样品量(10.5nL)的消耗，换言之，其可达10介摩尔(zeptomole)级的灵敏度并达成高捕捉率(无损失目标分子)。
本研究提供了改良的诊断工具及新颖的疾病治疗方式发展的重要讯息。于过去数十年来，亲和性生物传感器利用游离的靶分析物与固定化的受体之间的相互作用，进而成为扮演生物特异性相互作用中的主要解决方案。此方式揭露了多种结合事件的亲和性与动力学信息，特别是蛋白质-配体(protein-ligand)与核酸之间的结合。
参考图1A所示，于本实施例中，本发明提供一种感测装置1，其应用于检测包含有多个分析物分子，并用于液体样本的分析物及缓冲液。所述分析物特别指生物分子(例如：蛋白质、DNA等)。感测装置1包括基板11，基板11上设置有至少一感测分子固定组件12，用以固定供分析物进行反应的感测分子13设置。
其中，所述的基板11的材料包括硅、二氧化硅、玻璃、和/或塑料，且感测分子固定组件12以金(Gold Patch)、玻璃或塑料对基板11 进行表面处理而形成，然而，于实际应用时上述并非本发明限制性的。其中，感测分子固定组件12的数量依据实际的实验需求进行设置。此外，感测分子13依据目标分析物的种类而进行选用及设置，本发明于此不限。
基板11具有多个微米等级或纳米等级的槽道(图未示)，感测装置1另外具有盖部14，盖部14面向所述槽道并与基板11结合，其中所述盖部14与所述槽道形成至少一第一入口15、至少一第二入口16 及微流道C，而至少一感测分子固定组件12设置在与所述微流道C所对应的所述槽道上。其中，盖部14的材料包括聚二甲基硅氧烷 (polydimethylsiloxane,PDMS)、硬质聚二甲基硅氧烷 (hard-polydimethylsiloxane,h-PDMS)、聚倍半硅氧烷(polysilsesquioxane,PSQ)、塑料材料和/或涂布于玻璃上的塑料材料。关于第一入口15、第二入口16及感测分子固定组件12的数量皆非本发明限制性的，而本实施例以基板11具有第一入口15、第二入口 16及感测分子固定组件12为例说明。
同样请参考图1A所示，液体样本由流体发生器(图未示)驱动，自所述第一入口15进入微流道C，使得液体样本内的分析物与感测分子产生结合反应。液体样本经由自第一入口15往第二入口16延伸的第一方向D1流动。而缓冲液同样由所述流体发生器驱动，自第一入口 16进入微流道C。其中，缓冲液由自第二入口16往第一入口15延伸的第二方向D2流动。换言之，液体样本与缓冲液以相对于彼此完全相反的方向进行流动。亦即，对液体样本而言，缓冲液为反转流的形式。
于实际应用时，上述的流体发生器包括但不限为用于产生压力驱动流的加压泵(pressure pump)或毛细泵(capillarity pump)，或者是用于产生电渗流(electroosmoticflow)的电动泵(electrokinetic pump)。
参考图1A所示，微流道C于介于第一入口15及第二入口16之间的长度的范围介于100μm～5cm，而本实施例则为500μm；基板 11与盖部14之间的平均距离介于50nm～10μm，本实施例为450nm；而感测分子固定组件12于第一方向D1上的长度的范围介于1μm至整个流道的长度，本实施例则为50μm。
本发明进一步提供了一种应用感测装置1的感测***及感测方法。感测***包括感测装置1、连接感测装置1的第一入口15及第二入口 16的流体发生器、控制流体发生器产生流体并自第一入口15流动至第二入口，藉以驱使液体样本或缓冲液流入微流道C的流体控制单元、对所述微流道取得至少一影像的取像单元；以及根据所述影像产生感测结果的计算单元。关于上述感测***的技术内容与实施细节均已揭露于上，同时还可参考下述实验例，于此不再赘述。
本发明还提供一种感测方法，包括以下步骤：驱动液体样本由第一入口流入微流道，使得分析物与感测分子结合；驱动缓冲液由第二入口流入微流道，使得分析物与感测分子解离；以及根据结合结果与解离结果以产生感测图的感测结果。关于上述感测方法的技术内容与实施细节均已揭露于上，同时还可参考下述实验例，于此不再赘述。
请参考图1B所示，本申请所提供的装置能够产生完整的动力学感测图，其于单一实验中利用反转缓冲流技术进行单次注入所获得的结合相与解离相实验结果。此外，有限元素法模型应用多物理场耦合分析软件(COMSOL multiphysics software)，以预测纳米狭缝中的免疫反应的结合反应。最后，蛋白质-配体反应的开/关速率常数可被确定，而被提取的数值能够由文献及类似表面等离子体共振效应测量方式进行确认。
接下来将以实验例代表说明本发明感测目标分析物分子的细节。然而需注意的是，以下的说明是用来详述本发明以使本领域技术人员能够据以实现，但并非用以限定本发明的范围。
实验例
材料与试剂
生物素化三(乙二醇)十一硫醇(HS-(CH)n-OEG-生物素)购买自 NanoscienceInstruments(美国)。11-巯基-1-十一烷醇(MUD) (HS-(CH2)11-OH)、牛血清白蛋白(bovineserum albumin,BSA)则购买自ACROS Organics(法国)。反免疫球蛋白抗小鼠IgG及AlexaFluor 647共轭单株小鼠抗兔IgG购买自Jackson ImmuoResearch(英国)。 Alexa Fluor488共轭山羊抗兔抗体购买自Invitrogen,Inc。所有的蛋白质皆于磷酸盐缓冲生理盐水(10mM磷酸盐缓冲生理盐水、0.138M NaCl、0.0027M KCl，pH 7.4)中进行稀释，磷酸盐缓冲生理盐水购买自Sigma-Aldrich(法国)。而五种用于制备硬质聚二甲基硅氧烷的组成，乙烯聚二甲基硅氧烷共聚物(vinyl PDMS copolymer)、乙烯改性二氧化硅Q树脂(vinylmodified silica Q resin)、铂-二乙烯基四甲基二硅氧烷(platinum-divinyltetramethyldisiloxane)、氢化硅烷预聚物(hydrosilane prepolymer)及2,4,6,8-四甲基四乙烯基环四硅氧烷 (2,4,6,8-tetramethyl-tetravinylcyclotetrasiloxane)皆购买自abcr GmbH&Co.Kg(德国)及Sigma-Aldrich(法国)。所有其它化学品均为分析级的，无需进一步纯化即可使用。表面等离子体共振效应于生物分子相互作用分析***(BIACORE 3000，Biacore AB,Uppsala, Sweden)上执行，Au-SIA试剂盒则取得自BiacoreAB。取得自Diener electronic GmbH+Co.(德国)的等离子体设备则应用于表面活化。
纳米微流道芯片的设计及制造
请参考图8所示，其显示了生物功能性纳米狭缝的制造方式及芯片封装工艺。纳米微流体芯片应用CleWin4Layout Editor进行设计(Wieweb software，荷兰)并于铬掩模(chrome mask)上进行印刷。设计出来的芯片包括有多个宽50μm，深度450nm且平行设置的纳米微流道，所述这些纳米微流道之间以两个微流道连接，微流道的尺寸为宽400μm以及深度5μm。芯片于100mm的P型硅晶片上以标准光蚀刻法进行制造。其中，光蚀刻法应用于定义纳米流道及微米流道的宽度及深度。
首先，厚度为2.6μm的的正型ECI光组旋涂于以六甲基二硅氧烷(hexamethyldisilazane,HMDS)预先处理的硅晶片上，以UV曝光并显影，接着再以反应离子蚀刻法(reactive ion etching,RIE)以形成深度为450nm的纳米流道。类似的工艺通过于蚀刻晶片上排列微流道的光组图案，以在同一晶片上制造纳米狭缝和微结构，然后将晶片热氧化，以形成200nm的薄氧化物层来简化液体充填和芯片粘接。为了选择性地将蛋白受体固定于纳米流道的底部，一个5/100nm的铬/金膜于干净的蚀刻硅晶片上蒸发并掀离。最后，入口/出口孔由喷砂机 (sandblasting machine)从芯片的背面侧钻出，并将晶片切割成单个的硅芯片。
前表面固定方法及芯片组装
于本实验例中所述的前表面固定方法基于在金表面混合硫醇的自组装单层膜(self-assembled monolayer,SAM)。此方法藉由调整负载溶液的混合比例提供了长时间的稳定性、再现性以及良好的固定蛋白取向以及所需的表面探针密度。形成组织完整的单层膜需要较长的培养期间(12-48小时)。因此，于芯片封装前，开顶式固定方法(open-topimmobilization protocol)应用于引入一种生物素官能基团于具有图案的金垫上。简而言之，利用Piranha工艺技术清洁的芯片以比例为0.1∶ 9.9(摩尔，用于链亲和素-生物素结合模型的1％生物素化烷基硫醇) 的混合物隔夜培养，或是以比例为1∶9(摩尔，用于小鼠IgG/抗小鼠)的硫醇基生物素以及于无水乙醇中总浓度为0.5nM的11-巯基-1- 十一烷醇，并在氮气下密封。接着移除基材并于乙醇中彻底的洗涤，随后用去离子水以除去过量的硫醇化合物，并用氮气干燥。
关于芯片封装，一种薄型化的硬质聚二甲基硅氧烷于3000rpm的转速下(30秒)旋涂至以食人鱼洗液(piranha)清洗的玻璃板，并伴随于75℃下固化1小时。以硬质聚二甲基硅氧烷涂布的玻璃板通过暴露于氧等离子体以被激活(120s,35W,0.5mbar O2)，然后立即放置于生物素修饰的纳米狭缝中并与其接触，以获得经由硅氧烷键形成的共价键。芯片接着以75℃烘烤5分钟并以毛细作用将10μl的封闭缓冲液(blocking buffer solution)(1％牛血清白蛋白in 1×磷酸盐缓冲生理盐水+0.02％吐温20)注入芯片当中并放置3小时，以避免于二氧化硅及硬质区域上产生非特异性的蛋白结合。
图9为搭配压力驱动流的芯片组示意图。流体芯片颠倒地放置于铝制的垫片，其中，一块包含有四个容槽的特氟龙板设置于所述流体芯片之上。由特氟龙板所形成的压力输入应用于密封整个***，并通过O型环的协助以连接压力控制单元以及每个界面的特氟龙螺丝，以防止渗漏。
芯片最终被安装在流体支撑体上，而所述整体装置则与压力控制单元(MFCS-8CFluigent，法国)连接，以引导液体流动。一种坚固且结构紧致的支撑体应用于组装芯片，以提供链接至外部流体部件。
荧光实验结果及分析
纳米狭缝中的蛋白质结合动力学以倒立显微镜(Olympus IX 70) 配合配备有白光源(Lumencore SOLA light美国)的ANDOR 光谱仪中的iXonEM+885EMCCD(1004×1002有效像素,8×8μm2像素尺寸)拍摄图像。荧光影像通过LCPlanF1 20×/0.40Ph1objective (Olympus Optical，日本)取得。曝光时间为1秒，并利用由照相机触发的外部快门(Lamnda SC,Shutter Instrument)，以避免光漂白及使所有的量测结果在室温下进行。
所述制造设备具有多个相同且平行设置的纳米流道。因此，仅有一个纳米流道被认定为本***的代表性免疫反应。图2显示用于纳米流道内的异质免疫反应(heterogeneous immunoreaction)的有限元素仿真的二维模型，所述纳米流流道的长度(L)为500μm，而流道高度 (H)为450nm，其中于流道的底部包含了长度为50μm的感测区域。入口及出口被定义为纳米流道于几何上的头端开口及尾端开口，由于对纳米流道的流速并不造成影响，因此可排除微米流道内的大量传输。分析物由左侧的入口以流速(v)往右侧的出口流动。分析物能够依据扩散系数(D)进行扩散，并且为固定在传感器的探针以开/关速率常数(ka,kd)捕捉。对于模拟参数范围，整体分析物浓度(C0)为0.46-100 nM，而流动速度(v)则为155-200μm/s，其由粒子分析所得，并同时搭配理论计算应用。有效的表面探针密度(bm)取得自类似表面等离子体共振效应的技术量测，其范围介于1×10-9至4×10-8mol/m2。链亲和素分子(53kDa)的扩散系数(D)为7.4×10-11m2/s，而小鼠IgG (150kDa)的扩散系数则为1×10-11m2/s。链亲和素-生物素结合作用的结合常数(ka)及解离常数(kd)的范围，分别为1.5×105至1.4×106M-1s-1以及1.0×10-7至8.8×10-6s-1。而小鼠IgG/抗小鼠IgG结合反应的结合常数(ka)及解离常数(kd)的范围，分别为6.0×105至9.0×105M-1s-1以及5.0×10-4至7.0×10-4s-1。上述的动力学参数皆参考文献的数值。
设备制造和流体处理
所述设备包括多个微流流道，所述这些微流通道由平行且相同的纳米流道连接，所述这些纳米流道由硅晶片以简单且直接的方法制成，所述这些方法包括传统的光刻和反应离子蚀刻。相较于利用表面等离子体共振量测，本实验选用金表面作为生物受体探针固定的表面。其中，该些受体探针用于选择目标分析物分子。由于聚二甲基硅氧烷弹性体特殊的性质，因此时常用于制造微流体装置。然而，聚二甲基硅氧烷较不适合应用于制造具有高长宽比的纳米微流道装置。硬质聚二甲基硅氧烷为一替代材料，并具有高于标准聚二甲基硅氧烷4.5倍的杨氏模量(Young’s module)，由于硬质聚二甲基硅氧烷硬度的特性，能够减少压力对其所造的变形，从而导致可成功地应用于芯片封装，特别是纳米级的装置。因此，硬质聚二甲基硅氧烷可取代标准聚二甲基硅氧烷而应用于涂布在玻璃板，以避免本实验例的密封装置内的流道崩坏。
本实验应用由Fluigent***产生的正压，以引入液体或生物样品到纳米狭缝。由于精确的流量控制及轻便的流体处理方式等对于免疫分析不可或缺的特征，因此选用具有上述特征的压力驱动流法。此外，相较于电动力学，其具有简单操作以及对表面污染物、离子强度以及 pH值较不敏感的优势。基本上，纳米流道包括两个用于引入液体并与外部流体装置(管路及压力产生器)连接的微流道，而平行的直纳米流道被用来进行蛋白质相互作用的结合动力学。其中，微流道的末端具有两个入口及两个出口。
请参考图3所示，于动力学实验中，第一入口应用于输入液体样本(即本申请的目标分析溶液)，缓冲液则由第二入口输入。基于此结构，压力可分别同时施加于两个入口。因此，完整的动力学传感图(包括结合曲线与解离曲线)可通过反转缓冲流的方式，以从分析物切换到缓冲溶液，而无须如传统的微流体装置，需要除去流体设置。
模型I：链亲和素-生物素结合模型
关于开顶式表面改性与非对称结合技术组合的生物功能性及兼容性，其以链亲和素-生物素反应进行研究，其中，链亲和素-生物素反应基于纳米装置内的压力驱动流。为了进行此专一性的生物分子反应， 100nM的Alexa Fluor 488共轭链亲和素(ST-AF 488)被输送到10％生物素化巯基修饰流道，所述流道装载有封闭缓冲液(10mM PBS缓冲液+0.02％吐温20中加入1％牛血清白蛋白,pH 4)，以及以稳定的流速(155μm/s)流动15分钟。当以缓冲液(10mM磷酸盐缓冲生理盐水+0.05％吐温20,pH 7.4)浸润以除去流道内多余的链亲和素分子以及任何于表面上的非专一性吸附之后，纪录荧光影像。包含有预先固定的生物素分子的感测垫上的荧光强度明显的增加，而流道壁上的邻近区域则维持较低的荧光强度。控制组实验(无生物素)实施于羟基硫醇(spacer)改性的传感器表面。于洗涤步骤后并无观察到显著的非特异性物理吸附(实验结果未示)，进而显示了预固定生物素和流动的链亲和素标的分子之间的特异性辨识。上述结果证实了，预改性的探针分子在芯片封装程序后保留其对于特定标的物的生物反应性，进而提供具有高信噪比和减少的非特异性吸附效果的感测能力。
关于固定的生物素分子以及流动的荧光标定链亲和素分子之间的作用，其于生物素巯基修饰改性的纳米流道中进行研究。于感测区域上的表面固定化结构示意于图4A。由于链亲和素-生物素相互作用原本即具有极高的亲和性(Kd＝10-13M)，1％(摩尔)生物素选用于修饰金表面，以尽量减少传输分析以及空间位阻的限制问题，特别是在高探针密度时，并且避免使用高喷射流量时伴随提升的试剂消耗量。关于两个关键的无因次数(dimensionless numbers)，匹列数及达姆科勒数的评估，在高性能的生物感测装置设计中扮演了相当重要的角色。其中，由于结合常数可通过目标分析物的质量传递而直接影响，因此，由免疫反应所得的动力学信息必须经过确认，以确保其取得自本申请的纳米流体装置内所进行的结合事件。本实验所应用的匹列数(Pe) 与施加的流速和反应流道高度相关，其计算至整数(Pe＝UmH/D,D为生物分子的扩散系数)。亦即，分析物扩散通过整个流道所需的时间，等同于分析物通过对流以经由传感器传送的时间。理论上，于流道中所有的分析物分子应当都有机会与传感器表面的探针进行反应，当Pe< 0.5时，***会达到收集的极限。上述的结果阐明了高感知能力，并伴随着本申请的纳米狭缝***的分析物结合效率的提升及较短的反应时间的特性。依据达姆科勒数，动力学反应会落入反应限制(reaction -limited)机制，而非限制扩散机制，其中，所述达姆科勒数利用类似表面等离子体共振效应量测方式(bm＝4×10-8mol/m2)所获得一个有效的探针密度进行量测。
动力学测量是在传感器表面的生物素修饰后进行。浓度介于10nM 至100nM的ST-AF 488溶液以155μm/s的稳定速度注入，并且可与固定于传感器表面的生物素结合。荧光图像实时记录，以监控特定结合事件的结合过程。由于超高结合亲和力以及链亲合速-生物素辨识***的超长解离时间，四种不同的装置应用于量测于各浓度下链亲和素结合常数。
荧光强度经过标准化，并配合取得自有限元素模型的仿真数据进行优化的处理。在各种浓度下依据仿真模型优化的链亲和素-生物素结合，其相对的传感器反应示意于图5A。可以观察到的是，于低浓度时 (10-50nM)的链亲和素结合的实验结果与仿真数据的适合度良好，其 R-square值于0.99的范围内。然而，高浓度的链亲和素(100nM)则显示了一个较差的适合度(R-square＝0.95)。上述的结果可能取决于多种在高浓度时明显产生的因素，包括空间位阻(steric hindrance)、表面的异质性、非特异性结合或者于1∶1作用模型中产生的偏差等。当应用计算模型判定结合亲和性，各浓度的结合速率常数及解离速率常数由最佳的预测结合曲线及实验结果之中取得(如图10所示)。于所有的浓度中所观察到的最佳平均的结合速率常数(ka)为7.1×105M-1s-1，而平均解离速率常数(kd)为0.80×10-6s-1。此外，较低的解离速率也应用于在仿真模型中，然感测反应并无改变。因此.链亲和素-生物素结合作用的解离常数(KD)可估算为KD≤1.2×10-12M。
范围介于155-465μm/s之间的多种流速(Pe数介于0.94-2.8)于结合动力学上的效果亦同时进行测量，然而，传感器的反应并没有显示任何显著的差异，亦即，如预期中的并不大量传输限制存在。因此，结合常数亦可通过简单的「均匀混合」模型进行判定，其假设一个简单的生物分子一级反应。分析物结合至传感器表面的结合速率常数ka以及解离速率常数kd如下方所示：
其中C为本体溶液中的分析物浓度。Cb为表面上结合物的浓度。 Cmax为探针密度或表面结合位置，此意味着Cb最大值。此模型被定义为「均匀混合」模型，且检测动力学为速率限制的反应，而传感器表面上的分析物浓度是恒定且均匀的。时间常数由下方算式而得Kapp＝ kaC+kd。图5B显示时间常数作为目标分析物浓度的函数的关系图。明显可见，时间常数与分析物浓度存在正相关。导出的0.0003nM-1s-1斜率会伴随产生3.0×105M-1s-1的结合速率常数ka。而导出的ka值与本申请中取得自有限元素分析模型的数值，以及文献中基于微流体平台所报道的范围具有很好的一致性。进而证实了本申请的动力学计算模型应用于预测生物特异性结合反应的有效性。
模型II：小鼠IgG/抗小鼠IgG结合模型
为了进一步验证本申请的动力学模型，小鼠免疫球蛋白G(IgG) 以及抗小鼠IgG被应用于作为另一对蛋白质-蛋白质对。图4B显示在动力学研究中使用的模型的表面结构。由于链亲和素-生物素之间的桥接对于温度和pH值的稳固性，其广泛地涵盖于蛋白质及DNA芯片的表面固定策略。于本实验例中，10％生物素巯基修饰表面应用于形成链亲和素单分子层的完整表面覆盖，以最大限度地暴露生物素结合位点，进而用于其它位置的额外生物素受体。一般而言，链亲和素分子于组装单分子捕捉探针中扮演了基石的角色，进而允许生物素探针分子与其它生物分子，例如免疫球蛋白IgG或人血清白蛋白(HSA)在最少的非特异性结合下，产生最佳的锚固效果。这种优化的表面化学对于生物传感器的性能而言相当重要。
于表面进行生物素标记后，链亲和素以155μm/s的固定流速，输入15份总共100nM的ST-AF 488溶液直至饱和，以功能化至生物素标记的自组装单层膜，接着进行缓冲液洗涤步骤。接着，传感器接受生物素化小鼠抗兔IgG(于磷酸盐缓冲生理盐水中，共100nM)，放置15 分钟后再以缓冲溶液润洗5分钟。动力学量测藉由连续且流速固定(200 μm/s)的方式，输入不同浓度的Alexa Fluor 647共轭小鼠抗兔IgG (mIgG-AF 647)目标分析物(于磷酸盐缓冲生理盐水中稀释)至抗鼠改性感测芯片，其浓度范围介于0.46至15nM。藉由以反转缓冲流的方式，亦即与分析物输入方向相反的方向，注入纯缓冲液，以将结合小鼠IgG自表面受体移除，以产生解离的效果。通过荧光影像的实时检测以监控纳米狭缝内的结合及解离过程。于本实验例中，在所有的目标浓度中，结合时间皆维持固定，以利藉由BIAevaluation软件封包进行整体分析。传感器表面接着藉由注入pH 2.0的10mM甘氨酸 -HCl，并彻底的经过浸润后完成再生步骤，以应用于下一个测量的循环中。此外，无关的目标分析物(AlexaFluor-600山羊抗兔IgG)注入至固定有抗鼠抗体的纳米狭缝中，以验证非特异性作用，然而，并无观察到显著增加的荧光强度。
上述数据经标准化至相对的荧光强度并适配至三种不同的模型： (1)有限元素法、(2)均匀混合模式以及(3)由BIA评估软件进行的整体-局部修正(图6B)。根据有限元素计算模型，结合速率常数从最佳的预测动力学曲线，至藉由决定系数而得的实验数据而进行判定。可观察到的是，本申请的仿真动力学曲线可于各实验结合曲线中，优异且精确地诠释纳米狭缝中的免疫反应，其R-square值于0.99的范围内。最佳平均的结合速率常数(ka)为8.0×105M-1s-1，而平均解离速率常数(kd)为6.2×10-4s-1。以得到平衡解离常数(KD)为0.77nM。另外，结合动力学的流速效果亦同时被检测，然而传感器反应并无显示任何显著的改变，亦即并无大量传输的限制。据此，实验结果以非线性最小平方法适配于「均匀混合」分析模型，而时间常数(Kapp)作为目标分析物浓度的函数的关系图，使其与R2数值0.9959的结果相符。结合于受体表面的解析附效果以一阶指数衰减进行量测(first-orderexponential decay)。以分别得到6.0×105M-1s-1及5.5×10-4s-1的结合速率常数及解离速率常数。最后，动力学实验结果以BIA评估软件进行整体-局部分析。相较于本申请的模拟，最佳的结果存在于Langmuir 1:1 结合模型内。结合速率常数与解离速率常数的平均值分别为12×105 M-1s-1(标准偏差为2.0×104)及5.0×10-4s-1(标准偏差为1.8×10-5)，验证了本申请藉由有限元素模型所得的动力学数据的良好定量描述。
为了进一步评估本申请的平台，小鼠IgG/抗小鼠IgG的类实时动力学量测应用表面等离子体共振法进行。包含有各种浓度下(范围自1.6至26nM)的结合动力学信息示意于图6D中。整体分析应用于识别结合模型，并以BIAevaluation软件封包量化动力学参数。整个实验数据中最佳的结果来自于1：1Langmuir结合模型而无大量传输的影响，并估算出结合速率常数为7.3×105M-1s-1(标准偏差为3.0×103)，而解离速率常数则为1.9×10-4s-1(标准偏差为8.0×10-6)。另外，于不同的固定表面探针密度条件下进行重复的动力学量测，以确保从结合数据所取得的动力学参数的准确度。经估算的结合速率常数仍然一致。总而言之，本实施例的纳米狭缝生物传感器平台可获得动力学常数，所述这些动力学常数与表面等离子体共振技术具有一致性，并且落入文献数值的范围内(如表1所示)。从而延长本申请模型的有效性，以进一步进行精确量化生物分子相互作用的结合动力学。
表1.链亲和素-生物素结合以及IgG/抗IgG结合的结合速率常数 (ka)，与本申请的生物功能性纳米流道平台、表面等离子体共振以及文献数值的比较。
表1
检测极限判定
为了证实本申请的装置不仅可应用于检测蛋白-受体作用的结合动力学，亦可应用于作为高灵敏度及快速的芯片免疫传感器。而检测极限(limit of detection,LOD)同样为需验证的重要特性。于本实验例中，检测极限通过引入不同浓度的mIgG-AF 647目标分析物溶液至以抗小鼠IgG抗体修饰的纳米狭缝之中，并记录荧光强度。荧光强度随着目标分析物的引入而产生与时间函数的变化，其绘制于图7。当注入的为无分析物的缓冲溶液时，荧光强度并无任何变化，而注入的为1pM分析物30分钟后，荧光强度会显著地增加。以10.5nL的样品体积为例，摩尔检测极限为10介摩尔。且明显地，将添加的分析物浓度增加至 10pM时，本申请的传感器可以很容易地在5分钟内检测出结合反应信号。由本申请的***搭配小鼠IgG感测所得的检测极限明显地优于现有的微流道免疫感测方式。此外，此种芯片型免疫感测显示了良好的再现性，并且于分析物浓度为5nM时具有2.28％的标准偏差(如图11 所示)。再者，于本申请中，利用链亲和素-生物素链结小鼠IgG进行检测所需的完整免疫反应时间(包括注入、固定以及检测步骤)大约为40分钟，而传统的ELISA则需数小时至数天方可完成。因此，本申请应用于蛋白质检测的方法亦同时证实为快速且灵敏的免疫感测平台，且其试剂的消耗量较低，说明其在临床诊断中的巨大潜力。
本发明提供一种感测装置及应用其的感测***及感测方法，其实际应用为一种生物功能性纳米流道狭缝，并搭配传统的荧光显微镜技术使用，以提供一种应用于动力学研究中，简单、低成本但仍有效的生物感测平台。感测装置具有一个深度减少至亚微米(sub-micrometer) 等级的流道，并具有以下的优势：(1)大幅减少的扩散长度，使得在受限制的区域仍可以达成优化的目标捕捉效率，因此，输入至感测装置内的所有分析物皆可进行分析，且解离反应可简单地在结合反应完成后，于同一流道中通过反转流的方式进行，而无须经清洗后另外添加新的缓冲液进入流道中，从而可简化操作流程并节省操作时间；(2) 减量的样本需求，可利用传统的荧光显微镜进行感测分子固定组件(感测区)的分析，从而无须使用复杂或昂贵的实验仪器，例如表面等离子体共振效应、全内反射荧光显微镜或石英晶体微天平等技术；(3) 信噪比(signal to noise ratio)与流道高度成反比。
此外，本发明所提供的感测装置及应用其的感测***及感测方法，使大采样面积覆盖于一定数目的像素数之上，相较于传统不具有空间解析率的检测平台，本申请的检测装置、检测***及检测方法可减少统计误差(以具有更高的精确度)。
本申请藉由提供以下的功效，解决了已知技术的问题：(1)在提供更高的检测灵敏度以及简单的实验设置的前提下，藉由反转流操作减少动力学分析时间；(2)在微量的样品分析中进行有效率的分析物捕捉；(3)具有时空解析率的生物反应/结合动力学分析，以降低统计上的误差。
以上所述仅为举例性，而非为限制性的。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改或变更，均应包含于后附的权利要求中。

Claims (15)

1.一种供微感测的装置，用于液体样本的分析物及缓冲液，包括：
一可被观察微流道，包括一第一端以及相对于所述第一端的一第二端；
至少一第一入口，与所述第一端连通，供输入所述液体样本经由所述第一端至所述可被观察微流道；
至少一第二入口，与所述第二端连通，供输入所述缓冲液以相对于所述液体样本的一相反方向经由所述第二端至所述可被观察微流道；以及
至少一感测分子固定组件，用以固定供所述分析物及所述缓冲液的感测分子于所述可被观察微流道内；
其中所述感测分子能够对所述液体样本及所述缓冲液分别产生结合反应及反向的解离反应，
当所述液体样本流入所述微流道后，所述感测分子与所述液体样本的所述分析物产生所述结合反应，
然后，当所述缓冲液反向地流入所述微流道后，所述感测分子与所述分析物产生所述解 离反应。
2.如权利要求1所述的装置，其中所述流道具有足够长度使得所述分析物与所述感测分子的所述结合反应可被观察到。
3.如权利要求1所述的装置，其中所述分析物与所述感测分子的所述结合反应呈现荧光。
4.如权利要求1所述的装置，还包括：
基板，具有对应于所述第一入口、所述第二入口及所述微流道的多个槽道；以及
盖部，面向所述槽道并与所述基板结合，其中所述盖部与所述槽道形成所述第一入口、所述第二入口及所述微流道，
其中所述感测分子固定组件设置在与所述微流道所对应的所述槽道上。
5.如权利要求4所述的装置，其中所述基板的材料包括硅、二氧化硅、玻璃、和/或塑料，所述盖部的材料包括聚二甲基硅氧烷、硬质聚二甲基硅氧烷、聚倍半硅氧烷、塑料材料和/或涂布于玻璃上的塑料材料，所述感测分子固定组件以金、玻璃或塑料对所述基板进行表面处理而形成。
6.如权利要求4所述的装置，所述液体样本沿着自所述第一入口往所述第二入口延伸的第一方向流动，所述微流道于介于所述第一入口及所述第二入口之间的长度的范围介于100μm～5cm，所述基板与所述盖部之间的平均距离介于50nm～10μm，所述感测分子固定组件于所述第一方向上的长度的范围介于1μm至整个流道的长度。
7.如权利要求1所述的装置，还包括：
容槽，与所述第二入口连通，供存放所述缓冲液。
8.如权利要求1所述的装置，其中所述微流道包括多个纳米狭缝。
9.一种感测***，包括：
如权利要求1-8的任一项所述的感测装置；
流体发生器，连接所述感测装置的所述第一入口及所述第二入口；
流体控制单元，控制所述流体发生器产生流体并自所述第一入口流动至所述第二入口，藉以驱使所述液体样本或所述缓冲液流入所述微流道；
取像单元，对所述微流道取得至少一影像；以及
计算单元，根据所述影像产生感测结果。
10.如权利要求9所述的***，其中所述流体发生器包括产生压力驱动流的加压泵或毛细泵，或者是用于产生电渗流的电动泵。
11.如权利要求9所述的***，其中所述取像单元从所述微流道截取针对结合反应的第一旷时影像，并且从所述微流道截取针对解离反应的第二旷时影像，所述计算单元使用结合动力学及解离动力学根据所述第一旷时影像及所述第二旷时影像产生所述感测结果。
12.一种感测方法，用于如权利要求1-8的任一项所述的感测装置，包括以下步骤：
驱动所述液体样本由所述第一入口流入所述微流道，使得所述分析物与所述感测分子结合；
驱动所述缓冲液由所述第二入口流入所述微流道，使得所述分析物与所述感测分子解离；以及
根据所述结合结果与所述解离结果以产生感测图的感测结果。
13.如权利要求12所述的感测方法，其中所述产生步骤包括：
根据所述结合结果取得结合动力学信息；
根据所述解离结果取得解离动力学信息；以及
根据所述结合动力学信息以及所述解离动力学信息结果以产生所述感测结果。
14.如权利要求12所述的感测方法，其中所述产生步骤包括：
从所述结合结果分析荧光强度以取得结合动力学信息；
从所述解离结果分析另一荧光强度以取得解离动力学信息；以及
根据所述结合动力学信息以及所述解离动力学信息结果以产生所述感测结果。
15.如权利要求12所述的感测方法，还包括：
驱动再生溶液至所述流道；
以所述再生溶液浸润所述流道；以及
自所述流道移除所述再生溶液。
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