CN105177154A - 贝类中诺如病毒检测质控试剂盒和非诊断性检测方法 - Google Patents

贝类中诺如病毒检测质控试剂盒和非诊断性检测方法 Download PDF

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CN105177154A CN201510651084.XA CN201510651084A CN105177154A CN 105177154 A CN105177154 A CN 105177154A CN 201510651084 A CN201510651084 A CN 201510651084A CN 105177154 A CN105177154 A CN 105177154A
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孙涛
张瑾
赵玉然
梁成珠
王宫璞
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Abstract

本发明公开了一种贝类中诺如病毒检测质控试剂盒和非诊断性检测方法，试剂盒包括：NV？GⅠ+GⅡ分型2×RT-PCR？mix、MS2？2×RT-PCR？mix、无RNase水、NV？GⅠ+GⅡ阳性对照、大肠杆菌噬菌体MS2（2.5×1010pfu/mL）各一管。非诊断性检测方法包括以下步骤：①贝类中诺如病毒的富集；②病毒RNA提取；③大肠杆菌噬菌体MS2标准曲线的建立；④诺如病毒、大肠杆菌噬菌体MS2检测；⑤病毒RNA回收率确定；⑥结果判定。本发明的贝类中诺如病毒检测质控试剂盒和非诊断性检测方法，从样品前处理、病毒浓缩、质量控制、检测和结果判定等关键步骤对病毒检测的整个过程进行了有效的质量保证，增强了检测过程的稳定性、准确性和可控制性，填补了该领域的检测技术空白。

Description

贝类中诺如病毒检测质控试剂盒和非诊断性检测方法
技术领域：
本发明涉及一种贝类中诺如病毒检测质控试剂盒和非诊断性非诊断性检测方法，属于食品安全、环境监测和食源性病毒检测的技术领域。
背景技术：
诺如病毒是杯状病毒科呈二十面体对称球形单股正链RNA病毒，又称为诺罗病毒、诺沃克病毒或脓融病毒，是一种引起非细菌性急性胃肠炎的主要病毒，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播。诺如病毒基因组全长约7.7kb，包含3个开放阅读框(ORFs)，ORF1编码非结构蛋白，包括RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRp)；ORF2和ORF3分别编码主要(VP1)和次要(VP2)衣壳蛋白；根据VP1序列的同源性，诺如病毒可分为GI～GV五个基因群(Genogroup)，其中引起人类感染的主要是GⅠ和GⅡ群
由于该病毒多以食物尤其是滤食性双壳贝类如牡蛎等水产品作为传播载体，加之人们生食贝类的习惯由来已久，由贝类中的诺如病毒引起的食品安全性问题越来越受到世界各国的重视。开展贝类中诺如病毒的快速检测及灭活研究，对保障我国人民食品安全，提高出口食品质量以及创造经济价值都至关重要。在我国及世界上大多数国家，对于食品类产品中诺如病毒检测缺乏标准质量控制体系，原因主要在于缺乏有效，简单、快速、可靠的技术用于浓缩和检测这些病原。实时荧光RT-PCR等分子检测方法由于其高度灵敏、特异的特点，是目前用于检测样本中食源性病毒的最有效方法，
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是提供一种贝类中诺如病毒检测质控试剂盒和非诊断性非诊断性检测方法，能够监控整个检测过程并保证检测结果的有效性。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供的贝类中诺如病毒检测质控试剂盒包括NVGⅠ+GⅡ分型2×RT-PCRmix、MS22×RT-PCRmix、无RNase水、NVGⅠ+GⅡ阳性对照、大肠杆菌噬菌体MS2(2.5×1010pfu/mL)各一管。
NVGⅠ+GⅡ分型2×RT-PCRmix、MS22×RT-PCRmix中涉及的检测引物和探针如下：
(1)诺如病毒检测引物和探针
诺如病毒GⅠ：
正向引物NVG1-F：5’-CGYTGGATGCGNTTYCAT-3’
反向引物NVG1-R：5’-CCTTAGACGCCATCATCATTYAC-3’
探针NVG1-P：5’-Cy5-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-BHQ-3’
诺如病毒GⅡ：
正向引物NVG2-F：5’-ATGTTCYGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’
反向引物NVG2-R：5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’
探针NVG2-P：5’-FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-BHQ-3’
(2)大肠杆菌噬菌体MS2检测引物和探针
MS2-TM3-F：5'-GGCTGCTCGCGGATACCC-3
MS2-TM3-R：5'-TGAGGGAATGTGGGAACCG-3
MS2-TM2JOE：5'-JOE-ACCTCGGGTTTCCGTCTTGCTCGT-NFQ-3'
除了引物，NVGⅠ+GⅡ分型2×RT‐PCRmix、大肠杆菌噬菌体MS22×RT‐PCRmix中其他的试剂，例如酶、dNTP等均为现有的公知试剂。
本发明还提供一种利用本发明的试剂盒来检测贝类中诺如病毒的方法，包括以下步骤：
①贝类中诺如病毒的富集
a、贝类样品须是活的或者冷冻未破坏，泥土等必须去掉，不能重新浸泡在水里。冰上操作，用镊子、手术刀等打开贝类外壳，分离消化腺(digestiveglands)，取10个贝(不足10个全部取样)的样品，用无菌剪刀将内脏团剪碎混合；取混合样2g±0.2g到50mL离心管(或其他无菌离心管)中作为提取RNA的样品，其余-80℃留存。
b、分别加1mL的蛋白酶K工作液和100μL过程控制物质大肠杆菌噬菌体MS2，漩涡混匀。
c、37℃摇床孵育1h，320r/min；60℃水浴15min。
d、4℃，3000×g离心5min，取上清，并记录上清液体积为V1，分装500μL提取RNA，其余上清液-80℃保存留样。
②病毒RNA提取
③大肠杆菌噬菌体MS2标准曲线的建立
取制备好的大肠杆菌噬菌体MS2质控样品，稀释至2.5×1010pfu/mL，取100μL进行提取病毒RNA，最终稀释于100μL无RNA酶H2O中；取20μL稀释于180μL无RNA酶H2O，梯度稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍，则病毒浓度分别代表2.5×109、2.5×108、2.5×107、2.5×106、2.5×105、2.5×104pfu/mL，分别进行荧光定量RT-PCR反应，应用Ct值和噬菌体浓度建立回归标准曲线。
④诺如病毒、大肠杆菌噬菌体MS2检测
诺如病毒、大肠杆菌噬菌体MS2两种目标分别检测，每个检测目标反应体系包括：2×RT-PCRmix12.5μL、样品5μL、水补齐至25μL，每个样品做原倍提取液和10×稀释提取液，同时设置阳性对照和阴性对照。
⑤病毒RNA回收率确定
根据MS2荧光定量RT‐PCR反应获得的Ct值和标准曲线回归方程，计算出MS2浓度，除以加样时的病毒浓度，乘以100％即为回收率，通过回收除以0.5，并乘以总检测匀浆体积，来计算提取效率
⑥结果判定
检测结果判定必须在阳性对照和阴性对照成立的情况下做如下判定：
根据MS2的回收效率判定结果的有效性；若病毒RNA回收率大于或等于1％测试有效，根据检测情况判定甲型肝炎病毒和诺如病毒结果；若病毒RNA回收率小于1％，则需要重新进行检测。
本发明所述的大肠杆菌噬菌体MS2及其大肠杆菌噬菌体MS2质控样品依据发明专利号是2015102273402，发明名称是《大肠杆菌噬菌体MS2标准样品及其制备方法》的公开内容制备。
本发明的有益效果：
本发明设计了大肠杆菌噬菌体MS2与诺如病毒GⅠ和GⅡ的RT-PCR检测引物。
本发明利用大肠杆菌噬菌体MS2与诺如病毒在形态、大小、对环境的耐受力与病毒粒子相似以及对人体无危害等特性，构建了贝类中诺如病毒检测质控试剂盒和非诊断性非诊断性检测方法，即通过特定浓度的大肠杆菌噬菌体MS2监控整个处理和检测过程，并提供标准的样品处理浓缩方法和实时荧光RT-PCR方法，从样品中病毒浓缩、病毒RNA提取、回收效率和结果判定等步骤进行全过程的质量控制，使检测结果更准确、更有效、更稳定，准确监控病毒颗粒裂解效率和核酸提取等整个检测过程的质量控制标准体系，对贝类加工企业产品和食源性病毒的监测和质量控制具有重要意义，弥补了现行检测技术的不足。
附图或附表说明：
图1为本发明实施例1中大肠杆菌噬菌体MS2的标准曲线，图中，横坐标为大肠杆菌噬菌体MS2的浓度(pfu/mL)，纵坐标为实时荧光RT-PCRCt值。
图2为本发明实施例1中大肠杆菌噬菌体MS2的标准曲线，图中，横坐标为实时荧光RT-PCRCt值，纵坐标为实时荧光RT-PCR荧光强度。
图3为本发明实施例2中贝类样品添加大肠杆菌噬菌体MS2的回收效率测定结果，图中，横坐标为实时荧光RT-PCRCt值，纵坐标为实时荧光RT-PCR荧光强度。
图4为本发明实施例3中贝类样品诺如病毒GⅠ的检测结果；图中，横坐标为实时荧光RT-PCRCt值，纵坐标为实时荧光RT-PCR荧光强度。
图5为本发明实施例3中贝类样品诺如病毒GⅡ的检测结果；图中，横坐标为实时荧光RT-PCRCt值，纵坐标为实时荧光RT-PCR荧光强度。
具体实施方式：
下面通过具体实施例并结合附图或附表进一步阐述本发明。
实施例1：大肠杆菌噬菌体MS2标准曲线的建立
1、取试剂盒中的大肠杆菌噬菌体MS2质控样品(2.5×1010pfu/mL)，取100μL进行提取病毒RNA，最终稀释于100μL无RNA酶H2O中；取20μLRNA提取液稀释于180μL无RNA酶H2O，梯度稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍，则病毒浓度分别代表2.5×109、2.5×108、2.5×107、2.5×106、2.5×105、2.5×104pfu/mL，分别进行荧光定量RT-PCR反应。
2、对Ct值和噬菌体浓度建立回归标准曲线。仪器根据赋值和Ct值自动生成标准曲线(见图1和2)：y＝58.716-3.352lnx(y为Ct值，x为大肠杆菌噬菌体MS2浓度(pfu/mL))，R2＝0.982，扩增效率为98.74％。
实施例2：贝类样品添加大肠杆菌噬菌体MS2的回收效率测定
1、材料和方法
(1)菌株和毒株
大肠杆菌噬菌体MS2标准样品：来源于ATCC，实验室大量制备。
(2)试剂
PBS缓冲液(pH7.0)。
蛋白酶K工作溶液(蛋白酶K(30U/mg)，20±0.1mg；水，200±2mL；将蛋白酶K溶解于水中，混匀；于‐20℃储存常用的工作体积，保存期6个月；一旦解冻，储存于4℃，保质期1周)。
病毒RNA提取试剂盒：QIAGENRNeasyminiKit(CatNo74106)。
RT‐PCR试剂盒：THERNACOMPANYAMBIONAgPath‐IDTMOne‐stepRT‐PCRKit(P/N：AM1005)。
(3)实验仪器和材料
荧光定量PCR仪：ABI7500；
离心管：50mL、2mL、1.5mL，WHATSON公司；
DK‐8D型电热恒温水槽：上海森信实验仪器有限公司；
ZD‐85恒温振荡器：国华；
赤贝样品：青岛市团岛水产市场购买。
(4)方法
①贝类中诺如病毒的富集
a、贝类样品须是活的或者冷冻未破坏，泥土等必须去掉，不能重新浸泡在水里。冰上操作，用镊子、手术刀等打开贝类外壳，分离消化腺(digestiveglands)，取10个贝(不足10个全部取样)的样品，用无菌剪刀将内脏团剪碎混合；取混合样2g±0.2g到50mL离心管(或其他无菌离心管)中作为提取RNA的样品，其余-80℃留存。
b、分别加1mL的蛋白酶K工作液和100μL过程控制物质大肠杆菌噬菌体MS2，漩涡混匀。
c、37℃摇床孵育1h，320r/min；60℃水浴15min。
d、4℃，3000×g离心5min，取上清，并记录上清液体积为V1，分装500μL提取RNA，其余上清液-80℃保存留样。
②病毒RNA提取
③大肠杆菌噬菌体MS2标准曲线的建立
取制备好的大肠杆菌噬菌体MS2质控样品，稀释至2.5×1010pfu/mL，取100μL进行提取病毒RNA，最终稀释于100μL无RNA酶H2O中；取20μL稀释于180μL无RNA酶H2O，梯度稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍，则病毒浓度分别代表2.5×109、2.5×108、2.5×107、2.5×106、2.5×105、2.5×104pfu/mL，分别进行荧光定量RT-PCR反应，应用Ct值和噬菌体浓度建立回归标准曲线。
④诺如病毒、大肠杆菌噬菌体MS2检测
诺如病毒、大肠杆菌噬菌体MS2两种目标分别检测，每个检测目标反应体系包括：2×RT-PCRmix12.5μL、样品5μL、水补齐至25μL，每个样品做原倍提取液和10×稀释提取液，同时设置阳性对照和阴性对照。
⑤病毒RNA回收率确定
根据MS2荧光定量RT‐PCR反应获得的Ct值和标准曲线回归方程，计算出MS2浓度，除以加样时的病毒浓度，乘以100％即为回收率，通过回收除以0.5，并乘以总检测匀浆体积，来计算提取效率。
⑥结果判定
检测结果判定必须在阳性对照和阴性对照成立的情况下做如下判定：
根据MS2的回收效率判定结果的有效性；若病毒RNA回收率大于或等于1％测试有效，根据检测情况判定甲型肝炎病毒和诺如病毒结果；若病毒RNA回收率小于1％，则需要重新进行检测。
2、大肠杆菌噬菌体MS2的建立
仪器根据赋值和Ct值自动生成标准曲线(见图1和2)：y＝58.716‐3.352lnx(y为Ct值，x为大肠杆菌噬菌体MS2浓度(pfu/mL))，R2＝0.982，扩增效率为98.74％。
3、病毒回收效率测定
根据建立的大肠杆菌噬菌体MS2标准曲线，可以计算出回收的大肠杆菌噬菌体MS2的浓度，从而计算出病毒提取的回收率，大肠杆菌噬菌体MS2的回收率从1.62％‐11.09％(图3和表1)，满足实时荧光定量RT‐PCR的检测要求。
表1大肠杆菌噬菌体MS2提取效率测定
序号 Ct值 回收值 回收上清液体积V1(mL) 回收率
1 34.76 1.40×107 1.7 1.90％
2 34.46 1.72×107 1.6 2.21％
3 34.36 1.85×107 1.6 2.37％
4 34.81 1.35×107 1.5 1.62％
5 34.90 1.27×107 1.8 1.84％
6 32.12 8.60×107 1.6 11.01％
7 32.28 7.72×107 1.6 9.86％
8 32.59 6.23×107 1.7 8.47％
9 32.28 7.72×107 1.8 11.09％
10 32.24 7.92×107 1.5 9.51％
实施例3：贝类实际样品中诺如病毒的检测
1、贝类中诺如病毒的富集
a、贝类样品须是活的或者冷冻未破坏，泥土等必须去掉，不能重新浸泡在水里。冰上操作，用镊子、手术刀等打开贝类外壳，分离消化腺(digestiveglands)，取10个贝(不足10个全部取样)的样品，用无菌剪刀将内脏团剪碎混合；取混合样2g±0.2g到50mL离心管(或其他无菌离心管)中作为提取RNA的样品，其余-80℃留存。
b、分别加1mL的蛋白酶K工作液和100μL过程控制物质大肠杆菌噬菌体MS2，漩涡混匀。
c、37℃摇床孵育1h，320r/min；60℃水浴15min。
d、4℃，3000×g离心5min，取上清，并记录上清液体积为V1，分装500μL提取RNA，其余上清液-80℃保存留样。
2、病毒RNA提取
3、大肠杆菌噬菌体MS2标准曲线的建立
取制备好的大肠杆菌噬菌体MS2质控样品，稀释至2.5×1010pfu/mL，取100μL进行提取病毒RNA，最终稀释于100μL无RNA酶H2O中；取20μL稀释于180μL无RNA酶H2O，梯度稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍，则病毒浓度分别代表2.5×109、2.5×108、2.5×107、2.5×106、2.5×105、2.5×104pfu/mL，分别进行荧光定量RT-PCR反应，应用Ct值和噬菌体浓度建立回归标准曲线。
4、诺如病毒、大肠杆菌噬菌体MS2检测
诺如病毒、大肠杆菌噬菌体MS2两种目标分别检测，每个检测目标反应体系包括：2×RT-PCRmix12.5μL、样品5μL、水补齐至25μL，每个样品做原倍提取液和10×稀释提取液，同时设置阳性对照和阴性对照。
5、病毒RNA回收率确定
根据MS2荧光定量RT‐PCR反应获得的Ct值和标准曲线回归方程，计算出MS2浓度，除以加样时的病毒浓度，乘以100％即为回收率，通过回收除以0.5，并乘以总检测匀浆体积，来计算提取效率
6、结果判定原则
检测结果判定必须在阳性对照和阴性对照成立的情况下做如下判定：
根据MS2的回收效率判定结果的有效性；若病毒RNA回收率大于或等于1％测试有效，根据检测情况判定甲型肝炎病毒和诺如病毒结果；若病毒RNA回收率小于1％，则需要重新进行检测。
7、样品检测结果
MS2的回收效率皆大于1％，诺如病毒GⅠ和GⅡ的检测结果为阴性(图4-5)。
核苷酸序列表
<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>贝类中诺如病毒检测质控试剂盒和非诊断性检测方法
<160>9
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<221>primer_bind
<222>(1)..(18)
<223>诺如病毒GⅠ检测正向引物
<400>1
CGYTGGATGCGNTTYCAT18
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<221>primer_bind
<222>(1)..(23)
<223>诺如病毒GⅠ检测反向引物
<400>2
CCTTAGACGCCATCATCATTYAC23
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<221>primer_bind
<222>(1)..(20)
<223>诺如病毒GⅠ检测的探针
<400>3
TGGACAGGAGAYCGCRATCT20
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<221>primer_bind
<222>(1)..(26)
<223>诺如病毒GⅡ检测正向引物
<400>4
ATGTTCYGRTGGATGAGRTTCTCWGA26
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<221>primer_bind
<222>(1)..(21)
<223>诺如病毒GⅡ检测反向引物
<400>5
TCGACGCCATCTTCATTCACA21
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<221>primer_bind
<222>(1)..(20)
<223>诺如病毒GⅡ检测探针
<400>6
AGCACGTGGGAGGGCGATCG20
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<221>primer_bind
<222>(1)..(18)
<223>大肠杆菌噬菌体MS2检测正向引物
<400>7
GGCTGCTCGCGGATACCC18
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<221>primer_bind
<222>(1)..(19)
<223>大肠杆菌噬菌体MS2检测反向引物
<400>8
TGAGGGAATGTGGGAACCG19
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<221>primer_bind
<222>(1)..(24)
<223>大肠杆菌噬菌体MS2检测探针
<400>9
ACCTCGGGTTTCCGTCTTGCTCGT24

Claims (3)

1.一种贝类中诺如病毒检测质控试剂盒，其特征在于：试剂盒包括NVGⅠ+GⅡ分型2×RT-PCRmix、MS22×RT-PCRmix、无RNase水、NVGⅠ+GⅡ阳性对照、大肠杆菌噬菌体MS2（2.5×1010pfu/mL）各一管。
2.根据权利要求1所述的贝类中诺如病毒检测质控试剂盒，其特征在于，NVGⅠ+GⅡ分型2×RT-PCRmix、MS22×RT-PCRmix中涉及的检测引物和探针如下：
（1）诺如病毒检测引物和探针
诺如病毒GⅠ：
正向引物NVG1-F：5’-CGYTGGATGCGNTTYCAT-3’
反向引物NVG1-R：5’-CCTTAGACGCCATCATCATTYAC-3’
探针NVG1-P：5’-Cy5-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-BHQ-3’
诺如病毒GⅡ：
正向引物NVG2-F：5’-ATGTTCYGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’
反向引物NVG2-R：5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’
探针NVG2-P：5’-FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-BHQ-3’
（2）大肠杆菌噬菌体MS2检测引物和探针
MS2-TM3-F：5'-GGCTGCTCGCGGATACCC-3
MS2-TM3-R：5'-TGAGGGAATGTGGGAACCG-3
MS2-TM2JOE：5'-JOE-ACCTCGGGTTTCCGTCTTGCTCGT-NFQ-3'。
3.利用上述任一项权利要求所述的试剂盒检测贝类中诺如病毒的非诊断性方法，其特征在于，包括以下步骤：
①贝类中诺如病毒的富集
a、贝类样品是活的或者冷冻未破坏，去掉泥土，冰上操作,用镊子、手术刀打开贝类外壳，分离消化腺，取10个贝（不足10个全部取样）的样品，用无菌剪刀将内脏团剪碎混合；取混合样2g±0.2g到50mL离心管中作为提取RNA的样品，其余-80℃留存；
b、分别加1mL的蛋白酶K工作液和100μL过程控制物质大肠杆菌噬菌体MS2，漩涡混匀；
c、37℃摇床孵育1h，320r/min；60℃水浴15min；
d、4℃，3000×g离心5min，取上清，并记录上清液体积为V1，分装500μL提取RNA，其余上清液-80℃保存留样；
②病毒RNA提取
③大肠杆菌噬菌体MS2标准曲线的建立
取制备好的大肠杆菌噬菌体MS2质控样品，稀释至2.5×1010pfu/mL，取100μL进行提取病毒RNA，最终稀释于100μL无RNA酶H2O中；取20μL稀释于180μL无RNA酶H2O，梯度稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍，则病毒浓度分别代表2.5×109、2.5×108、2.5×107、2.5×106、2.5×105、2.5×104pfu/mL，分别进行荧光定量RT-PCR反应，应用Ct值和噬菌体浓度建立回归标准曲线；
④诺如病毒、大肠杆菌噬菌体MS2检测
将步骤②提取的RNA分别取5μL，按照诺如病毒、大肠杆菌噬菌体MS2两种目标分别检测，每个检测目标反应体系包括：2×RT-PCRmix12.5μL、样品5μL、水补齐至25μL，每个样品做原倍提取液和10×稀释提取液，同时设置阳性对照和阴性对照；
⑤病毒RNA回收率确定
根据MS2荧光定量RT-PCR反应获得的Ct值和标准曲线回归方程，计算出MS2浓度，除以加样时的病毒浓度，乘以100%即为回收率，通过回收除以0.5，并乘以总检测匀浆体积，来计算提取效率
回收率（%）=
⑥结果判定
检测结果判定必须在阳性对照和阴性对照成立的情况下做如下判定：
根据MS2的回收效率判定结果的有效性；若病毒RNA回收率大于或等于1%测试有效，根据检测情况判定诺如病毒结果；若病毒RNA回收率小于1%，则需要重新进行检测。
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