CN105176991A

CN105176991A - 焦磷酸测序法检测cyp3a5基因分型的引物对及试剂盒

Info

Publication number: CN105176991A
Application number: CN201510675438.4A
Authority: CN
Inventors: 滕祥云; 陈艳
Original assignee: CHANGSHA 3G BIOTECH CO LTD
Current assignee: CHANGSHA 3G BIOTECH CO LTD
Priority date: 2015-05-14
Filing date: 2015-10-18
Publication date: 2015-12-23

Abstract

本发明涉及一种焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的引物对及试剂盒，属于体外核酸检测技术领域。所述引物对包括正向扩增引物、反向扩增引物及测序引物，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记；所述试剂盒包括正向扩增引物、含有反向扩增引物的PCR反应液、测序引物、尿嘧啶DNA糖基化酶及Taq聚合酶。本发明提供的所述试剂盒具有检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单并能有效满足临床检验要求的优点；此外，还具有可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高的优点。

Description

焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的引物对及试剂盒

技术领域

本发明涉及体外核酸检测技术领域，尤其涉及一种焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的引物对及试剂盒。

背景技术

CYP3A是CYP超家族中在肝脏和肠道表达最为丰富的酶，可占到整个CYP酶系的30％-70％。CYP3A广泛分布于人体胃肠道、胎盘、子宫、肾等组织中。在人体内的CYP3A有CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7及CYP3A3共4种亚型。CYP3A的四个成员串联排列在7q22.1上长约231kb的基因座内。其各成员在发育模式、分布特征、含量及活性等方面有所不同。但氨基酸序列相似度高达75％-88％，而且在底物谱、催化反应及转录调控等方面相互重叠。CYP3A5只在10％-20％的成人中存在，细胞色素P450酶系3A亚家族参与约60％的处方药物代谢，而其主要成员CYP3A4和CYP3A5则共同参与约50％的临床用药的代谢。

CYP3A5位于人类7号染色体q21.1-22.1，基因全长为31.8kb，有13个外显子，编码502个氨基酸，它的表达及活性有着很大的个体和种族差异，在成年人中，只有约10％-20％的少数人表达较多的CYP3A5，在这些人群中，CYP3A5可占肝脏总CYP3A酶含量的50％以上，因此CYP3A5的表达是决定个体间药物疗效和个体间药物毒性差异的最重要因素。

CYP3A5活性的差异主要由单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)造成。迄今为止，已从人群中筛查出26个CYP3A5基因变异，多数频率较低，且无显著的功能改变。其中，最为重要的是3号内含子的由腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)的单碱基突变(CYP3A5*3)。CYP3A5*3产生数种剪接变异体mRNA，使终止密码子提前，导致CYP3A5缺乏。CYP3A5*3/*3基因型(GG基因型)不表达CYP3A5，只有CYP3A5*1/*3基因型(AG基因型)或CYP3A5*1/*1基因型(AA基因型)才能产生高水平mRNA，进而表达CYP3A5。即，只有至少含有一个CYP3A5*1时才能表达高水平CYP3A5。

CYP3A5*3是中国人群最常见的SNP，在中国汉族、维吾尔族及哈萨克族的发生频率分别为72.7％，84.8％和86.6％，而高加索人群为91.7％。

CYP3A5活性的改变可以改变以其为底物的药物的药代动力学。近年来，关于CYP3A5*3(6986A/G)多态性和药物血药浓度、疗效的相关性研究成为热点。研究发现，服用西罗莫司的肾移植患者中，基因型为CYP3A5*1/*1或CYP3A5*1/*3的患者需要更大的日剂量才能达到和基因型为CYP3A5*3/*3的患者一样的西罗莫司稳态血药浓度。研究报道，携带CYP3A5*1的患者较CYP3A5*3纯合子患者有更高的他克莫司清除率。此外，国内最近一项研究表明，与携带CYP3A5*1等位基因AA患者相比，CYP3A5*3/*3基因型患者口服较低剂量环孢菌素A就能达到相当的服药后2h血药浓度水平。以往的研究还证明，CYP3A5的基因型对氨氯地平、沙奎那韦、阿普***的代谢有影响；但同为CYP3A底物的咪达***、硝苯地平、地尔硫卓、氯吡格雷的代谢不受CYP3A5基因型的影响。

CYP3A5*3多态性是唯一对肾移植受体他克莫司(FK506)起始用量具有明确指导意义的基因多态性。体外研究显示，在他克莫司代谢过程中，CYP3A5是较CYP3A4更为有效的酶，对他克莫司代谢的贡献率达60％，催化效率是CYP3A4的1.64倍。以CYP3A5基因型作为免疫抑制剂个体化治疗的依据，有助于确定他克莫司用药的初始剂量，变被动的监测为主动的预测，能有效降低移植术后急性排斥反应(AR)的发生率和药物的毒性及不良反应，进一步提高移植器官的存活率。

综上所述，对患者进行CYP3A5基因分型检测，具有极其重要的临床意义。检测CYP3A5酶对药物代谢速率的快、慢，合理调整药物剂量，提高临床治疗中药物疗效及降低毒副反应发生概率；指导临床正确使用环孢霉素及他克莫司等药物，减少用药无效的情况。

焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序方法(即，确定DNA中核苷酸的顺序)，属于新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分析的能力，并具有高通量、特异性高、快速、直观及低成本的优点。其基本原理为，由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)，PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分析岀峰值的情况，达到测定DNA序列的目的。不过，现有技术中还没有利用焦磷酸测序技术检测CYP3A5基因分型的产品。

目前，现有技术中，主要采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、手工或自动测序及序列特异性引物PCR等方法检测CYP3A5基因分型，这些方法存在检测结果准确性不高、检测周期长及操作繁琐的缺点，难以满足临床检验的标准要求。

发明内容

为了解决上述方法检测CYP3A5基因分型过程中存在检测结果准确性不高、检测周期长、操作繁琐及难以满足临床检验要求的技术问题，本发明提供一种检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单并有效满足临床检验要求的焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的引物对及试剂盒。

本发明提供了一种焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的引物对，所述CYP3A5基因检测的多态性位点为CYP3A5*3，所述引物对包括：

正向扩增引物：5’-AGCTTAACGAATGCTCTACTGTCA-3’(SEQIDNO.1)；

反向扩增引物：5’-CAGGAAGCCAGACTTTGATCATT-3’(SEQIDNO.2)；

测序引物：5’-CCAAACAGGGAAGAGATA-3’(SEQIDNO.3)；

其中，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记。

本发明还提供了一种焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的试剂盒，所述CYP3A5基因检测的多态性位点为CYP3A5*3，所述试剂盒包括：

正向扩增引物：5’-AGCTTAACGAATGCTCTACTGTCA-3’(SEQIDNO.1)；

PCR反应液，所述PCR反应液含有反向扩增引物：5’-CAGGAAGCCAGACTTTGATCATT-3’(SEQIDNO.2)；

测序引物：5’-CCAAACAGGGAAGAGATA-3’(SEQIDNO.3)；

其中，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记。

在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：

CYP3A5*3阳性对照品1，其为插有SEQIDNO.5所示核苷酸序列的CYP3A5*3野生纯合子质粒；

CYP3A5*3阳性对照品2，其为所述CYP3A5*3野生纯合子质粒与插有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的CYP3A5*3突变纯合子质粒组成的质粒混合物；

CYP3A5*3阳性对照品3，其为插有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的CYP3A5*3突变纯合子质粒；

其中，质粒载体为pMD18-T质粒；所述CYP3A5*3阳性对照品2中所述CYP3A5*3野生纯合子质粒和所述CYP3A5*3突变纯合子质粒的数量比为1:1。

在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：质控品(controloligo)和空白对照品，所述质控品的序列为：TAYGGTTTGCA(SEQIDNO.4)；所述空白对照品为水；质控品的序列是由QIAGEN设计合成的一段寡聚核苷酸链，用于检测PyroMarkQ24测序仪的各项性能指标。

所述PCR反应液还含有其他组份，分别为常规的10×PCRBuffer、dNTPs和H₂O，各组份按常规体积比配置(10×PCRBuffer、dNTPs、H₂O及PCR反应液中反向扩增引物的体积比为5：3：37.5：1)。

所述试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂，如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶组成的酶混合物，由5'-磷酰硫酸和荧光素组成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。

本发明还提供了如上所述的引物对在制备用于检测CYP3A5基因分型的试剂中的应用。

本发明还提供了如上所述的试剂盒在制备用于检测CYP3A5基因分型的试剂中的应用。

相较于现有技术，本发明提供的焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的引物对及试剂盒具有以下有益效果：

一、通过利用焦磷酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测CYP3A5*3基因分型时，具有定性准确，灵敏度高及特异性强的优点；此外，还具有样品处理简单、测序步骤简单、测序速度快、半个小时完成一次上机反应、直接给出检测位点频率分析及结果直观的优点；

二、通过利用焦磷酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测CYP3A5*3基因分型时，可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序、操作简便及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高，更适合用于临床检验的要求；

三、通过在所述试剂盒中设置了空白对照品、阳性对照品和质控品，使得所述试剂盒在检测CYP3A5*3基因分型时，可以更好地确保检测结果的准确性。

附图说明

图1为临床样品CYP3A5*3野生型的焦磷酸测序图；

图2为临床样品CYP3A5*3突变杂合型的焦磷酸测序图；

图3为临床样品CYP3A5*3突变纯合型的焦磷酸测序图；

图4为临床质控品controloligo的焦磷酸测序图；

图5为临床空白对照品的焦磷酸测序图；

图6至图8为多组设计引物的焦磷酸测序图；其中图6及图7的测序结果均不准确，只有图8的测序结果真实可靠。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：试剂盒的制备

一、引物和探针的设计与合成

研究表明针对人CYP3A5基因检测的多态性位点CYP3A5*3，选择特异的突变位点，使用PyroMarkAssayDesign2.0软件，设计引物；其中正向扩增引物、反向扩增引物和测序引物先经过PAGE纯化，再经HPLC纯化，其中SEQIDNO.1的5’为生物素标记。

表1.突变位点与类型：

Mutation	Base change
		CYP3A5*3	TCTTTTGTCTTTCA[A/G]TATCTCTTCCCTG

扩增序列如表2：

表2.特异性扩增引物及引物序列

二、对照品选择

使用人工合成的一段寡聚核苷酸链TAYGGTTTGCAcontrololigo为质控品；DNase/RNase-free水为空白对照品。

三、PCR反应液组成

表3.PCR反应液组成

原料名称	体积(μL)
		10×PCR Buffer	5
dNTP	3
		CYP3A5*3反向扩增引物	1
H₂O	37.5
		总体积	46.5μL

实施例2：试剂盒的使用

一、样品检测

溶解引物干粉(引物溶解后有效期为1个月)。按照模板数配制体系：取PCR反应液，加入溶好的引物、尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶，分装体系，加入样品DNA、空白对照品或阳性对照品为模板，组成PCR反应体系。按照PCR反应程序进行PCR扩增。

CYP3A5*3体系各主要成分如下：

表4.CYP3A5*3体系各主要成分

该体系反应程序如下：

表5.PCR反应程序

扩增完成之后，琼脂糖凝胶检验PCR结果，以进行下一步程序。

二、焦磷酸测序

按照焦磷酸测序标准操作规程进行测序操作，主要步骤为：样品的制备和纯化，然后将纯化后的样品加入含有退火液和测序引物的混合液中上机测序。焦磷酸测序仪试剂仓中加入运行程序相应的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、酶混合物、底物混合物。质控品controloligo(自带测序引物)，最终浓度为0.04μM。

三、结果判断

质控品碱基检出率为100％；空白对照品检出率为0。

四、质控标准

各类对照质控品判断结果如下表：

表6.质控品标准检测结果

	对照品	标准检验结果
			1	质控品	峰高峰型正常、序列准确
2	空白对照品	检出率为0

五、结果报告：

结果如图1、图2及图3所示，样品结果的判断标准如下：

表7.报告样品检测结果

	样品检测结果	报告结果
			1	CYP3A5*3(C≤10％，T≥90％)	野生型
2	CYP3A5*3(40％≤C≤60％，40％≤T≤60％)	突变杂合型
			3	CYP3A5*3(C≥90％，T≤10％)	突变纯合型

图1显示的是临床样品检测结果中CYP3A5*3的野生型，图2显示的是临床样品检测结果中CYP3A5*3的突变杂合型，图3显示的是临床样品检测结果中CYP3A5*3的突变纯合型；图4及图5分别显示的是临床检测结果中的质控品controloligo和空白对照品的焦磷酸测序图，图6至图8显示的是设计的多组引物的焦磷酸测序效果图，其中图8的引物为最佳(CYP3A5*3，G＝55％，A＝45％)，是我们产品中选定的引物。

本发明提供的焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的引物对及试剂盒具有以下有益效果：

三、通过在所述试剂盒中设置了空白对照品、阳性对照品和质控品，使得所述试剂盒在检测CYP3A5*3基因分型时，可以更好的确保检测结果的准确性。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCELISTING

<110>长沙三济生物科技有限公司

<120>焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的引物对及试剂盒

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Claims

1.一种焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的引物对，其特征在于，所述CYP3A5基因检测的多态性位点为CYP3A5*3，所述引物对包括：

正向扩增引物：5’-AGCTTAACGAATGCTCTACTGTCA-3’；

反向扩增引物：5’-CAGGAAGCCAGACTTTGATCATT-3’；

测序引物：5’-CCAAACAGGGAAGAGATA-3’；

其中，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记。

2.一种焦磷酸测序法检测CYP3A5基因分型的试剂盒，其特征在于，所述CYP3A5基因检测的多态性位点为CYP3A5*3，所述试剂盒包括：

正向扩增引物：5’-AGCTTAACGAATGCTCTACTGTCA-3’；

PCR反应液，所述PCR反应液含有反向扩增引物：5’-CAGGAAGCCAGACTTTGATCATT-3’；

测序引物：5’-CCAAACAGGGAAGAGATA-3’；

其中，所述正向扩增引物的5’端进行生物素标记。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：

其中，质粒载体为pMD18-T质粒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述CYP3A5*3阳性对照品2中所述CYP3A5*3野生纯合子质粒和所述CYP3A5*3突变纯合子质粒的数量比为1:1。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：质控品和空白对照品，所述质控品的序列为：TAYGGTTTGCA。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述空白对照品为水。

7.权利要求1所述的引物对在制备用于检测CYP3A5基因分型的试剂中的应用。

8.权利要求2所述的试剂盒在制备用于检测CYP3A5基因分型的试剂中的应用。