CN105176983A - 一种用于检测食管鳞癌相关血清miRNAs基因的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测食管鳞癌相关血清miRNAs基因的试剂盒，属于分子生物学技术领域。本发明的技术方案要点为：一种用于检测食管鳞癌相关血清miRNAs基因的试剂盒，包含有用于诊断食管鳞癌相关血清miRNAs基因的茎环引物与RNase-free水配制的检测试剂。本发明还公开了该用于检测食管鳞癌相关血清miRNAs基因的试剂盒的使用方法。本发明直接采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）技术对血清中多种与食管鳞癌相关血清miRNAs基因进行检测，可通过该方法实现微创早期食管鳞癌的诊断、大规模筛查和预后评估。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于检测食管鳞癌相关血清miRNAs基因的试剂盒。
背景技术
MicroRNAs（miRNAs）是一类在序列上高度保守的内源性非编码单链小RNA，长约19-25nt（FinneganEF等，MicroRNAbiogenesis:regulatingtheregulators.CritRevBiochemMolBiol,2013,48(1):51-68）。miRNAs在许多基因的转录后调控中发挥重要的作用。每一个miRNA可以识别数百个靶基因的mRNAs，单个miRNA的失调可以影响整个基因网络。miRNAs基因总数远少于mRNAs，是易于筛选和验证的生物标志物（LuJ等，MicroRNAexpressionprofilesclassifyhumancancers.Nature,2005,435(7043):834-838）。不同的癌症类型具有特异miRNAs表达谱。此外，在癌症的发生、发展、转移和治疗中miRNAs异常变化可以阐明癌症的演变机理。因此，越来越多的研究人员正在将研究重点转向miRNA和肿瘤之间的关系上。
在世界范围内，食管癌的死亡率高居癌症死亡率的第六位，而男性的发病率是女性的3-4倍（JemalA等，Globalcancerstatistics.CaCancerJClin,2011,61(2):69-90）。食管鳞癌（Esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC）发生在食管中部或上部1/3，是亚洲食管癌的主要病理亚型，约占食管癌的90%以上（SongYM等，Identificationofgenomicalterationsinoesophagealsquamouscellcancer.Nature,2014,509(7498):91-95）。由于我国地处“食管癌带”，食管鳞癌的发病率和死亡率均居世界首位。在临床上，食管鳞癌的早期诊治可以显著地改善病人的预后并降低死亡率，但目前尚缺乏食管鳞癌特异性的生物标志物及有效的微创早期诊断方法。故食管鳞癌患者在确诊时已有50%以上为中晚期（ZhangC等，CytoplasmicexpressionoftheELAV-likeproteinHuRasapotentialprognosticmarkerinesophagealsquamouscellcarcinoma.TumorBiol,2014,35(1):73-80），其5年生存率在***无转移时为20%-30%，而有***转移时为13%。尽管传统的血清肿瘤标志物，如癌胚抗原、鳞状细胞癌抗原已经被用来早期诊断和检测某些肿瘤的动态变化，但这些血清肿瘤标志物与食管鳞癌之间缺乏足够的灵敏度和特异性。因此，寻找敏感、特异的食管鳞癌早期检测的生物标志物既是降低发病率和死亡率的迫切需求，也成为当前研究的一个活跃领域。
由于血清miRNA容易获得，是一个相对无创的采样方式，同时由于血清miRNA非常稳定，重现性好，可以抵抗RNaseA的消化和苛刻的环境（如反复冻融、长时间室温放置、过酸过碱、极端pH等）（ChenX等，CharacterizationofmicroRNAsinserum:anovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases.CellRes,2008,18(10):997-1006），所以自2008年首次报道循环miRNA可作为潜在的肿瘤诊断工具后，关于血清miRNAs作为诊断、预后和早期预测人类疾病的科学文献呈现指数增长（JarryJ等，ThevalidityofcirculatingmicroRNAsinoncology:fiveyearsofchallengesandcontradictions.MolOncol,2014,8(4):819-829）。其中一些研究发现，血清miRNAs含量具有肿瘤特异性改变，说明血清miRNAs具有作为癌症生物标志物的潜能（KomatsuS等，CirculatingmiR-18a:asensitivecancerscreeningbiomarkerinhumancancer.InVivo,2014,28(3):293-297）。血清miRNA既可来自癌组织，也可来自正常组织。在血清中miRNA与蛋白质、脂类、外分泌体等形成复合物，从而保持较高的稳定性。有些来自正常组织的血清miRNA可以作用于肿瘤细胞，补充癌细胞内下降的miRNA。一旦这种作用不能发挥，肿瘤细胞将进入转移阶段。因此，血清miRNA的高低可以反映肿瘤发展的动力学变化，对肿瘤的诊断治疗和预后提供生物标志物。
随着血清miRNA研究的深入，其作为一种疾病特别是肿瘤微创早期诊断方法也日益受到人们的青睐。有研究表明，血清miRNA与食管鳞癌的发生发展关系非常密切，可能成为食管鳞癌诊断和预后的生物标志物。最近的研究表明，血清miRNAs与食管鳞癌诊断和预后相关，这表明它们也可作为诊断和预后分类的潜在标志物，有助于在食管鳞癌早期筛选出适当的治疗方法。张春妮课题组以miR-25、miR-100、miR-193-3p、miR-194、miR-223、miR-337-5p、miR-483-5p为一组，在111例ESCC病人和111例正常人中检测它们的含量变化（ZhangCN等，ExpressionprofileofmicroRNAsinserum:afingerprintforesophagealsquamouscellcarcinoma.ClinChem,2010,56(12):1871-1879）和以miR-22、miR-100、miR-10a、miR-148b、miR-223、miR-133a、miR-127-3p为另一组，在290例ESCC病人和140例正常人中检测它们的含量变化（WuCY等，DiagnosticandprognosticimplicationsofaserummiRNApanelinoesophagealsquamouscellcarcinoma.PlosOne,2014,9(3):e92292），结果发现这些血清miRNAs在ESCC病人中含量均显著高于正常人，而在其他肿瘤中无此变化，从而提出这两种组合可作为食管鳞癌的诊断标志物。此外，许多研究对血清miRNAs受试者工作特征曲线（Receiveroperatingcharacteris-ticcurve,ROC）进行分析，并计算ROC曲线下面积（Areaundercurve,AUC）来评估候选的血清/血浆miRNAs对食管鳞癌的预测能力。AUC越接近1，准确性越高，相关文献中AUC大多数都显示较高的准确性（ZouKH等，Receiver-operatingcharacteristicanalysisforevaluatingdiagnostictestsandpredictivemodels.Circulation,2007,115(5):654-657）。
一种血清miRNA作为肿瘤诊断标志物往往特异性较低，若测定多种miRNAs组合和miRNA表达谱可提高诊断的准确性，但是后者测定费时且费用较高，影响其广泛应用。因此，选择适当的miRNA测定其比率变化则可以用较少的测定获得较高的准确性。Komatsu等研究结果显示，用血浆中miR-21和miR-375含量的比率变化作观测指标，可以改善血浆的miRNA用作诊断的生物标志物的灵敏度和特异性。相对单个miRNA的AUC，miR-21和miR-375含量比率的AUC值为0.816。在血浆中，miR-21和miR-375含量的比率可以区分健康人和食管癌患者，具有88%的敏感性和70%的特异性（KomatsuS等，CirculatingmicroRNAsinplasmaofpatientswithoesophagealsquamouscellcarcinoma.BrJCancer,2011,105(1):104-111）。Wang等用Meta-analysis方法进行分析后认为：食管鳞癌血清miRNAs可以作为一种新的微创、具有优越诊断特性的生物标志物。相比于唾液miRNAs，血浆/血清miRNAs具有更好的诊断特性（WangYY等，IdentificationofmicroRNAsasnovelbiomarkersfordetectingesophagealsquamouscellcarcinomainAsians:ameta-analysis.TumorBiol,2014,35(11):11596-11604）。
血清miRNAs的主要检测方法有：芯片技术、qPCR、Northern杂交、原位杂交、高通量测序等。当用低密度、Solexa、美国昂飞、安捷伦、Toray3D-GenemicroRNA高通量检测食管鳞癌的血清/血浆miRNA表达谱时，所检测到的miRNAs的差异数量从11-219个不等，而且重复率极低。不同实验室用相同的芯片技术或同一实验室用不同的芯片技术检测时，miRNAs表达差异数量不大，但种类差异较大。而最常用的检测方法是qPCR检测。虽然大多数课题组选择使用TaqMan探针检测血清miRNA的表达水平，但无可争议的事实是探针价格昂贵，单个miRNA的探针价格为1000元（150uL）只能检测40多个样本，因此，需要寻找经济、高效和特异的方法检测食管鳞癌相关的血清miRNAs，为相应的与食管鳞癌相关miRNAs的表达情况的检测以及食管鳞癌的检测提供有效途径，将有助于食管鳞癌的早期筛查与诊断。
综上所述，本领域采用茎环引物qPCR技术检测血清中食管鳞癌的基因标志物miRNAs基因很少，因此可开发该技术应用于食管鳞癌的早期诊断中。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种用于检测食管鳞癌相关血清miRNAs基因的试剂盒。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种用于检测食管鳞癌相关血清miRNAs基因的试剂盒，其特征在于包含有用于诊断食管鳞癌相关血清miRNAs基因的茎环引物与RNase-free水配制的检测试剂，其中食管鳞癌相关血清miRNAs基因是hsa-miR-10a-5p基因、hsa-miR-16-5p基因、hsa-miR-18a-5p基因、hsa-miR-21-5p基因、hsa-miR-22-3p基因、hsa-miR-25-3p基因、hsa-miR-31-5p基因、hsa-miR-100-5p基因、hsa-miR-107基因、hsa-miR-127-3p基因、hsa-miR-129-5p基因、hsa-miR-148b-3p基因、hsa-miR-155-5p基因、hsa-miR-194-5p基因、hsa-miR-200c-3p基因、hsa-miR-223-3p基因、hsa-miR-337-5p基因、hsa-miR-375基因、hsa-miR-483-5p基因、hsa-miR-548k基因、hsa-miR-1246基因或hsa-miR-1322基因，用于诊断食管鳞癌相关血清miRNAs基因的茎环引物为以下22种茎环引物中的至少一种：
（1）针对hsa-miR-10a-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCACAAA-3’；
（2）针对hsa-miR-16-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCGCCAAT-3’；
（3）针对hsa-miR-18a-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCTATCT-3’；
（4）针对hsa-miR-21-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCAACA-3’；
（5）针对hsa-miR-22-3p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACACAGTT-3’；
（6）针对hsa-miR-25-3p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCAGAC-3’；
（7）针对hsa-miR-31-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAGCTAT-3’；
（8）针对hsa-miR-100-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCACAAG-3’；
（9）针对hsa-miR-107基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTGATAG-3’；
（10）针对hsa-miR-127-3p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAGCCAA-3’；
（11）针对hsa-miR-129-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACGCAAGC-3’；
（12）针对hsa-miR-148b-3p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACACAAAG-3’；
（13）针对hsa-miR-155-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACACCCCT-3’；
（14）针对hsa-miR-194-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.14所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCCACA-3’；
（15）针对hsa-miR-200c-3p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示的茎环引物；
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCCATC-3’；
（16）针对hsa-miR-223-3p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTGGGGT-3’；
（17）针对hsa-miR-337-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAACTCC-3’；
（18）针对hsa-miR-375基因的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCACGC-3’；
（19）针对hsa-miR-483-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.19所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCTCCCT-3’；
（20）针对hsa-miR-548k基因的核苷酸序列如SEQIDNO.20所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAGCAAA-3’；
（21）针对hsa-miR-1246基因的核苷酸序列如SEQIDNO.21所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCCTGCT-3’；
（22）针对hsa-miR-1322基因的核苷酸序列如SEQIDNO.22所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCAGCAT-3’。
进一步限定，所述的hsa-miR-10a-5p基因、hsa-miR-18a-5p基因、hsa-miR-21-5p基因、hsa-miR-22-3p基因、hsa-miR-25-3p基因、hsa-miR-31-5p基因、hsa-miR-100-5p基因、hsa-miR-127-3p基因、hsa-miR-148b-3p基因、hsa-miR-194-5p基因、hsa-miR-200c-3p基因、hsa-miR-223-3p基因、hsa-miR-337-5p基因、hsa-miR-483-5p基因、hsa-miR-548k基因、hsa-miR-1246基因和hsa-miR-1322基因为上调基因，hsa-miR-107基因、hsa-miR-129-5p基因、hsa-miR-155-5p基因和hsa-miR-375基因为下调基因，has-miR-16-5p基因为内参基因。
本发明所述的用于检测食管鳞癌相关血清miRNAs基因的试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）提取待检测血清样本的总RNA，使用微量分光光度计测量RNA的浓度和纯度；
（2）用待测茎环引物反转录待测样品进行反转录，反转录体系为20μL，将上述混合液于42℃反应50min，70℃加热15min反转录RNA为cDNA；
（3）用正向引物和通用引物添加qPCR体系为15μL；
（4）qPCR反应条件为：预变性阶段，温度为95℃，时间为5min；循环反应阶段，变性温度为95℃，时间为10s，退火温度为60℃，时间为34s，40个循环；溶解曲线阶段，变性温度95℃，时间15s，退火温度60℃，时间60s，变性温度95℃，时间15s。
进一步限定，步骤（1）的具体过程为：将新鲜收集到的血液在37℃恒温水浴锅中温浴20min；室温3000rpm离心5min，取上清，去沉淀；在4℃、12000rpm离心10min，去除沉淀，分装上清，存储在-80℃；取出样品，待样品溶解后，于4℃将12000g离心10min，留上清；取100μL血清，加入300μLRNase-free水，涡旋混匀；加入400μLTRIzol，震荡混匀，室温放置5min，于4℃将12000g离心10min，去除沉淀；每1mL的TRIzol试剂加入0.2mL氯仿，涡旋15s，室温放置2-3min，于4℃将12000g离心15min，取上清；每1mLTRIzol试剂加入0.5mL异丙醇，充分混匀，室温放置10min，于4℃将12000g离心15min，去上清；加入1mL体积分数为75%的乙醇，涡旋混匀，于4℃将7500g离心5min，留沉淀，并干燥RNA沉淀；加入20μLRNase-free水溶解RNA，并且在55-60℃温浴15min。
相比于现有的检测方法，本发明具有以下优势：现有技术中，最常采用TaqMan探针qPCR法对食管鳞癌组织的miRNAs进行检测，不可否认的事实是TaqMan探针价格昂贵，增加患者的负担，同时采集样本会对患者造成创伤性，且不能早期诊断，给患者带来痛苦；本试剂盒直接采用茎环引物qPCR法对血清中多种与食管鳞癌相关miRNAs基因进行检测，即可直接经济的检测样本，又可做到微创食管鳞癌早期诊断、大规模筛查和预后评估。由于食管鳞癌患者血清中多种miRNAs存在高表达，可作为其诊断食管鳞癌和预后评估的基因标志物，因此采用本发明的技术方案通过血清对于食管鳞癌相关血清miRNAs基因表达的检测可达到易采集、微创伤和快速经济检测等优点。另外，采用本发明的方案能同时对多种与食管鳞癌相关血清miRNAs基因的表达情况进行检测，技术实践中，如何使多种茎环引物的组合物在qPCR反应中表现出良好的有效性和特异性是一项很大的筛选工程，而本发明的茎环引物组合物中包含多种茎环引物能够高效、特异性明显地与各自针对的目的基因进行特异性结合，并高效、快捷、经济地通过显示出正确的检测结果，大大提高检测效率，降低检测成本，为相应的与食管鳞癌相关血清miRNAs基因的表达情况的检测以及食管鳞癌的检测提供了一种有效途径。
附图说明
图1、2、3是本发明实施例中茎环引物检测19例食管鳞癌患者手术前后血清样品中与食管鳞癌相关miRNAs基因表达的实验结果，图1为食管鳞癌患者手术前后血清中miR-129-5p相对表达，图2为食管鳞癌患者手术前后血清中miR-223-3p相对表达，图3为食管鳞癌患者手术前后血清中miR-483-5p相对表达。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
茎环引物的设计与合成
通过在线数据库miBase（http://www.mirbase.org/）对22种与食管鳞癌相关血清miRNAs基因进行分析，设计50nt左右的茎环引物和16-25nt的定量引物待检测基因，其茎环引物序列如下所示：
（1）针对hsa-miR-10a-5p基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCACAAA-3’（SEQIDNO.1）；
（2）针对hsa-miR-16-5p基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCGCCAAT-3’（SEQIDNO.2）；
（3）针对hsa-miR-18a-5p基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCTATCT-3’（SEQIDNO.3）；
（4）针对hsa-miR-21-5p基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCAACA-3’（SEQIDNO.4）；
（5）针对hsa-miR-22-3p基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACACAGTT-3’（SEQIDNO.5）；
（6）针对hsa-miR-25-3p基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCAGAC-3’（SEQIDNO.6）；
（7）针对hsa-miR-31-5p基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAGCTAT-3’（SEQIDNO.7）；
（8）针对hsa-miR-100-5p基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCACAAG-3’（SEQIDNO.8）；
（9）针对hsa-miR-107基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTGATAG-3’（SEQIDNO.9）；
（10）针对hsa-miR-127-3p基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAGCCAA-3’（SEQIDNO.10）；
（11）针对hsa-miR-129-5p基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACGCAAGC-3’（SEQIDNO.11）；
（12）针对hsa-miR-148b-3p基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACACAAAG-3’（SEQIDNO.12）；
（13）针对hsa-miR-155-5p基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACACCCCT-3’（SEQIDNO.13）；
（14）针对hsa-miR-194-5p基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCCACA-3’（SEQIDNO.14）；
（15）针对hsa-miR-200c-3p基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCCATC-3’（SEQIDNO.15）；
（16）针对hsa-miR-223-3p基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTGGGGT-3’（SEQIDNO.16）；
（17）针对hsa-miR-337-5p基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAACTCC-3’（SEQIDNO.17）；
（18）针对hsa-miR-375基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCACGC-3’（SEQIDNO.18）；
（19）针对hsa-miR-483-5p基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCTCCCT-3’（SEQIDNO.19）；
（20）针对hsa-miR-548k基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAGCAAA-3’（SEQIDNO.20）；
（21）针对hsa-miR-1246基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCCTGCT-3’（SEQIDNO.21）；
（22）针对hsa-miR-1322基因的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCAGCAT-3’（SEQIDNO.22）。
需要说明的食管鳞癌相关血清miRNAs基因是hsa-miR-10a-5p基因、hsa-miR-16-5p基因、hsa-miR-18a-5p基因、hsa-miR-21-5p基因、hsa-miR-22-3p基因、hsa-miR-25-3p基因、hsa-miR-31-5p基因、hsa-miR-100-5p基因、hsa-miR-107基因、hsa-miR-127-3p基因、hsa-miR-129-5p基因、hsa-miR-148b-3p基因、hsa-miR-155-5p基因、hsa-miR-194-5p基因、hsa-miR-200c-3p基因、hsa-miR-223-3p基因、hsa-miR-337-5p基因、hsa-miR-375基因、hsa-miR-483-5p基因、hsa-miR-548k基因、hsa-miR-1246基因或hsa-miR-1322基因。其中hsa-miR-107基因、hsa-miR-129-5p基因、hsa-miR-155-5p基因和hsa-miR-375基因为下调基因，hsa-miR-10a-5p基因、hsa-miR-18a-5p基因、hsa-miR-21-5p基因、hsa-miR-22-3p基因、hsa-miR-25-3p基因、hsa-miR-31-5p基因、hsa-miR-100-5p基因、hsa-miR-127-3p基因、hsa-miR-148b-3p基因、hsa-miR-194-5p基因、hsa-miR-200c-3p基因、hsa-miR-223-3p基因、hsa-miR-337-5p基因、hsa-miR-483-5p基因、hsa-miR-548k基因、hsa-miR-1246基因和hsa-miR-1322基因为上调基因，has-miR-16-5p基因为内参基因。
合成上述设计好的核苷酸序列，茎环引物委托Invitrogen生物公司合成。
实施例2
检测试剂的制备
试剂盒中所用的茎环引物溶解在RNase-free水中配制而成。
实施例3
茎环引物qPCR法检测食管鳞癌患者血清中与食管鳞癌相关的miRNAs基因的表达实验。
按照如下步骤进行试验：
1、将待检测血清样本预处理具体为：将新鲜收集到的血液在37℃恒温水浴锅中温浴20min；室温3000rpm离心5min，取上清，去除沉淀；于4℃、12000rpm离心10min，去除沉淀，分装上清，存储在-80℃；取出样品，待样品溶解后，于4℃将12000g离心10min，留上清；取100μL血清，加入300μLRNase-free水，涡旋混匀；加入400μLTRIzol，震荡混匀，室温放置5min，于4℃将12000g离心10min，去沉淀；每1mL的TRIzol试剂加入0.2mL氯仿，涡旋15s，室温放置2-3min，于4℃将12000g离心15min，取上清；每1mLTRIzol试剂加入0.5mL异丙醇，充分混匀，室温放置10min，于4℃将12000g离心15min，去上清；加入1mL体积分数为75%的乙醇，涡旋混匀，于4℃将7500g离心5min，留沉淀，并干燥RNA沉淀；加入20μLRNase-free水溶解RNA，并且在55-60℃温浴15min。
2、用待测茎环引物对待测样品进行反转录，反应体系为20μL，混匀；将上述混合液于42℃下反应50min，70℃加热15min。
3、qPCR过程具体为：
3.1、用正向引物和通用引物添加qPCR体系为15μL；
3.2、qPCR反应条件为：预变性阶段，温度为95℃，时间为5min；循环反应阶段，变性温度为95℃，时间为10s，退火温度为60℃，时间为34s，40个循环；溶解曲线阶段，变性温度95℃，时间15s，退火温度60℃，时间60s，变性温度95℃，时间15s。
3.3、qPCR结果如图1-3所示。
结果分析：相对于实验组而言，与食管鳞癌相关的血清miRNAs基因在qPCR检测中存在信号，而阴性对照组未能检测出信号。说明本发明方法可用于检测血清中与食管鳞癌相关血清miRNAs基因的表达情况。qPCR实验结果如图1（miR-129-5p）、图2（miR-223-3p）和图3（miR-483-5p）所示，大部分（16/19）食管鳞癌患者手术前血清miR-129-5p的表达量显著低于术后表达量，而血清中miR-223-3p和miR-483-5p的结果与之相反，相对于术前，大部分食管鳞癌患者手术后血清miR-223-3p（18/19）和miR-483-5p（14/19）的表达量显著降低。说明了miR-129-5p为下调基因，miR-223-3p和miR-483-5p为上调基因，以上结果进一步说明，采用茎环引物qPCR检测与食管鳞癌相关的血清miRNAs的方法是可行的，并且更为直接经济，同时可实现微创早期食管鳞癌的诊断、大规模筛查和预后评估。另外，通过测序用于检测与食管鳞癌相关的血清miRNAs基因的方法验证发现，上述实验结果均为准确，足见本发明的试剂盒和方法在检测与食管鳞癌相关的血清miRNAs基因以及食管鳞癌的筛选中的准确性。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
<110>河南师范大学
<120>一种用于检测食管鳞癌相关血清miRNAs基因的试剂盒
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GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCACAAA
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GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCAGCAT
Claims (4)
1.一种用于检测食管鳞癌相关血清miRNAs基因的试剂盒，其特征在于包含有用于诊断食管鳞癌相关血清miRNAs基因的茎环引物与RNase-free水配制的检测试剂，其中食管鳞癌相关血清miRNAs基因是hsa-miR-10a-5p基因、hsa-miR-16-5p基因、hsa-miR-18a-5p基因、hsa-miR-21-5p基因、hsa-miR-22-3p基因、hsa-miR-25-3p基因、hsa-miR-31-5p基因、hsa-miR-100-5p基因、hsa-miR-107基因、hsa-miR-127-3p基因、hsa-miR-129-5p基因、hsa-miR-148b-3p基因、hsa-miR-155-5p基因、hsa-miR-194-5p基因、hsa-miR-200c-3p基因、hsa-miR-223-3p基因、hsa-miR-337-5p基因、hsa-miR-375基因、hsa-miR-483-5p基因、hsa-miR-548k基因、hsa-miR-1246基因或hsa-miR-1322基因，用于诊断食管鳞癌相关血清miRNAs基因的茎环引物为以下22种茎环引物中的至少一种：
（1）针对hsa-miR-10a-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCACAAA-3’；
（2）针对hsa-miR-16-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCGCCAAT-3’；
（3）针对hsa-miR-18a-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCTATCT-3’；
（4）针对hsa-miR-21-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCAACA-3’；
（5）针对hsa-miR-22-3p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACACAGTT-3’；
（6）针对hsa-miR-25-3p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCAGAC-3’；
（7）针对hsa-miR-31-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAGCTAT-3’；
（8）针对hsa-miR-100-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCACAAG-3’；
（9）针对hsa-miR-107基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTGATAG-3’；
（10）针对hsa-miR-127-3p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAGCCAA-3’；
（11）针对hsa-miR-129-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACGCAAGC-3’；
（12）针对hsa-miR-148b-3p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACACAAAG-3’；
（13）针对hsa-miR-155-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACACCCCT-3’；
（14）针对hsa-miR-194-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.14所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCCACA-3’；
（15）针对hsa-miR-200c-3p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示的茎环引物；
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCCATC-3’；
（16）针对hsa-miR-223-3p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTGGGGT-3’；
（17）针对hsa-miR-337-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAACTCC-3’；
（18）针对hsa-miR-375基因的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCACGC-3’；
（19）针对hsa-miR-483-5p基因的核苷酸序列如SEQIDNO.19所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCTCCCT-3’；
（20）针对hsa-miR-548k基因的核苷酸序列如SEQIDNO.20所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAGCAAA-3’；
（21）针对hsa-miR-1246基因的核苷酸序列如SEQIDNO.21所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCCTGCT-3’；
（22）针对hsa-miR-1322基因的核苷酸序列如SEQIDNO.22所示的茎环引物：
5’-GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCAGCAT-3’。
2.根据权利要求1所述的用于检测食管鳞癌相关血清miRNAs基因的试剂盒，其特征在于：所述的hsa-miR-10a-5p基因、hsa-miR-18a-5p基因、hsa-miR-21-5p基因、hsa-miR-22-3p基因、hsa-miR-25-3p基因、hsa-miR-31-5p基因、hsa-miR-100-5p基因、hsa-miR-127-3p基因、hsa-miR-148b-3p基因、hsa-miR-194-5p基因、hsa-miR-200c-3p基因、hsa-miR-223-3p基因、hsa-miR-337-5p基因、hsa-miR-483-5p基因、hsa-miR-548k基因、hsa-miR-1246基因和hsa-miR-1322基因为上调基因，hsa-miR-107基因、hsa-miR-129-5p基因、hsa-miR-155-5p基因和hsa-miR-375基因为下调基因，has-miR-16-5p基因为内参基因。
3.一种权利要求1所述的用于检测食管鳞癌相关血清miRNAs基因的试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）提取待检测血清样本的总RNA，使用微量分光光度计测量RNA的浓度和纯度；
（2）用待测茎环引物对待测样品进行反转录，反转录体系为20μL，将上述混合液于42℃反应50min，70℃加热15min反转录RNA为cDNA；
（3）用正向引物和通用引物添加qPCR体系为15μL；
（4）qPCR反应条件为：预变性阶段，温度为95℃，时间为5min；循环反应阶段，变性温度为95℃，时间为10s，退火温度为60℃，时间为34s，40个循环；溶解曲线阶段，变性温度95℃，时间15s，退火温度60℃，时间60s，变性温度95℃，时间15s。
4.根据权利要求3所述的用于检测食管鳞癌相关血清miRNAs基因的试剂盒的使用方法，其特征在于步骤（1）的具体过程为：将新鲜收集到的血液在37℃恒温水浴锅中温浴20min；室温3000rpm离心5min，取上清，去沉淀；在4℃、12000rpm离心10min，去除沉淀，分装上清，存储在-80℃；取出样品，待样品溶解后，于4℃将12000g离心10min，留上清；取100μL血清，加入300μLRNase-free水，涡旋混匀；加入400μLTRIzol，震荡混匀，室温放置5min，于4℃将12000g离心10min，去除沉淀；每1mL的TRIzol试剂加入0.2mL氯仿，涡旋15s，室温放置2-3min，于4℃将12000g离心15min，取上清；每1mLTRIzol试剂加入0.5mL异丙醇，充分混匀，室温放置10min，于4℃将12000g离心15min，去上清；加入1mL体积分数为75%的乙醇，涡旋混匀，于4℃将7500g离心5min，留沉淀，并干燥RNA沉淀；加入20μLRNase-free水溶解RNA，并且在55-60℃温浴15min。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151223 |